撒 琪 任貴生 綜述 黃湘華 審校

系統(tǒng)性輕鏈型淀粉樣變性(AL)是由免疫球蛋白錯誤折疊形成淀粉樣纖維在細(xì)胞外沉積，導(dǎo)致進(jìn)行性組織器官功能損傷的一組復(fù)雜疾病［1］。可累及腎臟、心臟、肝臟等多個器官，病情兇險，預(yù)后差。目前該病的確診主要依賴組織活檢明確淀粉樣沉積物的存在。而淀粉樣纖維的前體蛋白來源于骨髓單克隆漿細(xì)胞，后者的檢測對疾病診斷有很大幫助。但由于該群細(xì)胞數(shù)量少、形態(tài)變化小且與正常漿細(xì)胞共存，難以通過形態(tài)學(xué)檢測來識別。為提高準(zhǔn)確性，需要進(jìn)行免疫表型檢測。以往常采用免疫組織化學(xué)/熒光染色，利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學(xué)反應(yīng)或熒光素標(biāo)記技術(shù)使抗體顯色，從而對細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)的抗原進(jìn)行分析。此方法操作簡便，不需要昂貴的設(shè)備，特異性強(qiáng)、靈敏度高。但經(jīng)固定和包埋后，細(xì)胞表面許多抗原表位已經(jīng)改變，并且每次可檢測的抗原數(shù)量有限，不能對靶抗原進(jìn)行客觀的定量檢測［2］，即使配以成像技術(shù)也只能得到半定量結(jié)果，無法用于疾病監(jiān)測。由于這些缺陷，需要使用更加先進(jìn)的技術(shù)。

流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)是一種能夠?qū)蝹€細(xì)胞或生物微顆粒的生物學(xué)性質(zhì)進(jìn)行定量分析和分選的檢測手段，具有快速、高精度、高準(zhǔn)確性、高通量、多參數(shù)等優(yōu)點(diǎn)。目前，多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)(multiparameter flow cytometry，MFC)已成為診斷和監(jiān)測大多數(shù)血液系統(tǒng)腫瘤的主要手段，其在漿細(xì)胞疾病中可通過明確骨髓中漿細(xì)胞數(shù)量、比例和克隆性，輔助疾病診斷;基于異常和正常漿細(xì)胞的比例對疾病進(jìn)展風(fēng)險進(jìn)行評估;通過對微小殘留病灶的定量檢測對療效和預(yù)后進(jìn)行判斷［3］。如今，越來越多的研究開始聚焦于MFC在AL中的臨床應(yīng)用。本文將對MFC免疫表型分析在AL的診斷、治療及預(yù)后評估等方面的應(yīng)用作一綜述，揭示流式細(xì)胞術(shù)在AL中的潛在價值。

良、惡性漿細(xì)胞的免疫表型特征

正常骨髓漿細(xì)胞高表達(dá) CD38和 CD138。CD138是跨膜硫酸乙酰肝素蛋白聚糖家族的一員，主要表達(dá)于上皮細(xì)胞，在前B細(xì)胞、未成熟B細(xì)胞和漿細(xì)胞也表達(dá)［4］。骨髓中淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和粒細(xì)胞均不表達(dá)CD138，僅漿細(xì)胞表達(dá)，可作為漿細(xì)胞的特異性標(biāo)志。CD38表達(dá)于早期不成熟的B細(xì)胞，在成熟B細(xì)胞表面不表達(dá)，但在漿細(xì)胞中重新出現(xiàn)并強(qiáng)烈表達(dá)［5］。

除上述兩種表面抗原之外，正常漿細(xì)胞存在CD19、CD27、CD45、CD56 和 CD81 的異源表達(dá)［6］。研究報道大多數(shù)正常漿細(xì)胞免疫表型為CD19+，CD45 弱+，CD56－和 CD81+［7］。正常情況下，CD19在B細(xì)胞成熟且最終分化為漿細(xì)胞的整個過程中都有表達(dá)［8］，而CD56一般不表達(dá)。CD19和CD56是較常用的區(qū)分正常和異常漿細(xì)胞的表面標(biāo)志物，但有研究發(fā)現(xiàn)部分健康人群骨髓漿細(xì)胞中存在表型為CD19－CD56+的亞群，為長壽命終末分化漿細(xì)胞［9］。CD45表達(dá)于除紅細(xì)胞和血小板之外的所有造血細(xì)胞。在漿細(xì)胞中隨著細(xì)胞的發(fā)育成熟與增殖停止，其表達(dá)量逐漸降低［10］。CD27屬于腫瘤壞死因子受體家族，在B細(xì)胞和大部分外周T細(xì)胞均有表達(dá)，是記憶B細(xì)胞向成熟漿細(xì)胞分化的一個重要分子［11］。CD81廣泛表達(dá)于B細(xì)胞和成熟漿細(xì)胞。

根據(jù)上述CD分子在良惡性漿細(xì)胞表面表達(dá)的差異，MFC檢測可識別異常漿細(xì)胞，從而輔助疾病診斷。如在多發(fā)性骨髓(MM)中正常與異常漿細(xì)胞存在多個抗原分子的表達(dá)差異(表1)。值得注意的是，有研究表明雖然 MM與AL兩者單克隆漿細(xì)胞免疫表型有大量重疊，但MFC檢測仍可發(fā)現(xiàn)差異。Hu等［12］研究發(fā)現(xiàn)，盡管在MM和AL中均存在表型類似的異常克隆漿細(xì)胞，但MM中的異?？寺{細(xì)胞更大、浸潤程度更高，CD117的表達(dá)相對較弱。Diao等［13］對51例AL和150例MM患者的FCM免疫表型進(jìn)行回顧性分析，發(fā)現(xiàn)與MM患者相比，AL患者骨髓總漿細(xì)胞比例明顯較低，且更容易檢測到正常和異常兩種免疫表型的漿細(xì)胞。此外，AL時CD19表達(dá)高于MM，而CD56和CD138的表達(dá)低于MM(表2)。CD19表達(dá)的缺失可反映克隆漿細(xì)胞的惡性程度，CD138介導(dǎo)細(xì)胞黏附和細(xì)胞之間的相互作用，可促進(jìn)惡性漿細(xì)胞的增殖和生長，而CD56的表達(dá)與骨髓瘤患者的骨溶解病變相關(guān)。

表1 MM中正常與異常漿細(xì)胞表面抗原表達(dá)情況［4］

表2 MFC檢測 AL與MM漿細(xì)胞抗原表達(dá)對比［13］

除了細(xì)胞表面抗原分子，良性和惡性漿細(xì)胞胞內(nèi)的游離輕鏈也存在差異。一般情況下，正常漿細(xì)胞能產(chǎn)生κ和λ兩種輕鏈，且兩者存在一定的比率。而在AL中，單克隆漿細(xì)胞只表達(dá)κ和λ輕鏈兩者之一，存在輕鏈限制性。歐洲骨髓瘤網(wǎng)站(european myeloma network，EMN)將 κ/λ 輕鏈的比值＞8(κ克隆)，或＜0.2(λ克隆)作為異常漿細(xì)胞的標(biāo)志。在用κ/λ評估克隆性時，只有單克隆細(xì)胞群大于多克隆漿細(xì)胞的30%時，輕鏈限制性表達(dá)才會明顯［14］。骨髓漿細(xì)胞比例低，而AL中克隆性和正常漿細(xì)胞共存，正常漿細(xì)胞未完全受抑制，若僅用輕鏈限制性來鑒定異常漿細(xì)胞比較困難［3］，需聯(lián)合漿細(xì)胞表面抗原表型才能準(zhǔn)確判斷異常漿細(xì)胞的克隆性質(zhì)。

MFC檢測AL單克隆漿細(xì)胞的設(shè)門策略和抗體組合

合理的設(shè)門方法是提高M(jìn)FC檢測靈敏度和可靠性的關(guān)鍵。以CD38、CD138和(或)CD45表達(dá)為基礎(chǔ)，以往常采用CD38/SSC和CD138/SSC設(shè)門。一項對MM的研究發(fā)現(xiàn)CD45/SSC設(shè)門下大部分抗原的陽性率明顯低于CD38/SSC和CD38/CD45設(shè)門組［15］。采用CD38/CD138設(shè)門可提高漿細(xì)胞的檢出率，但混有其他細(xì)胞的幾率也較高。采用CD38/CD45設(shè)門可減少其他細(xì)胞污染的幾率，使設(shè)門更加精確，但容易遺漏大多數(shù)的CD45+惡性漿細(xì)胞。EMN于2008年在MM免疫分型的設(shè)門策略上達(dá)成一致:聯(lián)合使用 CD38、CD138、CD45和 SSC，可達(dá)到漿細(xì)胞最佳檢出率［14］。

EMN制定了標(biāo)準(zhǔn)化漿細(xì)胞病(PCD)抗體面板［16］，在8色流式細(xì)胞儀的兩個管道中使用12個CD標(biāo)記。除了共有的4個標(biāo)記CD38、CD138、CD45和 CD19 之外，還包含有 CD56、CD27、CD28、CD81、CD117、β2微球蛋白、κ和λ。這兩種管的抗體組合能夠準(zhǔn)確對漿細(xì)胞進(jìn)行鑒別、定量檢測及免疫表型分析［17－18］。此外，歐洲薩拉曼卡和利茲的骨髓瘤診斷會議上建議使用六色熒光組合:cytIgκ/cytIgλ/CD19/CD56/CD38/CD45，即使腫瘤細(xì)胞低至骨髓造血細(xì)胞的0.01%時也能檢測出來，大大減少了檢測時間及獲取分析數(shù)據(jù)的成本［19］。

研究表明，AL中漿細(xì)胞的免疫表型特征主要為:CD19－，CD45－或弱陽性，伴或不伴 CD56過表達(dá)［20］。目前推薦聯(lián)合使用 CD38、CD138、CD19、CD56、CD45等“骨架”抗體。AL單克隆漿細(xì)胞CD117呈陽性，也可作為一種標(biāo)志物。根據(jù)輕鏈限制性，結(jié)合胞內(nèi)游離輕鏈κ和λ的檢測可以更加準(zhǔn)確地識別AL中的異常漿細(xì)胞(圖1)。此外，條件允許時可聯(lián)合使用 CD81、CD27、CD28、CD13、CD33、CD20、CD22、CD200等備選抗體，進(jìn)一步分析AL單克隆漿細(xì)胞的免疫表型特征［21］。

漿細(xì)胞免疫表型在AL預(yù)后評估及治療的潛在價值

漿細(xì)胞免疫表型分析除了可用于輔助疾病診斷，在預(yù)后評估中也有重要價值。在MM中已發(fā)現(xiàn)多種CD分子與疾病預(yù)后密切相關(guān)，例如CD27與MM的進(jìn)展有關(guān)［22］;CD28陽性為侵襲性表型，其與骨髓瘤細(xì)胞的高增殖活性和腫瘤擴(kuò)散相關(guān)［23］;CD117在MM中已被證明與較好的預(yù)后相關(guān)［24］。而在 AL中，Sachchithanantham等［25］進(jìn)行了一項前瞻性研究，發(fā)現(xiàn)表達(dá)CD56的患者心臟受累顯著高于表達(dá)CD27的患者，而表達(dá)CD27的患者血液學(xué)反應(yīng)較差。CD27或CD81陰性的患者相比于表型陽性的患者很好的部分緩解(very good partial remission，VGPR)比率更高。

腫瘤細(xì)胞負(fù)荷也是疾病的一個預(yù)后因素。AL患者骨髓漿細(xì)胞浸潤程度通常很低，可能由于該特征使得在預(yù)測患者的總生存期(overall survival，OS)時，形態(tài)學(xué)和免疫組織化學(xué)檢測評估的百分比通常不一致。在MM中，盡管MFC檢測漿細(xì)胞計數(shù)低于形態(tài)學(xué)檢測，但前者仍是一個獨(dú)立的預(yù)后因素［26］。而在AL中，骨髓中正常漿細(xì)胞所占比例與OS呈正相關(guān):Sachchithanantham 等［25］的研究發(fā)現(xiàn)，盡管納入研究的所有AL患者未達(dá)到中位OS，正常漿細(xì)胞(表型為CD38+CD138+CD19+的漿細(xì)胞)＞5%的患者2年 OS為74%，而正常漿細(xì)胞＜5%的僅為45%。Tovar等［27］對75例AL患者進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)骨髓漿細(xì)胞超過10%的患者心臟受累比例以及早期死亡率明顯較高，無進(jìn)展生存期(progress free survival，PFC)和OS明顯縮短;且骨髓中較高的漿細(xì)胞浸潤可能與全身器官受累加重有關(guān)，尤其是心臟受累。而Sidana等［28］采用MFC檢測AL患者循環(huán)中的單克隆漿細(xì)胞(cPCs)，發(fā)現(xiàn)cPCs的存在與較低的OS和較差的PFC有關(guān)，是OS獨(dú)立的不良預(yù)測因子。

圖1 1例AL患者骨髓MFC檢測設(shè)門策略

在疾病治療方面，MFC免疫表型分析也有臨床應(yīng)用價值。研究發(fā)現(xiàn)，AL的一個潛在標(biāo)志物是CD32B，為Fc受體家族的一員，主要調(diào)節(jié)血漿細(xì)胞的存活和凋亡。Zhou等［29］利用MFC檢測48例AL患者單克隆漿細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)在異常漿細(xì)胞表面CD32B高表達(dá)，而人源化的2B6單克隆抗體可以與低親和力IgG Fc受體CD32B特異性結(jié)合，這為AL的單克隆抗體治療提供了一個靶點(diǎn)。另一個靶點(diǎn)可能是CS1，這是一種細(xì)胞表面糖蛋白，在血漿細(xì)胞中高度表達(dá)［30］。最近一項研究中利用MFC對10例AL患者和10例MM患者單克隆漿細(xì)胞表面CS1進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)與MM相似，所有AL患者單克隆漿細(xì)胞均檢測到 CS1的高表達(dá)［31］。高活性的抗 CS1抗體Elotuzumab可用于MM疾病治療，其能否應(yīng)用于AL的治療還有待進(jìn)一步的臨床研究來驗(yàn)證。

小結(jié):AL本質(zhì)上是一種漿細(xì)胞病，其診斷和治療已經(jīng)引起人們越來越多的重視，關(guān)于AL患者漿細(xì)胞免疫表型的研究也日漸增加。與MM類似，AL患者骨髓中存在異常漿細(xì)胞，但由于其數(shù)量少、形態(tài)變化小且與正常漿細(xì)胞共存，難以通過形態(tài)學(xué)檢查來識別。而MFC在從10萬個以上骨髓細(xì)胞中鑒定出異常漿細(xì)胞具有優(yōu)勢，有更好的可重復(fù)性和較少的偏倚［12］。MFC在 MM診斷、治療及預(yù)后評估中的應(yīng)用已有大量研究，但其在AL的應(yīng)用價值還有待進(jìn)一步的挖掘與探索。相信隨著技術(shù)的不斷發(fā)展和研究的不斷深入，MFC將會成為AL疾病診斷、風(fēng)險分層和治療監(jiān)測的強(qiáng)大工具。