步楠，王燁，王瑞，孫理婷，范彥秋

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是累及直 腸及結(jié)腸黏膜層、黏膜下層的非特異性炎癥性疾病，臨床表現(xiàn)為腹瀉、腹痛、黏液膿血便，病情遷延不愈、治療難度大。腸黏膜Janus激酶2（JAK2）/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子3（STAT3）信號通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)持續(xù)激活以及黏膜上皮細(xì)胞過度凋亡是UC重要的病理特征，抗炎和抗凋亡被認(rèn)為是治療UC的潛在靶點(diǎn)［1-2］。雷公藤多苷（tripterygium glycosides，TG）是從衛(wèi)矛科植物雷公藤根莖中提取得到的活性成分，因其具有免疫調(diào)節(jié)作用被用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療［3］。近年來關(guān)于TG藥理活性作用的研究發(fā)現(xiàn)，TG能夠在包括腸黏膜在內(nèi)的多種組織中發(fā)揮抗炎及抗凋亡作用［4-5］。本研究分析了TG通過JAK2/STAT3信號通路對UC大鼠腸黏膜凋亡及炎癥的調(diào)節(jié)作用，旨在探討TG在UC治療中的價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

40只SPF級的雄性SD大鼠購于購自黑龍江省中醫(yī)藥大學(xué)，許可證號SCXK（黑）2016-004，由佳木斯醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心飼養(yǎng)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

TG、三硝基苯磺酸、乙醇購自Sigma公司；TUNEL試劑盒、Western-blot所用試劑購自上海碧云天公司；Bcl-2、Bcl-xL、Caspase-9、Caspase-3的單克隆抗體購自Abcam公司；酶聯(lián)免疫吸附（Elisa）試劑盒購自上海西唐公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及造模

SD大鼠隨機(jī)分為對照組、UC組、TG組、AG490組，每組各10只。UC組、TG組、AG490組采用三硝基苯磺酸/乙醇灌腸的方式建立UC模型：腹腔注射10%水合氯醛麻醉，按照100 mg/kg的劑量抽取三硝基苯磺酸0.25 mL與0.25 mL的50%乙醇混合，將輸液導(dǎo)管插入肛門上段8 cm后緩慢注入三硝基苯磺酸與乙醇混合液，頭向下倒置3 min后完成造模。對照組采用與UC組、TG組、AG490組相同的方法麻醉，采用0.5mL生理鹽水灌腸后頭向下倒置3 min，完成操作。

1.2.2 給藥方法

造模后第2天開始進(jìn)行藥物干預(yù)，TG組按照27 mg/kg的劑量、0.02 mL/g的體積配置TG溶液灌胃給藥，對照組和UC組給予生理鹽水0.02 mL/g灌胃，AG490組按照8mg/kg的劑量給予AG490腹腔注射。連續(xù)干預(yù)14 d后處死大鼠，收集腸黏膜組織。

1.2.3 細(xì)胞凋亡檢測

取腸黏膜組織，按照TUNEL試劑盒的說明書進(jìn)行染色操作，在顯微鏡下觀察5個隨機(jī)高倍視野，對每個視野內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)及細(xì)胞凋亡數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.2.4 基因表達(dá)的Western-blot檢測

取腸黏膜組織，采用蛋白裂解液提取總蛋白，采用BCA試劑盒對總蛋白進(jìn)行定量，取50μg總蛋白加入預(yù)先配置好的SDS-聚丙烯酰胺凝膠中，垂直電泳后將轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素（NC）膜，NC膜在5%脫脂牛奶中封閉2 h后孵育1∶1 000的Bcl-2、Bcl-xL、Caspase-9、Caspase-3、p-JAK2、p-STAT3、JAK2、STAT3、β-actin單克隆抗體，4℃過夜；TBST洗滌3次后孵育辣根過氧化物酶第二抗體1 h，TBST洗滌3次并加入顯影液，在天能化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中曝光得到Bcl-2、Bcl-xL、Caspase-9、Caspase-3、β-actin的蛋白條帶，用Image-J軟件掃描蛋白條帶的灰度值，計(jì)算Bcl-2、Bcl-xL、Caspase-9、Caspase-3與 βactin的比值作為Bcl-2、Bcl-xL、Caspase-9、Caspase-3的表達(dá)水平，計(jì)算p-JAK2與JAK2、p-STAT3與STAT3的比值作為p-JAK2、p-STAT3的表達(dá)水平。

1.2.5 細(xì)胞因子含量的Elisa檢測

取腸黏膜組織，采用蛋白裂解液提取總蛋白后按照Elisa試劑盒的說明書進(jìn)行操作，檢測組織總蛋白中TNF-α、IL-1β、IL-6的含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件對研究數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。計(jì)量資料以ˉ±s表示，三組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)；兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TG干預(yù)對UC模型大鼠腸黏膜細(xì)胞凋亡率的調(diào)節(jié)

與對照組比較，UC組大鼠腸黏膜細(xì)胞凋亡率明顯升高（P＜0.05）；與UC組比較，TG組大鼠腸黏膜細(xì)胞凋亡率明顯下降（P＜0.05），見圖1。

2.2 TG干預(yù)對UC模型大鼠腸黏膜細(xì)胞凋亡基因表達(dá)的調(diào)節(jié)

與對照組比較，UC組大鼠腸黏膜Bcl-2、Bcl-xL的表達(dá)（圖2）水平明顯下降，Caspase-9、Caspase-3的表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）；與UC組比較，TG組大鼠腸黏膜Bcl-2、Bcl-xL的表達(dá)水平明顯升高，Caspase-9、Caspase-3的表達(dá)水平明顯下降（P＜0.05），見表1。

圖1 三組細(xì)胞凋亡率比較 三組比較，F(xiàn)=121.742、P=0.000；與對照組比較，*P＜0.05；與UC組比較，a P＜0.05

圖2 三組凋亡基因表達(dá)的蛋白電泳圖

表1 三組凋亡基因表達(dá)的比較（ˉ±s）

表1 三組凋亡基因表達(dá)的比較（ˉ±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與UC組比較，#P＜0.05

Bcl-2 Bcl-xL Caspase-9 Caspase-3對照組組別 n 10 1.00±0.13 1.00±0.12 1.00±0.17 1.00±0.14 UC組 10 0.45±0.08* 0.61±0.09* 2.21±0.35* 1.89±0.26*TG組 10 0.77±0.11# 0.83±0.13# 1.56±0.23# 1.41±0.18#F值64.661 29.112 53.847 49.774 P值-0.000 0.000 0.000 0.000-

2.3 TG干預(yù)對UC模型大鼠腸黏膜炎癥細(xì)胞因子含量的調(diào)節(jié)

與對照組比較，UC組大鼠腸黏膜TNF-α、IL-1β、IL-6的含量明顯升高（P＜0.05）；與UC組比較，TG組大鼠腸黏膜TNF-α、IL-1β、IL-6的含量明顯下降（P＜0.05），見表2。

表2 三組炎癥細(xì)胞因子含量的比較（ˉ±s，ng/mL）

表2 三組炎癥細(xì)胞因子含量的比較（ˉ±s，ng/mL）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與UC組比較，#P＜0.05

IL-6對照組組別 n TNF-α IL-1β 10 2.13±0.35 1.32±0.17 0.67±0.09 UC組 10 5.47±0.84*3.36±0.57*2.28±0.36*TG組 10 3.28±0.55#2.03±0.32#1.13±0.18#F值- 76.394 70.524 121.287 P值- 0.000 0.000 0.000

2.4 TG干預(yù)對UC模型大鼠腸黏膜JAK2/STAT3的調(diào)節(jié)

與對照組比較，UC組大鼠腸黏膜p-JAK2、p-STAT3的表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）；與UC組比較，TG組大鼠腸黏膜p-JAK2、p-STAT3的表達(dá)水平明顯下降（P＜0.05），見圖3、表3。

2.5 JAK2/STAT3抑制劑AG490對大鼠腸黏膜細(xì)胞凋亡率、凋亡基因表達(dá)、炎癥細(xì)胞因子含量的調(diào)節(jié)

與UC組比較，AG490組大鼠腸黏膜細(xì)胞凋亡率、Caspase-9及Caspase-3的表達(dá)水平、TNF-α、IL-1β、IL-6的含量均明顯下降，Bcl-2、Bcl-xL的表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05），見圖4、圖5、表4、表5。

圖3 三組JAK2/STAT3表達(dá)的蛋白條帶圖

表3 三組JAK2/STAT3表達(dá)的比較（ˉ±s）

表3 三組JAK2/STAT3表達(dá)的比較（ˉ±s）

注：*與UC組比較，P＜0.05

JAK2 STAT3對照組 10 1.00±0.14* 1.00±0.17組別 n*UC組 10 2.17±0.25 2.36±0.41 TG組 10 1.44±0.17* 1.62±0.28*F值94.387 50.501 P值-0.000 0.000-

圖4 AG490對細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)作用 a與UC組比較，t=7.127，P=0.000

圖5 AG490對凋亡基因表達(dá)調(diào)節(jié)作用的蛋白電泳圖

3 討論

UC的發(fā)病涉及多環(huán)節(jié)、多因素，自身免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)、腸道菌群、遺傳等均被認(rèn)為與疾病的發(fā)生有關(guān)，但具體機(jī)制仍未明確，治療也較為棘手。TG是臨床上用于自身免疫性疾病類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎治療的免疫調(diào)節(jié)藥物，從雷公藤的根莖中提取得到［6-7］。近年來的研究證實(shí)TG不僅具有免疫調(diào)節(jié)活性，還具有抗炎、抗凋亡的作用［4-5］。為了明確TG在UC治療中的價值，本研究首先通過三硝基苯磺酸/乙醇灌腸的方式來建立UC大鼠模型。腸黏膜炎癥反應(yīng)的持續(xù)激活以及黏膜上皮細(xì)胞的過度凋亡是UC重要的病理特征［8-10］，對模型大鼠腸黏膜細(xì)胞凋亡及炎癥的分析顯示：UC組大鼠腸黏膜細(xì)胞凋亡率、促凋亡基因Caspase-9、Caspase-3的表達(dá)、炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的含量均明顯升高，提示三硝基苯磺酸/乙醇灌腸能夠復(fù)制UC病理進(jìn)程中炎癥反應(yīng)激活、細(xì)胞過度凋亡的特征。

表4 AG490對凋亡基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用（ˉ±s）

表4 AG490對凋亡基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用（ˉ±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與UC組比較，#P＜0.05

Bcl-2 Bcl-xL Caspase-9 Caspase-3 UC組 組別 n 10 0.45±0.08 0.61±0.09 2.21±0.35 1.89±0.26 AG490組 10 0.71±0.09 0.80±0.10 1.68±0.24 1.45±0.23 t值6.828 4.466 3.130 4.008 P值-0.000 0.000 0.006 0.001-

表5 AG490對炎癥細(xì)胞因子含量的調(diào)節(jié)作用（ˉ±s，ng/mL）

表5 AG490對炎癥細(xì)胞因子含量的調(diào)節(jié)作用（ˉ±s，ng/mL）

組別 n TNF-α IL-1βIL-6 UC組10 2.13±0.35 1.32±0.17 0.67±0.09 AG490組 10 5.47±0.84 3.36±0.57 2.28±0.36 t值- 11.697 10.846 13.720 P值- 0.000 0.000 0.000

TG具有抗炎和抗凋亡的作用，本研究將TG用于UC模型大鼠的干預(yù)和治療，旨在發(fā)揮該藥物的抗炎和抗凋亡作用。在TG干預(yù)后14天對細(xì)胞凋亡率的觀察結(jié)果如下：TG組大鼠腸黏膜細(xì)胞凋亡率明顯低于UC組，提示TG能夠顯著抑制UC模型大鼠腸黏膜細(xì)胞凋亡。線粒體途徑是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制之一，Bcl-2和Bcl-xL兩種基因的編碼產(chǎn)物定位于線粒體膜，通過抑制線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C向細(xì)胞漿的釋放來抑制Caspase-9及Caspase-3級聯(lián)激活所介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［11-13］，本研究對線粒體途徑凋亡基因表達(dá)的分析顯示：TG組大鼠腸黏膜Bcl-2、Bcl-xL的表達(dá)水平明顯高于UC組，Caspase-9、Caspase-3的表達(dá)水平明顯低于UC組，提示TG能夠調(diào)節(jié)UC模型大鼠腸黏膜細(xì)胞線粒體途徑凋亡基因的表達(dá)、進(jìn)而抑制線粒體途徑所介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

UC病程中腸黏膜的損害及凋亡與炎癥細(xì)胞的大量浸潤、炎癥細(xì)胞因子的大量釋放有關(guān)。TNF-α、IL-1β、IL-6是目前已知與UC發(fā)病密切相關(guān)的炎癥細(xì)胞因子，TNF-α、IL-1β具有強(qiáng)大的促炎活性，既能促進(jìn)多種炎癥細(xì)胞向腸黏膜趨化浸潤，又能參與腸黏膜上皮的損害過程［14-16］；IL-6具有多種生物學(xué)活性，一方面在腸黏膜炎癥的激活中起到級聯(lián)放大作用，另一方面也參與了腸黏膜免疫應(yīng)答紊亂的過程［17-18］。本研究在使用TG干預(yù)后分析了腸黏膜炎癥細(xì)胞因子含量的變化，結(jié)果顯示：TG組大鼠腸黏膜TNF-α、IL-1β、IL-6含量均明顯低于UC組，提示TG能夠抑制UC模型大鼠腸黏膜多種炎癥細(xì)胞因子的釋放，進(jìn)而能夠抑制腸黏膜炎癥反應(yīng)。

JAK2/STAT3是細(xì)胞內(nèi)介導(dǎo)凋亡及炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要通路，JAK2識別細(xì)胞外信號發(fā)生磷酸化激活后能夠使下游STAT3發(fā)生磷酸化，p-STAT3具有轉(zhuǎn)錄激活活性，能夠調(diào)節(jié)下游多種基因的表達(dá)并參與凋亡、炎癥的調(diào)控［19-20］。本研究對腸黏膜JAK2/STAT3通路的分析顯示：UC組腸黏膜p-JAK2、p-STAT3的表達(dá)明顯增多，TG干預(yù)后TG組腸黏膜p-JAK2、p-STAT3的表達(dá)明顯減少，提示JAK2/STAT3通路的激活參與了UC的發(fā)生、TG干預(yù)能夠顯著抑制UC大鼠模型腸黏膜JAK2/STAT3通路的激活。為了進(jìn)一步明確JAK2/STAT3通路對腸黏膜細(xì)胞凋亡及炎癥的直接調(diào)控作用，本研究使用JAK2/STAT3通路抑制劑G490對UC模型大鼠進(jìn)行干預(yù)后發(fā)現(xiàn)：AG490組腸黏膜細(xì)胞凋亡率、Caspase-9及Caspase-3的表達(dá)水平、TNF-α、IL-1β、IL-6的含量均明顯低于UC組，Bcl-2、Bcl-xL的表達(dá)水平明顯高于UC組。這一結(jié)果表明JAK2/STAT3通路直接參與了UC腸黏膜細(xì)胞凋亡及炎癥的調(diào)控，進(jìn)而也提示TG通過該通路調(diào)節(jié)UC腸黏膜細(xì)胞的凋亡及炎癥過程。

綜上所述，TG對UC大鼠腸黏膜的凋亡及炎癥具有顯著的抑制作用，抑制JAK2/STAT3信號通路是TG發(fā)揮抗炎及抗凋亡作用的分子機(jī)制。