張玲敏，王 斌，潘 力*

（華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東省發(fā)酵與酶工程重點實驗室，廣東 廣州 510006）

脂肪酶（EC 3.1.1.3）是用于三?；视退獾纳锎呋瘎1]，具有高度的化學(xué)、區(qū)域和立體選擇性，可催化酯類化合物的合成、分解、酯交換等多種反應(yīng)，因而被普遍應(yīng)用于食品、化妝品、化工和制藥等產(chǎn)業(yè)[2]。南極假絲酵母脂肪酶B（Candida antarctica lipase B，CALB）是一種優(yōu)異的脂肪酶，在水相、有機相中均具有很強的催化活性[3]。由于其具有特殊的活性中心結(jié)構(gòu)[4-5]，CALB沒有表現(xiàn)出界面活性卻有極強的立體選擇性和寬泛的底物特異性[6]，因此在手性化合物拆分、有機合成、醫(yī)藥中間體制備等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[7-9]。

1994年Uppenberg等[5]已研究出CALB自由酶的三維立體結(jié)構(gòu)和氨基酸序列；1995年，諾和諾德公司成功克隆出CALB基因，并首次在米曲霉里成功表達[10]；受米曲霉成功表達的啟發(fā)，CALB相繼實現(xiàn)了在大腸桿菌[11]、釀酒酵母[12]、畢赤酵母[13]等宿主中的表達。但是，米曲霉生產(chǎn)的商業(yè)化CALB價格昂貴無法滿足工業(yè)需求[14]；大腸桿菌缺乏蛋白質(zhì)翻譯后修飾系統(tǒng)，對真核來源的蛋白質(zhì)多以包涵體的形式產(chǎn)生[10]；畢赤酵母表達常用甲醇作為唯一碳源誘導(dǎo)培養(yǎng)，導(dǎo)致CALB在食品工業(yè)中的應(yīng)用受到限制[15]；釀酒酵母容易對CALB產(chǎn)生過度糖基化而降低其活性[16]。而黑曲霉代謝能力強、外源蛋白產(chǎn)量大、分泌效率高，具備完善的蛋白翻譯后修飾系統(tǒng)，是美國食品藥品監(jiān)督管理局認證的通常認為安全（generally regarded as safe，GRAS）的菌株[17-19]。然而目前幾乎沒有關(guān)于黑曲霉分泌表達CALB的文獻報道，因此本研究利用黑曲霉表達系統(tǒng)對CALB進行分泌表達，對于提高其產(chǎn)量、降低成本、滿足工業(yè)化需求具有非常重要的意義。

己酸乙酯是一種廣泛應(yīng)用于食品調(diào)香的酯類香料，主要用作白酒、食醋、糖果的調(diào)香劑[20]。與傳統(tǒng)化學(xué)法相比，酶法合成己酯乙酯具有反應(yīng)條件溫和、產(chǎn)率高、副產(chǎn)物少、易提取等優(yōu)點[21]。本研究根據(jù)黑曲霉密碼子偏好性設(shè)計合成了CALB基因并在黑曲霉HL-1中成功實現(xiàn)分泌表達，對純化后的CALB進行了酶學(xué)性質(zhì)分析，優(yōu)化了CALB在硅藻土上的固定條件，同時研究了硅藻土-CALB固定化酶在無溶劑體系中合成己酸乙酯的應(yīng)用。提供了一種用廉價載體簡易有效固定CALB催化己酸乙酯經(jīng)濟、快速、高效的合成途徑，為硅藻土-CALB固定化酶在酯化、水解、轉(zhuǎn)酯等方面的應(yīng)用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與試劑

大腸桿菌Match1T1 美國Invitrogen公司；黑曲霉HL-1 本實驗室保藏。

pUEV質(zhì)粒 本實驗室構(gòu)建；Bgl II和Apa I快速限制性內(nèi)切酶、DreamTaq Green PCR Master Mix美國Thermo Fisher Scientific公司；PCR預(yù)混酶Prime STAR HS（premix） 日本TaKaRa公司；HiFi DNA Assembly Cloning Kit 美國NEB公司；4-硝基苯丁酸酯（p-nitrophenyl butyrate，pNPB） 上海麥克林生化科技有限公司；引物 廣州天一輝遠公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

察氏（Czapek-Dox，CD）培養(yǎng)基（固體含2%瓊脂，液體含0.05%瓊脂）：2%葡萄糖，0.3% NaNO3，0.2% KCl，0.05% MgSO4·7H2O，0.1% KH2PO4，0.001% FeSO4·7H2O，pH 5.5。

蔗糖高滲培養(yǎng)基（上層板含0.5%瓊脂，底層板含2%瓊脂）：40%蔗糖，0.3% NaNO3，0.2% KCl，0.05% MgSO4·7H2O，0.1% KH2PO4，0.001% FeSO4·7H2O，pH 5.5。

淀粉固體培養(yǎng)基：0.3%牛肉膏，0.2%酵母粉，1%蛋白胨，0.2% NaCl，1%可溶性淀粉，2%瓊脂。

淀粉發(fā)酵培養(yǎng)基：5%玉米淀粉（需沸水浴加酶液化），3%玉米漿，2%黃豆餅粉。

三丁酸甘油酯固體培養(yǎng)基：0.2%橄欖油，0.5%三丁酸甘油酯，0.3% NaNO3，0.1% KH2PO4，0.05% MgSO4·7H2O，0.05% KCl，1%葡萄糖，0.25%曲拉通，2%瓊脂。

1.2 儀器與設(shè)備

Veriti 96-Well Thermal Cycler梯度聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國Applied Biosystems公司；微量移液器、高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；酶標(biāo)儀 美國Thermo Fisher Scientific公司；浸入式水平電泳系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司；AKATA層析儀 美國通用電氣公司；高速分散勻質(zhì)機上海標(biāo)本模型廠。

1.3 方法

1.3.1 CALB基因的優(yōu)化、合成與克隆

將CALB的氨基酸序列和黑曲霉密碼子偏好表發(fā)給南京金斯瑞生物科技有限公司，委托其合成密碼子優(yōu)化后的CALB基因并連接到pUC57T載體上，質(zhì)粒pUC57T-CALB用大腸桿菌Top 10保種。在實驗室克隆CALB基因則以提取的pUC57T-CALB質(zhì)粒為模板，設(shè)計擴增引物，上游引物：5’-ATGAAGCTGCTCTCCCTGACCG-3’；下游引物：5’-AAATGGATTGATTGTTCAGTGATGATGA TGATGATGGGGGGTCACGATACCGGAGC-3’（下劃線分別表示含15 bp與表達載體重疊的序列和18 bp 6×His-Tag標(biāo)簽序列）。PCR體系：質(zhì)粒模板2 μL，上下游引物各0.5 μL，2×Prime STAR 25 μL，ddH2O補足到總體積為50 μL，做2 個平行，共100 μL。PCR條件：98 ℃預(yù)變性10 min；98 ℃變性30 s，68 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35 個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1% DNA瓊脂糖凝膠電泳鑒定正確后純化回收存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 表達載體pUEV-PnaII/tpi-CALB的構(gòu)建及黑曲霉HL-1轉(zhuǎn)化

PnaII/tpi是一個高效的雜合啟動子，以黑曲霉HL-1基因組為模板，可設(shè)計引物進行克隆。上游引物：5’-AT GGGCCCAGATCTCAATTCATGGTGTTTTGATCATTT TAA-3’（下劃線表示含15 bp與表達載體重疊的序列），下游引物：5’-GGAGAGCAGCTTCATCCCAGTTGTGT ATATAGAGGA-3’（下劃線表示含15 bp與CALB重疊的序列），PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA瓊脂糖凝膠電泳鑒定正確后純化回收存于-20 ℃?zhèn)溆谩１緦嶒炇彝ㄓ幂d體pUEV如圖1所示，用限制性內(nèi)切酶Bgl II使其線性化并純化回收后與CALB、PnaII/tpi的PCR純化產(chǎn)物在NEB HiFi DNA連接酶的作用下50 ℃反應(yīng)30 min，然后轉(zhuǎn)入大腸桿菌Match1T1中，涂布在含100 μg/mL Amp的LB平板上，最后將通過菌液電泳和質(zhì)粒酶切驗證的陽性質(zhì)粒提交廣州天一輝遠公司進行序列鑒定。提取測序正確的重組質(zhì)粒并用限制性內(nèi)切酶Apa I進行線性化，通過CaCl2介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化到黑曲霉HL-1中，取轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于蔗糖高滲平板上，30 ℃培養(yǎng)5～7 d。

圖1 重組質(zhì)粒pUEV-PnaII/tpi-CALB的構(gòu)建流程Fig. 1 Construction of recombinant plasmid pUEV-PnaII/tpi-CALB

1.3.3 重組工程菌的篩選和表達

挑取蔗糖高滲平板上的轉(zhuǎn)化子至CD平板上，30 ℃培養(yǎng)3 d后再將CD平板上的轉(zhuǎn)化子同時挑取到淀粉平板和三丁酸甘油酯平板上，待三丁酸甘油酯平板上出現(xiàn)透明水解圈后提取淀粉板上相應(yīng)轉(zhuǎn)化子的基因組進行目的基因PCR鑒定，然后將鑒定正確且水解圈較大的陽性轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)移到液體CD培養(yǎng)基中靜置培養(yǎng)，最后進行搖瓶發(fā)酵表達產(chǎn)酶。搖瓶發(fā)酵過程如下：取3 mL含CALB重組工程菌的CD液體培養(yǎng)基，放入含100 mL淀粉發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)，發(fā)酵上清液即為粗酶液。

1.3.4 酶活力和蛋白含量測定

CALB活力以pNPB為底物，利用多功能酶標(biāo)儀測定。反應(yīng)體系如下：900 μL 50 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 8.0），50 μL 25 mmol/L pNPB底物溶液，50 μL適當(dāng)稀釋的酶液，45 ℃反應(yīng)5 min，測定反應(yīng)液在405 nm波長處的吸光度。酶活力單位定義：在45 ℃、pH 8.0條件下，1 min內(nèi)催化生成1 μmol對硝基苯酚所需要的酶量定義為1 U[1]。

蛋白質(zhì)含量通過BCA試劑盒測定，待測樣品37 ℃反應(yīng)30 min后在562 nm波長處測定其吸光度[1]。

1.3.5 SDS-PAGE分析和蛋白純化

取40 μL發(fā)酵上清液與10 μL 5×loading buffer混合，沸水浴5 min后取10 μL進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）。電泳采用12%的分離膠和5%的濃縮膠，60 V電泳30 min后切換到120 V，電泳結(jié)束后進行考馬斯亮藍染色。

蛋白純化采用金屬螯合層析法，原理是CALB上的His Tag可與層析柱上的Ni2+發(fā)生螯合作用而被吸附。發(fā)酵液在10 000×g、4 ℃離心2 次并用0.45 μm水系濾膜抽濾后存于4 ℃中待純化，柱子選擇GE公司的5 mL HisTrapTMHP，其上的金屬位點用0.1 mol/L NiSO4溶液填充。具體純化步驟如下：20%的乙醇溶液沖洗系統(tǒng)至基線平穩(wěn)；將柱子連接到AKATA層析儀上；超純水沖洗柱子至基線平穩(wěn)；Buffer A（0.5 mol/L NaCl，20 mmol/L Tris，pH 8.0）沖洗柱子至基線平穩(wěn)；取合適體積的待純化樣品上樣；上樣結(jié)束后，用Buffer A沖洗柱子至基線平穩(wěn)；Buffer B（0.5 mol/L咪唑，0.5 mol/L NaCl，20 mmol/L Tris，pH 8.0）梯度洗脫（10%～100%）并收集有峰的洗脫液；洗脫結(jié)束后，先用超純水沖洗柱子至基線平穩(wěn)，再用20%乙醇溶液沖洗封柱。

1.3.6 酶學(xué)性質(zhì)分析

1.3.6.1 最適溫度和溫度穩(wěn)定性

在pH 8.0 Tris-HCl緩沖液中分別測定CALB在25～80 ℃的酶活力，活力最高的溫度即為最適反應(yīng)溫度，以其酶活力為100%，計算其他溫度下的相對酶活力。將CALB在25～70 ℃中分別水浴保溫1 h，再在最適溫度、pH 8.0條件下測定殘余酶活力，以未做任何處理的酶液活力為100%，計算其他溫度條件下的殘余酶活力。

1.3.6.2 最適pH值和pH值穩(wěn)定性

在50 ℃中分別測定CALB在pH 4～10（50 mmol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液：pH 4～6；50 mmol/L磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液：pH 6～8；50 mmol/L Tris-HCl緩沖液：pH 8～10）條件下的酶活力，活力最高的pH值即為最適反應(yīng)pH值，以其酶活力為100%，計算其他pH值條件下的相對酶活力。將CALB分別在pH 4～10中4 ℃保存24 h，再在最適溫度、最適合pH值條件下測定殘余酶活力，以未做任何處理的酶液活力為100%，計算其他pH值下的殘余酶活力。

1.3.6.3 金屬離子和表面活性劑對CALB活力的影響

將CALB分別在含有1、10 mmol/L不同金屬離子（Na+、K+、Cu2+、Zn2+、Ca2+、Mg2+、Mn2+、Ni2+、Ba2+）和0.1 g/100 mL不同表面活性劑（SDS、山梨醇、TritonX-100、Tween-20）的pH 8.0 Tris-HCl緩沖液中40 ℃處理30 min，以未加金屬離子和表面活性劑的酶活力為100%，在pH 8.0、50 ℃條件下測定相對酶活力。

1.3.7 硅藻土固定化酶的制備

在一定濃度、一定pH值的50 mL CALB粗酶液體系中加入一定量的硅藻土，攪拌均勻，恒溫水浴振蕩一定時間后，離心收集固體，將固定化載體用一定量的丙酮清洗3 遍，使載體顆粒分散，真空冷凍干燥后存于4 ℃?zhèn)溆肹22]。固定化酶活力分析方法參照1.3.4節(jié)方法。

1.3.8 固定化酶用于己酸乙酯的合成

在50 mL具塞三角瓶中加入50 mmol己酸和一定量的無水乙醇作為反應(yīng)物，所有反應(yīng)物和固定化酶分別在密封容器中用飽和LiCl溶液（aw=0.11）于25 ℃預(yù)平衡3 d。在反應(yīng)前向酯化體系加入一定量的水控制反應(yīng)的初始含水量（占己酸物質(zhì)的量百分比），最后加入固定化酶（100 U/g）立即啟動反應(yīng)，反應(yīng)在200 r/min及一定溫度的恒溫水浴搖床中進行。隨后，定時取出100 μL樣品并與5 mL預(yù)冷的正己烷混合，通過在酚酞存在下用0.1 mol/L的氫氧化鉀-乙醇標(biāo)準溶液滴定取出的混合物，測定剩余脂肪酸含量以確定酯的合成[23]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及圖表繪制

實驗中每組數(shù)據(jù)均做3 個平行，取平均值作圖，誤差分析采用標(biāo)準差的方式，圖表用Origin分析軟件繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 表達載體pUEV-PnaII/tpi-CALB的構(gòu)建

分別以pUC57T-CALB質(zhì)粒和黑曲霉HL-1基因組為模板，PCR擴增得到CALB基因和PnaII/tpi啟動子，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳（圖2）可見，CALB大小約1 000 bp，PnaII/tpi大小約600 bp，將這兩個片段回收并與線性化后的通用載體pUEV在重組酶的作用下連接，提取重組質(zhì)粒，進行Apa I酶切驗證，電泳結(jié)果顯示片段大小正確，最后經(jīng)DNA測序鑒定表達載體pUEV-PnaII/tpi-CALB已成功構(gòu)建。

圖2 CALB基因、PnaII/tpi啟動子PCR擴增及重組質(zhì)粒酶切鑒定Fig. 2 Electrophoretogram of PCR amplified products and restriction enzyme digestion analysis of plasmid pUEV-PnaII/tpi-CALB

2.2 重組工程菌的篩選和表達

圖3 重組黑曲霉產(chǎn)酶曲線Fig. 3 Lipase production of recombinant Aspergillus niger

按照1.3.3節(jié)的方法篩選得到了1 株產(chǎn)重組CALB活力較高的轉(zhuǎn)化子，命名為n17，將其CD液體培養(yǎng)基用30%（體積分數(shù)）甘油保種存于-80 ℃。在n17搖瓶發(fā)酵過程中，每隔24 h取樣測定發(fā)酵上清液的酶活力。如圖3所示，發(fā)酵培養(yǎng)到72 h時，酶活力達116 U/mL；而當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基含2%葡萄糖時，菌體生長期延長，酶活力在120 h時最高，達到171 U/mL。

2.3 SDS-PAGE分析和重組蛋白純化

圖4 重組CALB粗酶液（A）及純化液（B）SDS-PAGE分析Fig. 4 SDS analysis of the crude (A) and purified (B) recombinant lipase

n17接種發(fā)酵培養(yǎng)基后每隔24 h取樣，離心收集上清液進行SDS-PAGE分析，用未轉(zhuǎn)入CALB的宿主作為對照。由圖4A可見，在理論值33 kDa[24]附近出現(xiàn)了明顯的條帶，且隨培養(yǎng)時間的延長，其濃度先增加后減小，對照則沒有出現(xiàn)相應(yīng)的條帶，只是在50 kDa附近出現(xiàn)了2 個背景蛋白條帶。

重組CALB經(jīng)鎳柱親和層析純化后，進行酶活力和蛋白含量測定，如表1所示，目的蛋白純化了6.4 倍，但酶活力回收率僅6.2%，說明CALB在純化過程中損失較大，但純度較高。將純化后的CALB進行SDS-PAGE分析（圖4B），可知純化產(chǎn)物僅出現(xiàn)單一條帶且分子質(zhì)量與上清液中CALB一致，證實該純化產(chǎn)物即為CALB且純化效果理想。

表1 重組蛋白的純化Table 1 Purification of recombinant lipase

2.4 酶學(xué)性質(zhì)分析

2.4.1 最適溫度和熱穩(wěn)定性

圖5 重組CALB的最適反應(yīng)溫度（A）及熱穩(wěn)定性（B）Fig. 5 Effect of temperature on the activity (A) and stability (B) of recombinant CALB

如圖5A所示，在25～50 ℃范圍內(nèi)酶活力隨溫度升高逐漸上升，在50～80 ℃范圍內(nèi)酶活力隨溫度升高逐漸下降，說明該重組CALB的最適反應(yīng)溫度為50 ℃，與Liu Zhiqiang等[1]在畢赤酵母中表達的CALB最適反應(yīng)溫度52 ℃相近。如圖5B所示，在25～45 ℃范圍內(nèi)，重組CALB具有較好的穩(wěn)定性，殘余酶活力在80%左右；當(dāng)溫度超過50 ℃時，酶的活性急劇下降，在70 ℃時酶活力僅為對照的6%，表明該酶對高溫耐受性較差。

2.4.2 最適pH值和pH值穩(wěn)定性

圖6 重組CALB的最適反應(yīng)pH值（A）及pH值穩(wěn)定性（B）Fig. 6 Effect of pH value on the activity (A) and stability (B) of recombinant lipase

如圖6A所示，在pH 4.0～5.0范圍內(nèi)幾乎沒有酶活力，在pH 6.0～8.0范圍內(nèi)隨著pH值的升高酶活力逐漸升高，在pH 8.0～10.0范圍內(nèi)酶活力逐漸下降，說明重組CALB在弱堿環(huán)境中具有較好的活性，最適反應(yīng)pH值為8.0，與其他報道[1,6]的重組CALB最適反應(yīng)pH值一致。如圖6B所示，重組CALB在pH 6.0～9.0范圍內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性，殘余酶活力均在80%左右，當(dāng)條件過酸或過堿時酶活力均會急劇下降。

2.4.3 金屬離子和表面活性劑對CALB活力的影響

表2 不同金屬離子對重組CALB活力的影響Table 2 Effects of different metal ions on the activity of recombinant CALB

由表2可知，低濃度（1 mmol/L）條件下Ca2+和Ni2+均對重組CALB具有激活作用，其中Ca2+激活作用最強；Na+、K+、Mn2+對重組CALB活力幾乎沒有影響；而Cu2+、Zn2+、Mg2+、Ba2+抑制重組CALB活力。在金屬離子濃度提高到10 mmol/L時，Ca2+仍有輕微的激活作用，Ni2+由激活轉(zhuǎn)為抑制；Na+、K+對CALB活力仍無影響；而Cu2+、Zn2+對CALB活力的抑制作用急劇加強。與其他研究[1,13]相比發(fā)現(xiàn)，Ca2+對重組CALB普遍具有激活作用，而Cu2+對重組CALB普遍具有抑制作用。

表3 不同表面活性劑對重組CALB活力的影響Table 3 Effects of different surfactants on the activity of recombinant CALB

由表3可知，在0.1 g/100 mL條件下，山梨醇對重組CALB具有明顯的激活作用，激活強度比Liu Zhiqiang等[1]報道的高40%；而SDS和TritonX-100則抑制了重組CALB的活性，其中SDS抑制作用最強烈，抑制強度比Liu Zhiqiang等[1]報道的高83%；Tween-20則對CALB活力沒有影響。

2.5 硅藻土對CALB固定條件優(yōu)化

在固定時間4 h、pH 7.5、溫度35 ℃條件下，向50 mL CALB粗酶液體系中加入1 g硅藻土，由圖7A可知，隨CALB粗酶液活力增加固定化酶相對活力逐漸升高，這是因為載體吸附的蛋白量逐漸增加。在CALB粗酶液活力為70 U/mL時，固定化酶相對活力最高，此時繼續(xù)增加酶液用量會使固定化酶活力下降，原因在于每個載體分子表面吸附的蛋白量相對過多，造成酶分子相互聚集成團，酶分子的活性中心有可能被遮蓋。

在固定時間4 h、pH 7.5、硅藻土質(zhì)量1 g、CALB粗酶液活力70 U/mL條件下，研究不同溫度對固定化的影響。由圖7B可知，在25～40 ℃范圍內(nèi)固定化酶活力隨溫度升高而升高，這是因為溫度升高導(dǎo)致分子運動逐步劇烈，蛋白吸附量有所提高；當(dāng)溫度超過40 ℃后，由于酶分子在較高溫度發(fā)生了不可逆失活導(dǎo)致固定化酶活力下降，因此固定化溫度不宜太高，最適固定溫度為40 ℃。

在固定時間4 h、溫度40 ℃、硅藻土質(zhì)量1 g、CALB粗酶液活力70 U/mL條件下，研究pH值對固定化的影響。由圖7C可知，硅藻土固定化CALB只有在弱堿環(huán)境下才能固定上較高酶活力，當(dāng)pH值繼續(xù)升高，CALB會帶上負電荷并與硅藻土自身攜帶的負電荷產(chǎn)生電荷排斥效應(yīng)，導(dǎo)致蛋白吸附量降低，因此最適固定pH值為7.5～8.0。

在固定溫度40 ℃、pH 7.5、硅藻土質(zhì)量1 g、CALB粗酶液活力70 U/mL條件下，研究固定時間對固定化的影響。由圖7D可知，固定化酶活力在3 h最高，由于CALB熱穩(wěn)定不高，高溫下繼續(xù)延長固定時間會導(dǎo)致固定化酶活力降低。

2.6 固定化酶合成己酸乙酯條件優(yōu)化

圖8 固定化酶用量（A）、乙醇-己酸物質(zhì)的量比（B）、初始含水量（C）及反應(yīng)溫度（D）對己酸乙酯產(chǎn)率的影響Fig. 8 Effects of immobilized enzyme dosage (A), molar ratio between ethanol and hexanoic acid (B), initial water content (C) and reaction temperature (D) on the yield of ethyl hexanoate

如圖8所示，產(chǎn)物產(chǎn)率隨固定化酶用量的增加而升高，但當(dāng)固定化酶用量超過1.2 g時，酶相對底物出現(xiàn)飽和，固定化酶用量繼續(xù)增加會影響傳質(zhì)降低酶促反應(yīng)速率從而導(dǎo)致產(chǎn)物產(chǎn)率降低；當(dāng)乙醇-己酸物質(zhì)的量比為1.0時，產(chǎn)物產(chǎn)率最高，過量的酸或醇均不會增加產(chǎn)物產(chǎn)率；CALB分子表面需要一定量的結(jié)合水才能維持酶構(gòu)象發(fā)揮催化活性[25]，當(dāng)反應(yīng)體系中初始含水量為10%～50%時產(chǎn)物產(chǎn)率最高，初始含水量過低或過高都會急劇降低產(chǎn)物產(chǎn)率；在35～50 ℃范圍內(nèi)，隨反應(yīng)溫度的升高，底物分子與酶分子碰撞更加頻繁從而使產(chǎn)物產(chǎn)率提高，當(dāng)溫度超過50 ℃時，固定化酶在高溫下逐漸變性失活，催化能力降低導(dǎo)致產(chǎn)物產(chǎn)率下降，因此最適反應(yīng)溫度為50 ℃。

2.7 固定化酶的操作穩(wěn)定性

固定化酶比游離酶穩(wěn)定性高，并且可以回收重復(fù)利用。在最佳反應(yīng)條件下將固定化酶重復(fù)進行6 次己酸乙酯合成實驗，如圖9所示，從第4次開始，固定化酶的催化效果急劇下降，利用到第6次時催化能力僅剩20%左右，說明隨著使用次數(shù)的增加，CALB會從硅藻土上脫落且高溫反應(yīng)也會導(dǎo)致固定化酶逐漸失活。

圖9 固定化酶的操作穩(wěn)定性Fig. 9 Operational stability of immobilized enzyme

3 討論與結(jié)論

目前關(guān)于CALB的研究主要集中在其催化應(yīng)用[26-27]和畢赤酵母表達[28-29]上，但是商業(yè)化CALB成本高難以實現(xiàn)大規(guī)模的工業(yè)化應(yīng)用，而畢赤酵母對CALB無論是分泌表達還是展示表達均無法取得較高的活性和產(chǎn)量。黑曲霉作為成熟的真核表達系統(tǒng)，代謝靈活性強，蛋白分泌效率高，具備完善的蛋白翻譯后修飾系統(tǒng)，Pan Zhiyou等[23]利用黑曲霉作為宿主表面展示表達CALB，但是存在CALB與錨定蛋白結(jié)合不牢固而容易外泄的問題，且在搖瓶發(fā)酵條件下對pNPB的水解活力僅為400 U/g（以干細胞計）。

本研究根據(jù)黑曲霉密碼子偏好性將CALB基因進行密碼子優(yōu)化后成功轉(zhuǎn)入黑曲霉HL-1中實現(xiàn)分泌表達，在含2%葡萄糖的淀粉發(fā)酵培養(yǎng)基中進行搖瓶發(fā)酵，其上清液酶活力達到171 U/mL，分別是畢赤酵母分泌表達11.1 U/mL[6]和46 U/mL[13]的15.5 倍和3.7 倍。CALB粗酶液經(jīng)鎳柱親和層析后純化了6.4 倍，但酶活回收率較低。重組CALB最適反應(yīng)溫度為50 ℃，最適反應(yīng)pH值為8.0，在pH 6.0～9.0和45 ℃以下具有較高的穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)Ca2+對CALB有激活作用，而Zn2+和Cu2+對CALB有強烈的抑制作用，表面活性劑山梨醇可提高CALB活力，而SDS則強烈抑制CALB活力。

CALB固定化多以有機材料作載體，固定過程繁瑣且費用高，而硅藻土是一種常用來固定脂肪酶的無機載體，其價格便宜，固定過程簡單，依靠其強烈的吸附作用即可固定蛋白質(zhì)，因此本研究使用硅藻土作為CALB的固定載體，以期獲得經(jīng)濟有效的固定化酶。經(jīng)過實驗探究得出最佳固定條件為溫度40 ℃、pH 7.5、時間3 h，在最佳固定條件下，1 g硅藻土對50 mL CALB粗酶液（70 U/mL）的固定量為187 U/g。在測試該固定化酶催化己酸乙酯合成過程中得出最佳反應(yīng)條件為：酶使用量1.2 g（100 U/g）、酸醇物質(zhì)的量比1.0、初始含水量10%～50%，反應(yīng)溫度50 ℃。在該反應(yīng)條件下，己酸乙酯在4 h內(nèi)便達到了最高產(chǎn)率91%，取得了與CALB全細胞生物催化劑同樣的效率[23]，由此表明利用硅藻土固定CALB制備固定化酶具有簡單、經(jīng)濟及高效的優(yōu)點。

本研究成功實現(xiàn)了CALB的高效胞外分泌表達，并對該酶的硅藻土固定化應(yīng)用進行了探索，基于本實驗的研究現(xiàn)狀，今后可采用高密度發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)以進一步提高CALB的產(chǎn)量和活性，使其最終能滿足工業(yè)化需求。