劉功良，費永濤*，余潔瑜，劉 銳，高蘇娟，白衛(wèi)東

（仲愷農(nóng)業(yè)工程學院輕工食品學院，廣東 廣州 510225）

隨著乙醇濃醪發(fā)酵技術的進步，對以釀酒酵母為主體的代謝過程和基本代謝途徑已有較多報道，但由于它的代謝過程極為復雜，代謝產(chǎn)物較多，對其在高糖環(huán)境下的代謝特性與應答機理尚有待進一步研究。彭酈等[1]研究發(fā)現(xiàn)釀酒酵母AWRI R2在高糖條件下仍可以積累海藻糖，海藻糖積累量是釀酒酵母應對高糖逆境的指標之一，同時溫度會影響海藻糖的產(chǎn)生。此外，Wang Pinmei等[2]研究發(fā)現(xiàn)重組酵母通過積累胞內(nèi)海藻糖的方式保護細胞，通過調(diào)控重組酵母在高滲條件下細胞的完整性、過氧化氫酶和超氧化物歧化酶的酶活性提高酵母在濃醪中的發(fā)酵能力。除海藻糖外，李曉軍等[3]研究指數(shù)生長期的釀酒酵母FCC2146在高滲脅迫下的應激代謝反應，發(fā)現(xiàn)甘油作為釀酒酵母FCC2146的主要相容性溶質(zhì)也是酵母應對高糖逆境的指示物質(zhì)，在300 g/L高糖環(huán)境下，胞外乙醇、甘油、海藻糖分別較對照環(huán)境（糖100 g/L）提高100%、400%和11%。同樣，Abertny等[4]也認為釀酒酵母細胞可以通過主動調(diào)節(jié)甘油的濃度適應高糖環(huán)境。董欣福等[5]發(fā)現(xiàn)釀酒酵母在高糖培養(yǎng)環(huán)境中，有氧呼吸抑制，三羧酸循環(huán)（tricarboxylic acid cycle，TCA）斷裂，導致發(fā)酵初期檸檬酸和蘋果酸分泌到胞外，同時菌體中乳酸也不斷積累，而當糖濃度降低時，TCA循環(huán)重新閉合，檸檬酸、α-酮戊二酸和蘋果酸重新進入細胞參與代謝。酵母不僅可以通過改變代謝流來適應高糖環(huán)境，徐偉等[6]發(fā)現(xiàn)釀酒酵母YMI-37還可以通過改變自身形態(tài)提高細胞質(zhì)濃度來應對高滲環(huán)境。在前期研究中，利用26S rDNA分子鑒定技術將分離自蜂蜜的酵母鑒定為蜂蜜接合酵母，發(fā)現(xiàn)該菌能夠耐受700 g/L高糖質(zhì)量濃度[7]，而目前開展酵母耐受高糖特性研究所用糖質(zhì)量濃度均在300～650 g/L范圍內(nèi)[8]。因此，本研究以已篩選的蜂蜜接合酵母6-7431為實驗菌，研究其高糖脅迫應激代謝特性，為乙醇濃醪發(fā)酵和酵母耐高糖機制研究提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

葡萄酒高活性干酵母SY 湖北安琪酵母有限公司；蜂蜜接合酵母（Zygosaccharomyces mellis）7-7142、7-7352、6-7431、7-7551、7-7651、7-7751，由仲愷農(nóng)業(yè)工程學院輕工食品學院生物工程試驗室分離篩選得到，其中蜂蜜接合酵母6-7431保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC M 2015545。

1.1.2 試劑

半乳糖、阿拉伯糖、麥芽糖、木糖、麥芽三糖、甘油 阿拉丁生化科技股份有限公司；酵母膏、瓊脂、麥芽汁培養(yǎng)基、蛋白胨、酵母提取粉、KH2PO4、MgSO4·7H2O 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；其余為分析純或生化試劑。

1.1.3 培養(yǎng)基

高糖培養(yǎng)基：稱取葡萄糖加入麥芽汁培養(yǎng)基中，溶于去離子水，調(diào)整糖質(zhì)量濃度為300、350、400、450、500、550、600、650、700 g/L和750 g/L，70 ℃水浴搖勻溶解，115 ℃滅菌20 min。其中常規(guī)培養(yǎng)基的含糖質(zhì)量濃度為100 g/L。

糖類發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨2 g/L，NaCl 0.5 g/L，溶于去離子水，121 ℃滅菌15 min。

同化碳源基礎培養(yǎng)基：(NH4)2SO40.5 g/L，KH2PO40.1 g/L，MgSO4·7H2O 0.05 g/L，酵母膏0.02 g/L，瓊脂 2.0 g/L，pH 5～6，115 ℃滅菌15 min，冷卻至70 ℃后，倒平板備用。

同化氮源基礎培養(yǎng)基：葡萄糖2.0 g/L KH2PO40.1 g/L，MgSO4·7H2O 0.05 g/L，酵母膏0.02 g/L，瓊脂2.0 g/L，pH 5～6，115 ℃滅菌15 min，冷卻至70 ℃后，倒平板備用。

完全培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母浸粉10 g/L，瓊脂20 g/L，115 ℃滅菌15 min，冷卻至70 ℃后，倒平板備用。

無維生素生長培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，(NH4)2SO42.0 g/L，MgSO4·7H2O 1.0 g/L，CaCl2·2H2O 0.1 g/L，KH2PO42.5 g/L，NaCl 0.1 g/L，115 ℃滅菌15 min，冷卻至70 ℃后，倒平板備用。

1.2 儀器與設備

Phenom-World飛納臺式掃描電鏡 復納科學儀器上海有限公司；UV-2700紫外-可見分光光度計、LC-20A高效液相色譜儀 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 蜂蜜接合酵母的活化

取出保存在4 ℃冰箱里的酵母菌試管斜面，用接種環(huán)挑取兩環(huán)菌種，接種于100 g/L常規(guī)糖質(zhì)量濃度培養(yǎng)基，在28 ℃條件下恒溫培養(yǎng)48 h。

1.3.2 蜂蜜接合酵母的同化性能鑒定

挑取在低溫試管斜面保藏的菌體，接種到含糖量為70 °Bé的麥芽汁試管斜面，28 ℃培養(yǎng)3～4 d，轉(zhuǎn)接到麥芽汁液體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)至對數(shù)生長期，用無菌水對菌體進行清洗，制備菌懸液。

糖類發(fā)酵實驗：采用杜氏管發(fā)酵法測定6 株菌對糖類物質(zhì)的代謝能力[9]。將菌體重懸液按照5%接種量（V/V，下同）接入糖質(zhì)量濃度為30 °Bé的杜氏小管培養(yǎng)基中，在28 ℃培養(yǎng)3～4 d，觀察6 株蜂蜜接合酵母對葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、半乳糖、乳糖、麥芽糖的發(fā)酵能力。

碳、氮源同化性能鑒定：采用生長譜法[10-11]測定6 株酵母對果糖、木糖、麥芽三糖、阿拉伯糖、半乳糖、麥芽糖、甘油等碳源的同化能力，各種碳源在培養(yǎng)基中質(zhì)量濃度為40 g/L；采用生長譜法鑒定6 株酵母對酵母粉、蛋白胨、尿素、硫酸銨、硝酸鉀、磷酸三銨、乙酸銨等氮源的同化能力，各種氮源在培養(yǎng)基中質(zhì)量濃度為40 g/L。

無維生素培養(yǎng)基上菌種的生長性能鑒定[12]：將6 株酵母的重懸液按照5%接種量接入無維生素培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)3～5 d，每隔24 h觀察培養(yǎng)皿中是否有菌落生長，以完全培養(yǎng)基作對照，設置3 組平行實驗。

1.3.3 高糖脅迫對蜂蜜接合酵母生理形態(tài)的影響

取活化后的蜂蜜接合酵母6-7431，以10%接種量接入高糖質(zhì)量濃度培養(yǎng)基中，28 ℃恒溫培養(yǎng)96 h后，通過電子掃描顯微鏡觀察蜂蜜接合酵母的形態(tài)特征[13-14]。

1.3.4 高糖脅迫對蜂蜜接合酵母應急代謝產(chǎn)物的影響

取活化后的蜂蜜接合酵母6-7431，以10%接種量接入高糖質(zhì)量濃度培養(yǎng)基中，初始pH 6.0，30 ℃發(fā)酵96 h后，用比重法測發(fā)酵液的乙醇體積分數(shù)[15]。采用高效液相色譜法對酵母菌6-7431三羧酸循環(huán)中間代謝產(chǎn)物蘋果酸、α-酮戊二酸、檸檬酸進行分析[16-17]。以峰面積為y，有機酸含量（μg）為x，繪制檢測標準曲線，蘋果酸、α-酮戊二酸、檸檬酸的回歸方程分別為：y=6 718.8x+434.1（R2=1），y=287 820x-39 189（R2=0.999 9），y=46 355x+5 098.5（R2=0.999 8）。此外，用高碘酸鈉-乙酰丙酮法測定酵母細胞中甘油的濃度[18]，采用硫酸蒽酮法測定酵母細胞內(nèi)海藻糖含量[19-20]，每個指標重復檢測3 次。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 17.0和Origin 8.0軟件分別統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)和繪圖?；贒uncan法多重比較檢驗，P＜0.05，差異顯著。

2 結果與分析

2.1 蜂蜜接合酵母的同化性能鑒定

碳源同化性能鑒定結果表明6 株蜂蜜接合酵母都能利用葡萄糖、果糖、麥芽糖，無法利用乳糖、木糖、阿拉伯糖、麥芽三糖，其中菌株6-7431、7-7651、7-7751能利用半乳糖和蔗糖進行糖類發(fā)酵，菌株6-7431、7-7142能利用甘油、半乳糖、麥芽糖等4 種碳源。氮源同化性能鑒定結果顯示6 株菌都能同化蛋白胨和酵母提取粉，但無法同化乙酸銨和磷酸三銨，其中菌株6-7431、7-7751能夠利用硫酸銨作為氮源，7-7352、6-7431、7-7651可以同化尿素。此外，菌株6-7431、7-7551、7-7651都能在無維生素培養(yǎng)基生長。蜂蜜接合酵母6-7431不僅能利用葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、半乳糖、甘油6 種碳源，還能利用尿素、硫酸銨、蛋白胨、酵母提取粉4 種氮源。綜上所述，菌株6-7431利用碳源較廣泛，且無需專門提供維生素，前期研究發(fā)現(xiàn)蜂蜜接合酵母6-7431能夠耐受700 g/L的高糖質(zhì)量濃度[7]，該菌具有很好的應用潛力。因此，選擇對菌株6-7431進行高糖脅迫應激代謝特性的研究。

2.2 高糖環(huán)境對蜂蜜接合酵母6-7431形態(tài)及生殖方式的影響

圖1 不同糖質(zhì)量濃度環(huán)境下蜂蜜接合酵母6-7431的菌體形態(tài)Fig. 1 Morphology of Z. mellis 6-7431 cultured at different sugar concentrations

酵母菌的生殖方式主要以無性繁殖中的芽殖為主，尤其是在良好的營養(yǎng)與生長條件下[21]。由圖1可知，隨著糖質(zhì)量濃度從100 g/L增加到550 g/L，細胞外部的滲透壓變大，蜂蜜接合酵母6-7431細胞的生殖方式基本未發(fā)生變化，一直保持出芽生殖（圖1b～g），同時細胞的形態(tài)未發(fā)生顯著的變化。隨著糖質(zhì)量濃度達到550 g/L時，菌絲內(nèi)胞漿濃縮、胞壁增厚，酵母的出芽生殖已經(jīng)停止，但是菌體完整性較好，仍然具有較好的代謝基質(zhì)及產(chǎn)乙醇的能力；質(zhì)量濃度從600～700 g/L，酵母菌菌體中部開始凹陷，隨著質(zhì)量濃度的增加，凹陷菌體的比例越來越高，但仍然具有一定的代謝活性；當質(zhì)量濃度達到750 g/L，菌體嚴重變形，沒有完整的菌體形態(tài)，代謝能力完全被抑制。高糖環(huán)境對蜂蜜接合酵母6-7431的形態(tài)和生殖具有一定的影響，但該菌株在700 g/L的高糖質(zhì)量濃度下仍能夠保持一定的代謝活性，表明該菌存在應對高滲環(huán)境的生理性防御機制。研究也發(fā)現(xiàn)酵母菌中存在大量應對高糖環(huán)境的保護機制，如高滲壓甘油應答途徑、高滲壓轉(zhuǎn)錄因子等[22-24]。因此，后續(xù)將會對該菌在高糖環(huán)境中生理性防御機制進行探究。

2.3 高糖質(zhì)量濃度對蜂蜜接合酵母6-7431分泌乙醇的影響

表1 葡萄糖質(zhì)量濃度對蜂蜜接合酵母6-7431產(chǎn)乙醇的影響Table 1 Effects of different glucose concentrations on ethanol production of Z. mellis 6-7431

表1顯示，不同糖質(zhì)量濃度下該菌發(fā)酵產(chǎn)生的乙醇體積分數(shù)具有顯著差異（P＜0.05）。糖質(zhì)量濃度100～500 g/L，發(fā)酵液中乙醇體積分數(shù)從7.4%增加10.5%。當糖質(zhì)量濃度為550～750 g/L時，乙醇從9.3%下降到1.6%。糖質(zhì)量濃度在300～600 g/L的乙醇體積分數(shù)都要高于常規(guī)糖質(zhì)量濃度100 g/L。目前開展酵母耐受高糖特性研究所用到的糖質(zhì)量濃度均在300～650 g/L范圍內(nèi)[8]，而酵母6-7431在糖質(zhì)量濃度650～700 g/L環(huán)境下仍然能夠保持菌體的完整并能夠代謝糖分泌乙醇，在乙醇濃醪發(fā)酵中具有潛在的應用價值。

2.4 高糖脅迫對蜂蜜接合酵母積累應急代謝產(chǎn)物的影響

2.4.1 高糖脅迫對蜂蜜接合酵母積累甘油的影響

圖2 初始糖質(zhì)量濃度對蜂蜜接合酵母6-7431積累甘油的影響Fig. 2 Effects of different initial sugar levels on the accumulation of glycerol in Z. mellis 6-7431

在接種量為10%初始pH 6.0、30 ℃條件下發(fā)酵96 h，蜂蜜接合酵母6-7431經(jīng)高糖脅迫積累的總甘油質(zhì)量濃度比常規(guī)培養(yǎng)基（100 g/L）中顯著提高（P＜0.05），其中胞內(nèi)和胞外的甘油質(zhì)量濃度都比常規(guī)培養(yǎng)基中的甘油質(zhì)量濃度高，如圖2所示。當糖質(zhì)量濃度從300 g/L增加到600 g/L時，胞內(nèi)甘油質(zhì)量濃度和總甘油質(zhì)量濃度顯著提高（P＜0.05）。當糖質(zhì)量濃度達到600 g/L時，胞外甘油質(zhì)量濃度和總甘油質(zhì)量濃度達到最高，分別為4 781 mg/L和22 918 mg/L，遠超過常規(guī)培養(yǎng)（分別為1 845 mg/L和4 613 mg/L）。隨著糖質(zhì)量濃度從600 g/L增加到750 g/L時，胞內(nèi)甘油質(zhì)量濃度和總甘油質(zhì)量濃度顯著降低（P＜0.05）。此外，在不同的糖質(zhì)量濃度環(huán)境中，蜂蜜接合酵母胞內(nèi)外甘油質(zhì)量濃度的變化趨勢基本一致，但胞內(nèi)甘油質(zhì)量濃度始終高于胞外。在面對高糖環(huán)境時，釀酒酵母甘油的分泌量也會增加，主要是由于在高糖環(huán)境中菌體會上調(diào)甘油合成基因的表達[25]，蜂蜜接合酵母6-7431也可能利用同樣的機制應對高糖環(huán)境，甘油可作為該菌株應對高糖逆境的指示物質(zhì)。

2.4.2 高糖脅迫對蜂蜜接合酵母積累海藻糖的影響

圖3 初始糖質(zhì)量濃度對蜂蜜接合酵母6-7431積累海藻糖的影響Fig. 3 Effects of different initial sugar levels on the accumulation of trehalose in Z. mellis 6-7431

在相同的培養(yǎng)條件下，蜂蜜接合酵母6-7431經(jīng)高糖脅迫積累的胞內(nèi)海藻糖質(zhì)量濃度比常規(guī)培養(yǎng)基顯著增加（P＜0.05），結果如圖3所示。糖質(zhì)量濃度在300～650 g/L范圍內(nèi)，胞內(nèi)海藻糖含量與培養(yǎng)基中的糖質(zhì)量濃度呈正比，蜂蜜接合酵母6-7431積累海藻糖的變化趨勢與前期報道關于釀酒酵母積累海藻糖的趨勢較為類似，可能都是由于海藻糖合成基因的表達量增加所致[25]。當糖質(zhì)量濃度為650 g/L和700 g/L時，胞內(nèi)海藻糖含量達到最高83.649 mg/g，同時在兩個不同糖質(zhì)量濃度下胞內(nèi)海藻糖含量無顯著變化，而當糖質(zhì)量濃度達到750 g/L時，胞內(nèi)海藻糖含量顯著降低，這主要是由于滲透壓過高，導致細胞形態(tài)嚴重皺縮（圖1），胞內(nèi)代謝被抑制。本研究顯示海藻糖作為蜂蜜接合酵母6-7431的滲透壓調(diào)節(jié)劑之一，在不超過700 g/L糖質(zhì)量濃度的環(huán)境中可以發(fā)揮作用。

2.4.3 高糖脅迫對蜂蜜接合酵母TCA中間代謝產(chǎn)物的影響

蜂蜜接合酵母6-7431在高糖脅迫下，由于培養(yǎng)基中存在氧氣，在酵母菌TCA循環(huán)代謝中會積累蘋果酸。由圖4可知，在接種量為10%、初始pH 6.0、30 ℃條件下發(fā)酵96 h，蜂蜜接合酵母6-7431在初始糖質(zhì)量濃度300～700 g/L范圍內(nèi)，培養(yǎng)基中積累蘋果酸含量比常規(guī)培養(yǎng)基增加顯著（P＜0.05）。糖質(zhì)量濃度為300～650 g/L時，蘋果酸含量與培養(yǎng)基中的糖質(zhì)量濃度呈正比，有顯著上升趨勢，糖質(zhì)量濃度為650 g/L時，蘋果酸質(zhì)量濃度最高達到371.53mg/L，遠超過常規(guī)培養(yǎng)（142.13 mg/L）。當糖質(zhì)量濃度增加到650～750 g/L時，蜂蜜接合酵母逐漸無法適應高糖、高滲環(huán)境，TCA循環(huán)的代謝強度進一步降低，蘋果酸含量顯著下降（P＜0.05）。但是糖質(zhì)量濃度升至750 g/L時，蜂蜜接合酵母中積累蘋果酸含量甚至比常規(guī)培養(yǎng)還低，此時高滲環(huán)境已經(jīng)破壞了該菌的正常代謝功能。

圖4 初始糖質(zhì)量濃度對蜂蜜接合酵母6-7431積累蘋果酸的影響Fig. 4 Effects of different initial sugar levels on the accumulation of malic acid in Z. mellis 6-7431

圖5 初始糖質(zhì)量濃度對蜂蜜接合酵母6-7431積累檸檬酸的影響Fig. 5 Effects of different initial sugar levels on the accumulation of citric acid in Z. mellis 6-7431

蜂蜜接合酵母6-7431在高糖脅迫下，也會在胞內(nèi)積累檸檬酸，但由于高濃度蘋果酸的反饋抑制作用[26]，檸檬酸積累量較低。由圖5可知，在初始糖質(zhì)量濃度300～550 g/L、接種量10%、初始pH 6.0、30 ℃條件下發(fā)酵96 h，蜂蜜接合酵母6-7431積累的檸檬酸質(zhì)量濃度比常規(guī)培養(yǎng)顯著升高（P＜0.05），在糖質(zhì)量濃度為350 g/L時，檸檬酸積累量達到最大9.14 mg/L。糖質(zhì)量濃度在350～750 g/L范圍內(nèi)，蜂蜜接合酵母胞內(nèi)檸檬酸質(zhì)量濃度逐漸降低，主要由蘋果酸的反饋抑制作用和高滲環(huán)境導致。同樣，在高糖環(huán)境下，蜂蜜接合酵母6-7431在胞內(nèi)積累的α-酮戊二酸也具有蘋果酸類似的變化趨勢。前期大量的轉(zhuǎn)錄組學研究發(fā)現(xiàn)酵母菌在高糖環(huán)境中會增加糖酵解和磷酸戊糖途徑中酶基因的表達量[27]，同樣蛋白組學的研究也發(fā)現(xiàn)高糖環(huán)境會促使酵母菌中參與糖酵解和磷酸戊糖途徑的酶蛋白量增加[28]，這樣會促使更多的乙酰輔酶A進入到TCA中，研究發(fā)現(xiàn)釀酒酵母在高糖培養(yǎng)環(huán)境中，有氧呼吸抑制，TCA斷裂，導致TCA中間產(chǎn)物如α-酮戊二酸和蘋果酸不斷積累[5]，與本研究結果一致。

3 結 論

在6 株蜂蜜接合酵母中，發(fā)現(xiàn)蜂蜜接合酵母6-7431對營養(yǎng)物質(zhì)的代謝能力強于其他菌株，具有較好應用潛力。對該菌株在高糖脅迫下的細胞形態(tài)、繁殖方式和應激代謝產(chǎn)物的研究發(fā)現(xiàn)，菌株6-7431在300～550 g/L的高糖環(huán)境中能正常出芽生殖，其代謝產(chǎn)生的乙醇、甘油、海藻糖、有機酸等物質(zhì)含量都遠高于常規(guī)培養(yǎng)基的含糖環(huán)境；在550～700 g/L高糖環(huán)境中，菌株6-7431的繁殖方式由出芽生殖逐漸被抑制，代謝活動也有所減弱，分泌產(chǎn)生的乙醇、甘油、海藻糖、有機酸等物質(zhì)含量降低；在750 g/L高糖環(huán)境中，菌株6-7431嚴重失水，基本停止發(fā)酵活動。本研究不僅探究了高糖環(huán)境對蜂蜜接合酵母細胞形態(tài)、繁殖方式的影響，還發(fā)現(xiàn)高糖環(huán)境對TCA代謝中間產(chǎn)物具有重要的影響，本研究對酵母的高糖耐受機制以及酵母在乙醇濃醪發(fā)酵的研究具有重要的參考價值，但在產(chǎn)生應激反應的分子機制方面需要進一步挖掘。