郭建新 孫學平 李平 皇甫赟 張風娟

(河南醫(yī)學高等?？茖W校 1醫(yī)學系，河南 鄭州 451191；2附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科)

帕金森疾病(PD)屬于慢性進展神經(jīng)疾病，65～70歲發(fā)病率為1%，80歲以上發(fā)病率增加3%，嚴重影響老年患者生活質(zhì)量〔1〕。目前治療PD主要采用多巴胺替代治療，臨床效果好，可明顯改善患者臨床癥狀，但長期使用會產(chǎn)生較多副作用，且目前還未找到藥物能夠逆轉(zhuǎn)PD的發(fā)生，因此探究PD的發(fā)生發(fā)展機制對于PD的預防、治療具有一定的積極意義〔2〕。轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1是一種具有免疫抑制和抗炎作用的多效性細胞因子，文獻報道TGF-β1信號系統(tǒng)激活后對中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有保護作用，可抑制小膠質(zhì)細胞活化〔3〕。Liu等〔4〕研究顯示，經(jīng)外源給予TGF-β1預處理對PD大鼠神經(jīng)具有一定的保護作用，然而其具體作用機制目前尚不明確。本研究擬分析TGF-β1治療對PD大鼠神經(jīng)的保護作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SPF清潔級SD大鼠，8周齡，體重200～230 g，購于河南省醫(yī)藥科學研究院，許可證號：SYXK(豫)2016-0008，均在統(tǒng)一環(huán)境喂養(yǎng)，光照、黑暗交替12 h，自由飲水攝食，飼養(yǎng)溫度23～25℃，相對濕度為50%～70%。正常喂養(yǎng)1 w后進行模型制備。

1.2試劑與儀器 6-羥基多巴胺(OHDA)、脂多糖(LPS)、阿普嗎啡購于美國Simga公司；TGF-β1購于美國R&D公司；腫瘤壞死因子(TNF)-α,一氧化氮合酶(iNOS)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒購于北京中杉金橋公司;兔抗鼠絡氨酸羥化酶(TH)單克隆抗體購于美國CST公司；CD11b單抗購于美國SANTA公司；蛋白提取試劑盒購于日本Takara公司；聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)檢測試劑盒購于Sigma公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)垂直電泳儀、蛋白凝膠成像儀均購于美國Bio-rad公司；熒光顯微鏡購于日本OLYMPUS公司。紫外分光光度儀購于Thermo scientific公司。

1.3PD動物模型制備〔5〕大鼠腹腔注射400 mg/kg 10%水合氯醛，取仰臥位，固定于立體定位儀中，參照《大鼠立體定位圖譜》選取右側(cè)腦部黑質(zhì)坐標，A點：硬膜下7.6 mm，中縫右2.4 mm，前鹵后方5.0 mm，B點：中縫右側(cè)1.6 mm，前鹵后方5.6 mm，硬膜下7.8 mm，采用微量注射器在A、B兩點均注射4 μg/μl 6-OHDA 3 μl，注射速率1 μl/min，結(jié)束后留針10 min進行拔針。模型鑒定：腹腔注射0.5 mg/ml阿普嗎啡，10 min后觀察大鼠逆時針旋轉(zhuǎn)次數(shù)，共觀察30 min，旋轉(zhuǎn)次數(shù)≥210次為模型制備成功。共64只大鼠模型制備成功。

1.4動物給藥與分組 將大鼠分為對照(Control)組、PD組、TGF-β1 25 ng/μl組、TGF-β1 50 ng/μl組、TGF-β1 100 ng/μl組各12只。PD組：模型鑒定后經(jīng)右側(cè)紋狀體內(nèi)離體定向注射等量生理鹽水。TGF-β1 治療組：經(jīng)右側(cè)紋狀體內(nèi)離體定向注射25、50、100 ng/μl TGF-β1 5 μl。1次/d，連續(xù)注射1 w。

1.5大鼠行為學評估 觀察大鼠行為改變，并進行阿撲嗎啡(APO)旋轉(zhuǎn)誘導實驗，統(tǒng)計用藥后30 min內(nèi)大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)，計算平均旋轉(zhuǎn)圈數(shù)。

1.6標本采集 各組隨機選取10只大鼠，腹腔注射10%戊巴比妥鈉后固定于試驗臺，斷頭取腦，將大鼠腦組織置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，進行石蠟包埋制備腦組織石蠟切片4 μm。各組隨機選取6只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，打開腹腔采集腹主動脈血3 ml，3 000 r/min離心15 min，保存上層血清。

1.7免疫組化檢測腦組織黑質(zhì)中TH、CD11b表達 石蠟切片脫蠟、脫水、抗原熱修復后，添加3%過氧化氫溶液消除內(nèi)源性過氧化物酶活，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗后，滴加山羊血清封閉，添加TH、CD11b一抗置于4℃冰箱中進行過夜，清洗后添加二抗，PBS溶液清洗后添加辣根過氧化物酶(HRP)標記卵酶鏈白素，加入二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液進行顯色反應，蒸餾水清洗后，蘇木素復染，隨后在乙醇中脫水，滴加二甲苯進行透明處理，用中性樹脂進行封片，置于顯微鏡下進行觀察。每張切片挑選10個黑質(zhì)部清晰視野，計算陽性染色細胞數(shù)比例。

1.8ELISA法檢測T淋巴細胞TNF-α、iNOS水平 按照ELISA試劑盒檢測大鼠血清中TNF-α、iNOS水平。

1.9蛋白免疫印跡(WB) 取出保存組織，添加放射免疫沉淀試驗(RIPA)裂解液，提取組織總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，SDS-PAGE垂直電泳分離目的蛋白，結(jié)束后將蛋白凝膠轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PDVF)膜上,5%脫脂牛奶封閉后添加人白細胞抗原(HLA)-G、β-actin一抗(稀釋倍數(shù)1∶500)4℃孵育過夜，添加HRP標記IgG二抗(稀釋倍數(shù)：1∶5 000)室溫下孵育1 h，以β-actin蛋白表達作為內(nèi)參，采用Image軟件評估蛋白表達。

1.10大鼠小膠質(zhì)細胞培養(yǎng)與活化 參考文獻法培養(yǎng)小膠質(zhì)細胞〔6〕：出生1 d乳鼠處死后獲取大腦皮層，將海馬、血管等去除后，剪碎，加入0.25%胰酶溶液消化后添加胎牛血清(FBS)終止消化，濾膜過濾后離心，添加完全培養(yǎng)液，連續(xù)培養(yǎng)14 d后振蕩培養(yǎng)2 h，收集脫落上清細胞為小膠質(zhì)細胞。經(jīng)流式細胞儀檢測小膠質(zhì)細胞純度比例均達95%以上，符合后續(xù)實驗要求。取初代細胞繼續(xù)培養(yǎng)7 d后添加10 mg/L LPS刺激活化小膠質(zhì)細胞，隨后添加2、5、10 ng/μl TGF-β1同時設置空白組，分為空白組、LPS組、TGF-β1 2 ng/μl組、TGF-β1 5 ng/μl組、TGF-β1 10 ng/μl組。

1.11小膠質(zhì)細胞活性檢測 各組細胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，加入噻唑藍(MTT)孵育4 h，舍棄上清液，添加二甲基亞砜(DMSO)溶液，震蕩后在490 nm下測定細胞培養(yǎng)孔內(nèi)OD值。以未進行處理的細胞作為對照組，細胞活性抑制率=(實驗組OD-空白組OD)/空白組OD×100%。

1.12免疫熒光檢測小膠質(zhì)細胞形態(tài) 各組細胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h，將細胞用CD11b熒光抗體標記，在熒光顯微鏡下檢測細胞形態(tài)變化。

1.13細胞CD11b、TGF-β1、Smad3蛋白表達水平 收集培養(yǎng)后細胞，采用WB法檢測細胞CD11b、TGF-β1、Smad3蛋白表達。

1.14統(tǒng)計學方法 采用SPSS22.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1大鼠行為學評估 在模型制備過程中未出現(xiàn)大鼠死亡，PD組大鼠表現(xiàn)為行動遲緩、活動量少、躬身、豎毛等，TGF-β1各組大鼠活動量有所增加，行動正常，豎毛較少，隨著處理劑量的增加，大鼠恢復較好。與Control組〔(6.24±0.03)圈/min〕相比，PD組APO誘導圈數(shù)〔(10.82±0.49)圈/min〕顯著升高(P<0.05)；與PD組相比，TGF-β1 25、50、100 ng/μl組〔(9.44±0.65)、(8.26±0.51)、(7.03±0.62)圈/min〕顯著降低(P<0.05)。

2.2各組血清中TNF-α、iNOS水平比較 與 Control組相比，PD組血清中TNF-α、iNOS水平顯著升高(P<0.05)；與PD組相比，TGF-β1 25、50、100 ng/μl組顯著降低(P<0.05)，見表1。

表1 各組血清中TNF-α、iNOS水平比較

與Control組比較：1)P<0.05；與PD組比較：2)P<0.05；同表2，表3

2.3黑質(zhì)部神經(jīng)元、小膠質(zhì)細胞數(shù)量 與 Control組相比，PD組黑質(zhì)部神經(jīng)元數(shù)量顯著減少，小膠質(zhì)細胞數(shù)顯著升高(P<0.05)；與PD組相比，TGF-β1 25、50、100 ng/μl組黑質(zhì)部神經(jīng)元數(shù)量顯著升高，小膠質(zhì)細胞數(shù)顯著減少(P<0.05)，見圖1、表2。

圖1 免疫組化法檢測黑質(zhì)部神經(jīng)元及小膠質(zhì)細胞變化(×100)

表2 各組黑質(zhì)區(qū)神經(jīng)元、小膠質(zhì)細胞數(shù)量比較個/視野，n=10)

2.4各組黑質(zhì)區(qū)TGF-β1、Smad3蛋白表達比較 與Control組相比，PD組TGF-β1、Smad3蛋白表達顯著降低(P<0.05)；與PD組相比，TGF-β1 25、50、100 ng/μl組顯著升高(P<0.05)。見圖2、表3。

2.5各組小膠質(zhì)細胞控制率比較 與空白組〔(13.61±0.88)%〕相比，LPS組小膠質(zhì)細胞抑制率〔(1.66±0.08)%〕顯著降低(P<0.05)；與LPS組相比，TGF-β1 2、5、10 ng/μl組〔(3.42±0.83)%、(6.76±1.04)%、(9.44±1.76)%〕顯著升高(P<0.05)。

圖2 黑質(zhì)部組織TGF-β1、Smad3蛋白表達

表3 各組黑質(zhì)區(qū)TGF-β1、Smad3蛋白表達比較

2.6小膠質(zhì)細胞形態(tài)觀察 與空白組相比，LPS組小膠質(zhì)細胞胞體明顯增大，細胞固縮，細胞被激活；TGF-β1 2、5、10 ng/μl組小膠質(zhì)細胞胞體體積明顯減小，胞體突起變細。見圖3。

圖3 熒光顯微鏡觀察小膠質(zhì)細胞形態(tài)變化(×200)

2.7各組細胞CD11b、TGF-β1、Smad3蛋白表達比較 與空白組相比，LPS組細胞TGF-β1、Smad3蛋白表達明顯降低，CD11b蛋白表達顯著升高(P<0.05)。與LPS組相比，TGF-β1 2、5、10 ng/μl組TGF-β1、Smad3蛋白表達明顯升高，CD11b蛋白表達顯著降低(P<0.05)。見圖4、表4。

圖4 細胞CD11b、TGF-β1、Smad3蛋白表達

組別TGF-β1 Smad3CD11b空白組1.04±0.761.22±0.230.24±0.06LPS組0.14±0.031)0.13±0.041)0.89±0.131)TGF-β1 2 ng/μl組0.23±0.042)0.39±0.052)0.74±0.122)TGF-β1 5 ng/μl組0.45±0.052)0.72±0.162)0.61±0.152)TGF-β1 10 ng/μl組0.56±0.072)0.98±0.192)0.36±0.062)

與空白組比較:1)P<0.05；與LPS組比較:2)P<0.05

3 討 論

PD病理特征主要為黑質(zhì)部多巴胺神經(jīng)元丟失、變性，致使紋狀體多巴胺水平降低，患者臨床一般表現(xiàn)為行動緩慢出現(xiàn)靜止性震顫。目前PD動物模型制備主要采用6-OHDA注射一側(cè)紋狀體，經(jīng)神經(jīng)元軸突末梢吸收后，6-OHDA損壞黑質(zhì)部神經(jīng)元，進而模擬早期PD臨床病理表現(xiàn)〔7〕。本研究模型制備與以往PD模型制備結(jié)果相符合〔8〕，提示大鼠PD模型制備成功。TGF-β1是具有多功能生長調(diào)節(jié)蛋白，研究顯示其在神經(jīng)損傷、傷口潰爛修復再生等多病病理過程中發(fā)揮重要調(diào)控功能〔9〕。體外研究顯示神經(jīng)元培養(yǎng)時添加TGF-β1可顯著提高存活率，促進雪旺細胞(SCs)細胞增殖，加速軸突髓鞘形成〔10〕。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中添加TGF-β1可刺激星形膠質(zhì)細胞產(chǎn)生，加速神經(jīng)元生長、分化進程〔11〕。目前關于TGF-β1體內(nèi)作用目前報道較少，本研究通過制備PD模型后給予外源TGF-β1治療，結(jié)果表明TGF-β1對PD大鼠神經(jīng)具有一定的保護作用，但具體作用機制尚不明確。小膠質(zhì)細胞大量分布于腦皮層黑質(zhì)部，研究證實小膠質(zhì)細胞炎癥反應與PD的發(fā)生密切相關〔12〕。Ouchi等〔13〕采用放射性追蹤劑11CPK11195對PD者行正電子發(fā)射計算機斷層掃描(PET)檢查，結(jié)果顯示神經(jīng)元的變性缺失與小膠質(zhì)細胞的激活有關。在腦部受損、出現(xiàn)炎癥反應或受到免疫刺激后，黑質(zhì)部小膠質(zhì)細胞激活后上調(diào)細胞表面標志物，引發(fā)神經(jīng)元缺失〔14〕。以上研究均顯示黑質(zhì)部神經(jīng)元受損過程中，小膠質(zhì)細胞活化發(fā)揮決定性作用。本研究免疫組化結(jié)果表明，外源給予TGF-β1能夠抑制小膠質(zhì)細胞的產(chǎn)生。為進一步探究TGF-β1對小膠質(zhì)細胞活化抑制作用，本研究體外研究結(jié)果推測，TGF-β1能夠抑制PD引發(fā)的小膠質(zhì)細胞激活，進而發(fā)揮其對神經(jīng)系統(tǒng)的保護作用，但對下游炎癥因子是否有影響，目前尚不清楚。

研究顯示，PD神經(jīng)元損傷后可釋放大量細胞壞死物，刺激小膠質(zhì)細胞活化，產(chǎn)生大量環(huán)氧化酶(COX)-2及炎性因子TNF-α，進一步介導細胞毒性激活iNOS合成大量NO損傷神經(jīng)元〔15〕。動物研究顯示，在大鼠小膠質(zhì)細胞培養(yǎng)過程中，LPS激活組細胞上清液中TNF-α、NO水平明顯升高，添加促紅細胞生成素(EPO)后可抑制NO生成，降低炎癥反應〔16〕。本研究結(jié)果提示，TGF-β1可能通過降低TNF-α、iNOS水平，抑制炎癥反應，發(fā)揮神經(jīng)保護作用。近期有研究指出TGF-β1/Smads信號通路可能與PD的發(fā)生有關〔17〕。TGF-β1通過與膜受體結(jié)合后，使受體磷酸化，將信號轉(zhuǎn)入細胞內(nèi)，激活Samd3蛋白磷酸化，隨后與Smad4形成復合物轉(zhuǎn)入細胞核內(nèi)，進而調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄活性。體外研究顯示，TGF-β1/Smad3信號通路參與谷氨酸介導神經(jīng)元損傷〔18〕。Zhang等〔19〕研究顯示，TGF-β1具有神經(jīng)保護功能，體外培養(yǎng)神經(jīng)元或膠質(zhì)細胞時過表達TGF-β1可抵御神經(jīng)損傷，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中研究顯示過表達TGF-β1后可能對抗β淀粉蛋白誘導神經(jīng)變性具有一定的抵御作用。動物研究顯示Smad3基因缺陷型小鼠腦補神經(jīng)前提細胞遷移受到明顯阻礙，且神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異?！?0〕。Wang等〔21〕研究發(fā)現(xiàn)，Smad3基因缺陷型小鼠黑質(zhì)部神經(jīng)元缺失、變性數(shù)量明顯降低。以上研究均提示TGF-β1/Smad3與神經(jīng)損傷關系密切。本研究結(jié)果提示外源TGF-β1可激活TGF-β1/Smad3信號通路進而抑制小膠質(zhì)細胞的活化，發(fā)揮神經(jīng)保護功能。

綜上，外源TGF-β1可能通過介導TGF-β1/Smad3信號通路抑制小膠質(zhì)細胞活化，降低炎癥因子表達，減輕PD大鼠神經(jīng)損傷，保護神經(jīng)功能。