劉清，陽衛(wèi)立，王偉，海麗娜，羅永勝，胡雙成

肝癌是常見的一種惡性腫瘤，病情一旦確診，80%以上的患者已經(jīng)處于疾病發(fā)展的中晚期階段，且錯過手術(shù)切除治療的最好機(jī)會，經(jīng)肝動脈化療栓塞術(shù)已成非手術(shù)治療肝癌的主要手段，但5年內(nèi)患者生存率僅在10%左右，而且很多患者無法耐受其對機(jī)體的毒副作用如骨髓抑制、免疫抑制、胃腸道反應(yīng)等，另有部分患者單藥治療效果不佳，多藥聯(lián)合化療可減少腫瘤的耐藥性，提高治療效果［1］。目前發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥治療具有巨大潛力［2］，大量的臨床研究證實(shí)復(fù)方苦參注射液在治療惡性腫瘤、緩解癌性疼痛、與化療藥聯(lián)合應(yīng)用在抗癌增效、降低放化療的毒性等方面均具有很好的療效［3］。復(fù)方苦參注射液是由苦參和白土苓經(jīng)現(xiàn)代化工藝加工制成的純中藥制劑［4］，經(jīng)高效液相法表明其主要有效成分為苦參堿（M）和氧化苦參堿（OMT）。有研究表明M、OMT有明顯的抗腫瘤作用［5-6］，對肺癌、卵巢癌、白血病等細(xì)胞生長具有抑制作用，這種作用可能與其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)［6-8］。林麗珠等［9］研究發(fā)現(xiàn)一定濃度的復(fù)方苦參注射液對肺癌LAC、Iewis細(xì)胞和肝癌Hep、H22腫瘤細(xì)胞增殖均具有明顯的抑制作用。鄒姝姝等［10］研究了苦參堿對肝癌細(xì)胞的作用結(jié)果表明不同濃度的苦參堿具有抑制肝癌H22細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡的作用，呈明顯的時間、劑量依賴性。但還沒有文獻(xiàn)報道復(fù)方苦參注射液對肝癌細(xì)胞H22荷瘤模型的作用，因此我們通過動物實(shí)驗(yàn)研究復(fù)方苦參注射液對肝癌H22細(xì)胞荷瘤動物模型抑瘤作用及生存期的影響，進(jìn)而探索復(fù)方苦參注射液在治療肝癌上的應(yīng)用前景。

本研究旨在探討復(fù)方苦參注射液抑制小鼠肝癌細(xì)胞H22增殖的影響，為進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠肝癌細(xì)胞株H22購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞資源平臺。復(fù)方苦參注射液購于山西振東制藥公司，國藥準(zhǔn)字號Z14021230，批號20140806。昆明種小鼠172只，雌雄各半，6～8周齡，體重18～22 g，購自北京維通利華試驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，清潔級實(shí)驗(yàn)室喂養(yǎng)。環(huán)磷酰胺粉劑，20 mg/瓶，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司；氟脲嘧啶注射液，10 mL/支，上海旭東海普藥業(yè)有限公司。

1.2 移植瘤模型的建立

先取小鼠4只，體重18～22 g，從液氮罐中取出H22小鼠細(xì)胞株解凍，用無菌生理鹽水稀釋至細(xì)胞濃度為1×106/mL瘤細(xì)胞懸液，在無菌操作下對小鼠進(jìn)行腹腔接種，待腹水生長旺盛時，抽取約3～5 mL腹水（乳白色）放入無菌容器內(nèi)（冰浴袋上操作），加無菌生理鹽水稀釋，然后用細(xì)胞離心機(jī)以轉(zhuǎn)速1 500 r/min離心5 min，用蒸餾水沖洗2次后，收集細(xì)胞，經(jīng)臺盼藍(lán)排斥試驗(yàn)檢查，細(xì)胞成活率95%以上，加無菌生理鹽水調(diào)整為瘤細(xì)胞濃度2×107/mL，然后在小鼠腋下皮下注射，每只接種0.2 mL。

1.3 小鼠H22肝癌實(shí)體瘤的抑瘤作用研究

復(fù)方苦參注射液設(shè)35、30、15、7.5、3.75 g生藥/kg5個劑量組，陽性對照藥環(huán)磷酰胺為30 mg/kg。小鼠右腋皮下無菌接種H22腹水瘤瘤株（含1×106個瘤細(xì)胞/只），接種后次日按體重隨機(jī)分為7組，即：①模型對照組，②環(huán)磷酰胺組，③—⑦復(fù)方苦參注射液35、30、15、7.5、3.75 g生藥/kg。復(fù)方苦參注射液組、環(huán)磷酰胺組、模型對照組均為腹腔注射給藥。各組動物均于接種后24 h開始給藥，復(fù)方苦參注射液各劑量組每日腹腔注射給藥1次，連續(xù)給藥12 d，陽性藥環(huán)磷酰胺隔日腹腔注射給藥1次，共6次。各組小鼠于最后一次藥后24 h稱重、處死小鼠剝離瘤體稱重。計算各組動物的平均瘤重及抑瘤百分率。瘤重抑制率（%）=（模型對照組瘤重-給藥組瘤重）/模型對照組瘤重×100%。

1.4 H22肝腹水癌小鼠生存期研究

復(fù)方苦參注射液第一批試驗(yàn)設(shè)30、15、7.5、3.75、1.88 g生藥/kg 5個劑量組，陽性對照藥氟尿嘧啶劑量為30 mg/kg。小鼠腹腔無菌接種H22肝腹水瘤瘤株（含106瘤細(xì)胞/只），接種后次日按體重隨機(jī)分為7組，即：①模型對照組，②氟尿嘧啶組，③-⑦復(fù)方苦參注射液30、15、7.5、3.75、1.88 g生藥/kg。各組小鼠均于接種后24 h開始給藥，連續(xù)給藥12 d后停藥。復(fù)方苦參注射液組和模型對照組，給藥體積為0.1 mL/10 g體重，1次/d。氟尿嘧啶組隔日腹腔注射給藥1次，0.1 mL/10 g體重。將第1次給藥作為第1天，連續(xù)45 d觀察記錄各組小鼠每日的死亡數(shù)量。若小鼠45 d后未死亡，則存活天數(shù)按45 d計算。生命延長率（%）=（給藥組動物存活天數(shù)-模型對照組動物存活天數(shù)）/模型對照組動物存活天數(shù)×100%。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對研究數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。計量資料以ˉ±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)方苦參注射液對小鼠H22肝癌實(shí)體瘤的抑瘤作用

復(fù)方苦參注射液各劑量組均可明顯抑制小鼠肝癌H22移植性腫瘤的瘤重，經(jīng)方差分析各組數(shù)據(jù)方差齊且組間有差異（與模型對照組比較P＜0.05），瘤重抑制率在39.63～56.71%之間。結(jié)果提示，復(fù)方苦參注射液35、30、15、7.5、3.75 g生藥/kg 5個劑量組對小鼠肝癌H22瘤株均具有明顯的抑瘤作用，且顯示出明顯的量效關(guān)系。試驗(yàn)陽性藥環(huán)磷酰胺30 mg/kg對小鼠肝癌H22移植性腫瘤的抑瘤率為68.90%，顯示出非常顯著的抑瘤作用。見表1。

2.2 復(fù)方苦參注射液對H22肝腹水癌小鼠生存期的影響

復(fù)方苦參注射液各流量組對H22肝腹水癌小鼠的存活天數(shù)有明顯的延長作用，生命延長率可達(dá)57.71～86.28%；經(jīng)方差分析各組數(shù)據(jù)方差齊且組間有差異（與模型對照組比較P＜0.05）。結(jié)果提示復(fù)方苦參注射液有明顯延長肝腹水癌小鼠生存期的作用。陽性藥氟尿嘧啶則可非常顯著延長肝腹水癌小鼠的生存期，對生命的延長率可達(dá)到170.55%。見表2。

表1 復(fù)方苦參注射液對小鼠肝癌H22移植性實(shí)體腫瘤的抑瘤作用

表2 復(fù)方苦參注射液對H22肝腹水癌小鼠生存期的影響

3 討論

復(fù)方苦參注射液是由苦參和白茯苓經(jīng)過提取分離而成的注射劑，其主要成分為苦參堿、氧化苦參堿，槐定堿、氧化槐定堿等［4］。既往研究顯示，苦參堿具有良好的抗小鼠肝癌細(xì)胞增殖的作用［5-8］。

復(fù)方苦參注射液臨床上主要用于中晚期惡性腫瘤患者的治療。主要藥效學(xué)試驗(yàn)及臨床研究結(jié)論：該藥具有較好的鎮(zhèn)痛作用、止血作用，以及抗炎、抗?jié)B出、抗纖維化作用，且毒副反應(yīng)輕微，主要適應(yīng)于輕、中度癌痛［11-12］；對于肝癌［13］、肺癌［14-15］、乳腺癌［2］、消化道腫瘤［16-17］有一定的治療作用，還可以保護(hù)多種臟器免受放化療損傷，作為重度癌痛及癌癥患者的輔助用藥，改善生活質(zhì)量尤為明顯［18-19］。曹軍等［20］觀察復(fù)方苦參注射液聯(lián)合TACE臨床療效及毒副反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)治療組治療中晚期肝癌能明顯緩解肝區(qū)疼痛，提高KPS評分，減輕了藥物的毒副作用、保護(hù)及提高了機(jī)體的免疫功能，改善了患者的生活質(zhì)量。于明磊等［21］發(fā)現(xiàn)復(fù)方苦參注射液能提高肝癌（肝膽濕熱型）TACE治療率，改善生存質(zhì)量，延長生存期，多次治療能提高療效，并且安全可靠，能減輕化療毒副作用。陳國喚等［22］發(fā)現(xiàn)復(fù)方苦參注射液輔助雙介入治療原發(fā)性肝癌可提高遠(yuǎn)期生存率，調(diào)節(jié)免疫水平，改善生活質(zhì)量，減輕不良反應(yīng)。但是復(fù)方苦參注射液對小鼠肝癌荷瘤模型的藥效還缺乏系統(tǒng)的研究。本研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)方苦參注射液也能顯著抑制小鼠肝癌細(xì)胞H22的增殖，與文獻(xiàn)報道相符。但究竟是哪一種成分還是這些成分協(xié)同作用起到了抗腫瘤的作用，尚需進(jìn)一步研究。

為探索復(fù)方苦參注射液在不同濃度和時間下對小鼠肝癌細(xì)胞H22細(xì)胞增殖的影響，我們在實(shí)驗(yàn)中設(shè)置了復(fù)方苦參注射液的不同濃度組，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，復(fù)方苦參注射液總生物堿終濃度在0.5～4 mg/mL條件下，隨藥物濃度的增加、作用時間的延長，對細(xì)胞增殖的抑制率逐漸上升，呈藥物濃度、作用時間依賴。小鼠肝癌細(xì)胞H22細(xì)胞經(jīng)復(fù)方苦參注射液作用24 h后，復(fù)方苦參注射液對小鼠肝癌細(xì)胞H22細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用，作用48 h后抑制作用更加明顯，這可能與藥物可促進(jìn)細(xì)胞凋亡有關(guān)。復(fù)方苦參注射液對小鼠肝癌H22移植性腫瘤具有明顯的抑制作用并能顯著延長生存期，且呈現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系。推測復(fù)方苦參注射液能通過相關(guān)的信號通路誘導(dǎo)H22細(xì)胞凋亡，同時有一定的G1期抑制作用相關(guān)。同時應(yīng)該也有一定的免疫調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，復(fù)方苦參注射液對小鼠肝癌H22移植性腫瘤具有明顯的抑制作用，并能顯著延長H22肝腹水癌小鼠的生存期，呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴性。本結(jié)果為闡明復(fù)方苦參注射液的抗癌作用機(jī)制提供了可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但復(fù)方苦參注射液抑制小鼠肝癌細(xì)胞H22增殖通過什么樣的信號通路在起作用，值得進(jìn)一步研究。