王 海 荊永濤

（河南省周口市第一高級中學(xué) 河南周口 466000）

（上接2019年第8 期第44 頁）

3 現(xiàn)代基因定位——細(xì)胞與分子水平的基因定位

3.1 利用非整倍體進行基因定位

3.1.1 單體定位法 用于將某特定基因定位于某條常染色體上。原理：利用假顯性現(xiàn)象，即由于不存在顯性基因而使隱性基因得以表現(xiàn)的現(xiàn)象。在單體不致死且能產(chǎn)生可育配子的情況下，對某號染色體缺失1 條的單體顯性純合體測交，若子代出現(xiàn)顯性∶隱性=l∶l 的分離比，則基因位于該號染色體上。

任務(wù)6：動物中缺失1 條染色體的個體叫單體（2n－1）。大多數(shù)動物的單體不能存活，但在黑腹果蠅（2n＝8）中，Ⅳ號染色體（點狀染色體）缺失1條也可以存活，且能繁殖后代，可用于進行遺傳學(xué)研究。該果蠅種群中存在正常肢（DD）和短肢（dd）個體，已知短肢基因位于常染色體上，現(xiàn)有多種正常果蠅和Ⅳ號單體果蠅，請設(shè)計實驗以判斷短肢基因是否位于Ⅳ號染色體上。寫出實驗思路和對結(jié)果的預(yù)測與結(jié)論。

問題引領(lǐng)：若讓非單體的短肢果蠅個體與正常肢（純合）Ⅳ號染色體單體果蠅交配，子代表型如何？

思路點撥：遺傳圖解如下：

圖7 果蠅單體定位法

實驗結(jié)果預(yù)測及結(jié)論：若子代中出現(xiàn)正常肢果蠅和短肢果蠅，且比例為1∶1，則說明短肢基因位于Ⅳ號染色體上；若子代全為正常肢，則說明短肢基因不位于Ⅳ號染色體上。

3.1.2 三體定位法 在三體不致死且能產(chǎn)生可育配子的情況下，F(xiàn)1中三體自交后代的分離比為35∶1（非3∶1），測交后代分離比為5∶1（非1∶1）。

任務(wù)7：已知玉米（2n=20）種皮有色A 對無色a 為顯性，籽粒飽滿S 對凹陷s 為顯性?，F(xiàn)有一系列的純合體正常玉米、可育三體玉米、可育單體玉米、突變體無色玉米和突變體凹陷玉米的種子，請設(shè)計實驗探究等位基因A、a 和S、s 在染色體上的位置。

圖8 三體定位法原理

圖9 玉米三體基因定位法

利用單體和三體，都可將基因A 定位在玉米Ⅲ號染色體上。只要具備相應(yīng)于每一染色體的一系列三體或單體品系，便能從雜交子代的突變型和野生型的比例中判斷任何一個突變基因所屬的染色體。小麥?zhǔn)嵌啾扼w植物，多倍體植物增加或減少1 條染色體不會使其生活力受到嚴(yán)重影響，因此容易建立整套三體或單體品系，使基因定位工作得以順利進行。除了小麥等植物以外，該方法也用在酵母菌的遺傳學(xué)研究中。

3.2 細(xì)胞水平的基因定位

3.2.1 體細(xì)胞雜交法基因定位探究情境：體細(xì)胞雜交法

1）體細(xì)胞雜交的概念：也稱細(xì)胞融合（cell infusion），是將來源不同的2 種細(xì)胞融合成1 個新細(xì)胞。新產(chǎn)生的細(xì)胞稱為雜種細(xì)胞（hybrid cell），含不同種雙親的染色體。

2）對象：人的細(xì)胞與鼠類細(xì)胞（大鼠、小鼠、倉鼠）。

3）雜種細(xì)胞的特點：在繁殖傳代過程中，人的染色體優(yōu)先丟失，以至最后只剩幾條或1 條人的染色體，而嚙齒類的染色體被保留下來。

人-鼠雜種細(xì)胞內(nèi)含有完整的小鼠染色體組和1～7 條不等的人染色體，且所含的人染色體類型也不完全相同，因此這種雜種細(xì)胞是進行連鎖分析和基因定位的極好材料。

通過檢驗不同的雜種細(xì)胞系，將某一標(biāo)記基因存在與否，與每一細(xì)胞中人的某一染色體的存在與否相聯(lián)系，即可推知某一基因是否在某號染色體上。通過分析某基因產(chǎn)物與某條人類染色體是否共同存在即可進行基因定位。Miller 等運用體細(xì)胞雜交并結(jié)合雜種細(xì)胞的特征，證明雜種細(xì)胞的存活需要胸苷激酶（TK）。含有人17 號染色體的雜種細(xì)胞都因有TK 活性而存活，反之則死亡，從而推斷TK 基因定位于17 號染色體上，這是首例應(yīng)用體細(xì)胞雜交法進行的基因定位。

肽酶C（peptidase C）是小鼠中沒有的，而人類可以產(chǎn)生此酶，若在雜種細(xì)胞系中除小鼠的全套染色體組外還留有一條人類1 號染色體，同時又測得肽酶C 的活性，即可推斷肽酶C 基因位于人類的1 號染色體上。

任務(wù)8：測定雜種細(xì)胞中標(biāo)記基因與染色體之間的對應(yīng)關(guān)系如表2，確定基因a、b、c、d 在人染色體1、2、3 上的位置。

表2 標(biāo)記基因與染色體之間的對應(yīng)關(guān)系

思路點撥：甲、乙、丙、丁、戊5 個“人-鼠”融合細(xì)胞株，它們分別保留有人染色體1、2、3 中的某一個或幾個，例如細(xì)胞株甲保留染色體2，細(xì)胞株丁保留1、2、3 這3 個染色體等。分別測定a、b、c、d 4 種表型，例如某種酶的活性或某種抗原的存在與否等。已經(jīng)知道這些特性都是小鼠細(xì)胞所沒有的，從表中的結(jié)果可以看到，任何1 個細(xì)胞株只要測得（或不能測得）a 這一性狀時必然同時可以測得（或不能測得）c 這一性狀。通過類比推理，這一結(jié)果說明這2 種酶或抗原蛋白的基因位于同一染色體。其次可以看到任何1 個細(xì)胞株凡是保留染色體2 的必然出現(xiàn)上述性狀，可見上述2 個基因都在人的2 號染色體上。

3.2.2 缺失法基因定位

原理：根據(jù)某一性狀與染色體的結(jié)構(gòu)變化確定。例如人類的貓叫綜合癥，出生的嬰兒為滿月型臉，眼間距寬，哭聲似貓叫。細(xì)胞學(xué)檢查為5 號染色體短臂缺失，因此，相關(guān)基因可定位于5 號染色體上。

3.2.3 性狀與性別聯(lián)系法基因定位

原理：性狀與性別緊密相連，說明基因在性染色體上。有的性狀（例如耳毛）僅僅在男性出現(xiàn)，則基因位于Y 染色體上；有的性狀在男、女中都有，但男多女少（例如色盲基因），則基因位于X染色體上；有的性狀在男、女中比例均等，則基因位于常染色體上。

3.2.4 基因劑量效應(yīng)法基因定位

原理：有的基因多1 份就會多表達1 份。人類的過氧化物歧化酶Ⅰ基因，人類的21 三體中，此酶活性為正常個體的1.5 倍，即此基因位于21 號染色體上。人的紅細(xì)胞酸性磷酸酶Ⅰ基因，當(dāng)2 號染色體短臂缺失時此酶活性下降一倍，即此酶基因位于2 號染色體上。

3.2.5 單元化定位法基因定位 在構(gòu)巢曲霉這一類真菌的準(zhǔn)性生殖過程中，雜合二倍體細(xì)胞在有絲分裂時常隨機地丟失染色體。染色體在多次有絲分裂過程中逐條丟失而使二倍體細(xì)胞最終轉(zhuǎn)變?yōu)閱伪扼w細(xì)胞的過程稱為單元化。如果1 對染色體中帶有顯性的野生型基因的染色體丟失了，則同源染色體上隱性基因的性狀便得以表現(xiàn)。

問題引領(lǐng)：表型除了受基因型控制外，還會受到環(huán)境因素的影響。僅通過觀察雜交后代性狀分離比進行基因定位，并非十分可靠。能否利用分子生物學(xué)技術(shù)直接在染色體上對基因進行精準(zhǔn)定位？

3.3 分子水平的基因定位

3.3.1 原位雜交和熒光原位雜交

思路點撥：可否用分子標(biāo)記DNA 探針，與變性后的染色體或細(xì)胞核靶DNA 雜交，在熒光顯微鏡下直接觀察并記錄結(jié)果。

原位雜交：是最直接的基因定位方法之一，是分子生物學(xué)技術(shù)在基因定位中的應(yīng)用。

原理：堿基互補配對。用放射性或非放射性物質(zhì)標(biāo)記的DNA、RNA 或與mRNA 互補的cDNA 作探針，可檢測細(xì)胞基因組中的同源部分。

原位雜交的特點：雜交在載玻片上的中期染色體上進行，而不是在溶液和膜上進行。原位是指在標(biāo)本上DNA 原位變性，再與放射性或非放射性物質(zhì)（通常用3H）標(biāo)記的已知核酸探針雜交，通過放射自顯影來檢測染色體上特異DNA 順序，用放射性顆粒在某條染色體的區(qū)帶出現(xiàn)的最高頻率或熒光的強度確定探針的位置，從而準(zhǔn)確地進行基因定位。

圖10 原位雜交的步驟

熒光原位雜交：用特殊熒光素標(biāo)記探針DNA或RNA，變性成單鏈后，與變性后的染色體或細(xì)胞核靶DNA 雜交。在熒光顯微鏡下觀察并記錄結(jié)果。

這種方式快速簡捷，但雜交信號較弱，且不能進一步放大；為了使雜交信號足夠強，可以進行信號擴增。擴增的方法是加上一層熒光標(biāo)記的標(biāo)記分子的抗體，再加上一層偶聯(lián)了標(biāo)記分子的抗－抗體，然后再加一層熒光標(biāo)記的標(biāo)記分子的抗體，形成三明治結(jié)構(gòu)。以生物素標(biāo)記為例，在加熒光標(biāo)記的抗生物素蛋白avidin 之后，加一層山羊生物素標(biāo)記抗－抗生物素D，然后再加一層熒光標(biāo)記的抗生物素蛋白。

圖11 熒光原位雜交原理

圖12 熒光原位雜交法將基因定位在某號染色體上

3.3.2 電泳與DNA 分子雜交

探究情境：圖13是甲、乙2 種遺傳病的系譜圖。已知這2 對等位基因分別位于2 對同源染色體上。經(jīng)DNA 分子結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，突變基因（乙病基因）與其等位基因（正?；颍┫啾龋蛔兒笾履诚拗泼傅那懈钗稽c缺失。圖14表示甲、乙、丙3人控制乙種病的等位基因核酸分子雜交診斷結(jié)果示意圖。對Ⅱ3和Ⅲ13進行核酸分子雜交診斷發(fā)現(xiàn)，Ⅱ3電泳結(jié)果與右圖中甲相同，Ⅲ13電泳結(jié)果與右圖中乙相同。

圖13 2 種遺傳病的系譜圖

圖14 核酸分子雜交診斷結(jié)果

任務(wù)9：判斷控制甲、乙2 種病的遺傳方式（即等位基因的位置）。

思路點撥：從圖13中的Ⅱ7、Ⅱ8和Ⅲ11可以看出甲病為常染色體上的顯性遺傳病，從Ⅱ3、Ⅱ4和Ⅲ10只能看出乙病為隱性遺傳病，但無法判斷基因的位置。借助于電泳與DNA 分子雜交技術(shù)能作進一步的判斷。

圖15 凝膠電泳

圖16 電泳結(jié)果解析

思路點撥：DNA 分子帶負(fù)電荷，在電泳液中通電后向陽極遷移，且DNA 分子的結(jié)構(gòu)相同所帶電荷量相同；線性DNA 分子遷移的速率主要與其大小有關(guān)，分子越小遷移率越快。所以電泳圖譜上條帶3 為突變基因，1、2 為酶切后的正?；?。甲體細(xì)胞中含有B 和b2 個基因，乙只有正?；?，丙為患者，只具有突變基因。Ⅱ3（男性）的電泳結(jié)果與甲相同，因為首先乙病不是單純伴Y 遺傳，若基因位于X 上，正常男性體細(xì)胞中只能有基因B 或b 中的一個，顯然Ⅱ3具有B、b2 個基因，說明基因位于常染色體上。

3.3.3 克隆基因定位法

思路點撥：用顯微鏡可以觀察到染色體，但無法看到基因。為了定位人體白蛋白基因，首先以人體白蛋白基因cDNA 為探針，分別與經(jīng)HindⅢ酶切后的人體細(xì)胞和中國倉鼠卵巢細(xì)胞（CHO）DNA雜交，雜交后的人體細(xì)胞DNA 顯示6.8 kb 帶型，CHO 細(xì)胞的DNA 顯示3.5 kb 帶型。進一步分別用HindⅢ酶切各種人-CHO 雜種細(xì)胞系的DNA，再與白蛋白基因cDNA 探針雜交，如果出現(xiàn)6.8 kb和3.5 kb 帶型者稱為陽性雜種細(xì)胞，而只顯示3.5 kb 帶型者為陰性細(xì)胞。由于人體白蛋白基因的cDNA 探針的特異性，6.8 kb 帶型的雜交帶只出現(xiàn)在含有人體4 號染色體的雜種細(xì)胞中，而在不含4 號染色體的雜種細(xì)胞中均不出現(xiàn)，因此可將白蛋白基因定位在4 號染色體上。

圖17 克隆基因定位法

通過對遺傳家系（種群）、細(xì)胞、分子3 個層面上的基因定位的探究學(xué)習(xí)，沿著科學(xué)家的足跡由淺入深地前進，在思維層面經(jīng)歷探究的過程，體現(xiàn)“讓學(xué)生領(lǐng)悟科學(xué)家在研究過程中所持有的觀點以及解決問題的思路和方法”“學(xué)生在親歷提出問題、獲取信息、尋找證據(jù)、檢驗假設(shè)、發(fā)現(xiàn)規(guī)律等過程中習(xí)得生物學(xué)知識，養(yǎng)成科學(xué)思維的習(xí)慣，形成積極的科學(xué)態(tài)度，發(fā)展終身學(xué)習(xí)及創(chuàng)新實踐能力”的課程性質(zhì)。落實“讓學(xué)生積極參與動手和動腦的活動，通過探究性學(xué)習(xí)活動或完成工程學(xué)任務(wù)，加深對生物學(xué)概念的理解，提升應(yīng)用知識的能力，培養(yǎng)創(chuàng)新精神”的課程理念。努力達成“掌握科學(xué)探究的思路和方法”的課程目標(biāo)，促進學(xué)生掌握本學(xué)科關(guān)鍵能力，培養(yǎng)創(chuàng)新型人才。