童永亮 徐進(jìn) 劉會明 李宏 別一 劉省偉 郭明

(重慶乾泰生物醫(yī)藥有限公司，重慶 400716)

關(guān)鍵字：分類鑒定；座堅殼屬；PF1022A；鑒定結(jié)構(gòu)

Emodepside(艾默德斯)是環(huán)八縮酚酸肽類藥物，是基于PF1022A的半合成衍生物，PF1022A來自菌株Rosellinia的發(fā)酵代謝產(chǎn)物。Emodepside用于線蟲，可抑制寄生線蟲的肌肉蠕動[1-2]，抑制線蟲頭部運動和咽部運動，除此之外還對其他組織有影響，如抑制產(chǎn)卵。Emodepside作用機制[2]主要通過與一組稱為latrophilin[3-4]的G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合，然后通過信號的逐級放大，抑制線蟲體膜相關(guān)蛋白UNC-13介導(dǎo)的囊泡釋放神經(jīng)遞質(zhì)，從而麻痹或抑制線蟲的吞咽，最終導(dǎo)致有機體的死亡。除了與線蟲latrophilin受體結(jié)合，emodepside也與線蟲基因slo-1編碼的BK鉀通道蛋白相互作用[5-6]，這些亞基組在一起形成高電導(dǎo)BK型[7-8]通道的膜電位和細(xì)胞內(nèi)鈣水平的門控，最終導(dǎo)致鉀離子外流，抑制神經(jīng)遞質(zhì)對突觸傳遞，最終肌肉收縮導(dǎo)致線蟲癱瘓或減少吞咽。

Emodepside是由日本制藥公司安斯泰來(Astellas)公司開發(fā)，目前已被拜耳動物保健公司(Bayer Animal Health)用作貓和狗的抗蠕蟲獸藥。2014年12月，拜耳公司與DNDi簽署了一項合作協(xié)議共同開發(fā)emodepside，用于治療人體感染盤尾絲蟲引起的“河盲癥”。于2016年進(jìn)入健康志愿者I期研究，2017年完成了單次遞增劑量研究，2018年底完成了多次遞增劑量研究。DNDi計劃將在非洲開展臨床II期的研究，初步評價emodepside治療人體感染盤尾絲蟲引起的“河盲癥”的安全性和有效性。

本文研究菌株CBR72-MCB-01的分類鑒定以及次級代謝產(chǎn)物PF1022A的結(jié)構(gòu)分析，旨在為抗生素產(chǎn)生菌的開發(fā)和利用奠定基礎(chǔ)，為以后工業(yè)放大生產(chǎn)打下良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種

本實驗室通過紫外誘變分離得到一株高產(chǎn)PF1022A的突變株CBR72-MCB-01，現(xiàn)保藏于重慶乾泰生物醫(yī)藥有限公司。

1.2 主要儀器及試劑

光學(xué)顯微鏡(日本Nikon公司)；MyCyclerTMthermal cycler PCR儀(美國Bio-Rad公司)；Gel Doc?XR System凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)；超凈工作臺(蘇州安泰公司)；生化培養(yǎng)箱(東聯(lián)電子公司)；高速冷凍離心機(美國Thermo Scientific公司)；超低溫冰箱(美國Thermo公司)。

試劑包括真菌基因組DNA提取試劑盒(上海生工公司)；瓊脂糖凝膠DNA片段純化回收試劑盒(上海生工公司)；2×TaqPCR Master Mix(Tiangen公司)；其余試劑均為市售分析純。

1.3 培養(yǎng)基

分類鑒定用培養(yǎng)基采用PDA培養(yǎng)基、MEA培養(yǎng)基和CMM培養(yǎng)基。種子培養(yǎng)基參照文獻(xiàn)[9]配方(g/L)：玉米淀粉10.0、葡萄糖10.0、棉籽餅粉5.0、小麥胚芽5.0、黃豆餅粉5.0、酵母粉5.0、硫酸鎂1.0、氯化鈉2.0和碳酸鈣2.0；發(fā)酵培養(yǎng)基參照文獻(xiàn)[9]配方(g/L)：麥芽糖60.0、豆油10.0、小麥胚芽8.0、黃豆餅粉10.0、酵母粉14.0、硫酸鎂2.0、氯化鈉2.0、碳酸鈣3.0；26度，250r/min搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)12d放瓶。

1.4 培養(yǎng)特征實驗

接種于PDA培養(yǎng)基、MEA培養(yǎng)基和CMM培養(yǎng)基，于26℃培養(yǎng)7d后，記錄菌株的生長狀態(tài)、基內(nèi)菌絲和氣生菌絲的顏色以及是否有可溶性色素產(chǎn)生。

1.5 顯微特征實驗

采用平皿插片法，將突變株45度斜插到PDA培養(yǎng)基 上，26℃培養(yǎng)1周，觀察試驗菌株的基內(nèi)菌絲及氣生菌絲生長特征和孢子的形狀，對試驗菌株進(jìn)行顯微結(jié)構(gòu)鑒定和形態(tài)觀察。

1.6 生理生化特征測定

按照參考文獻(xiàn)[10]規(guī)定的方法，檢測突變株的碳源利用 、氮源的利用和無機鹽利用等特性。

1.7 ITS rRNA基因序列測定及系統(tǒng)發(fā)育分析

參照上海生工真菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取菌株CBR72-MCB-01基因組DNA。合成霉菌ITS rRNA基因的通用引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')和ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')進(jìn)行擴增。反應(yīng)體系：基因組DNA 0.5μL； ITS1 0.5μL； ITS4 0.5μL；2×TaqMasterMix(Dye)25μL；補充超純水到50ul。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性20s，58℃退火20s，72℃延伸40s，共進(jìn)行30個循環(huán)；最后72℃延伸6min。反應(yīng)完畢后凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。反應(yīng)體系經(jīng)PCR片段純化試劑盒純化后，PCR產(chǎn)物送北京六合華大基因科技有限公司單向測序。測得ITS序列通過NCBI網(wǎng)站的BLAST檢索系統(tǒng)進(jìn)行同源序列比對，利用Clustal IW軟件進(jìn)行多序列比對序列分析，采用NJ與MP構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.8 光譜測定

紫外光譜(UV)用島津紫外分光光譜儀(UV,160A Shimadzu)測定，質(zhì)譜(MS)用液質(zhì)聯(lián)用儀(1100 Series LC/MSD)測定，核磁共振(NMR)用Bruker Avance 600核磁共振儀測定(DMSO-d6，TMS為內(nèi)標(biāo))。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)特征

菌株在PDA培養(yǎng)基上，菌落0.3～0.8cm，正面呈白色，表面因具氣生菌絲凸起，反面呈褐色，無氣味，無色素。菌株在MEA培養(yǎng)基上，菌落0.5～1cm，正面呈白色，氣生菌絲較薄，反面呈褐色，無氣味，無色素。菌株在CMA培養(yǎng)基上，不生長。

2.2 形態(tài)特征

斜插法培養(yǎng)突變株，觀察菌絲生長。氣生菌絲纖細(xì) ，菌絲上生有子囊殼，子囊孢子豐富(圖1)。

2.3 菌種鑒定

根據(jù)CBR72-MCB-01菌株的培養(yǎng)特性和形態(tài)特征，與《真菌鑒定手冊》[11]的描述基本一致，將菌株歸屬于座堅殼屬(Rosellinia)。其分類地位是：真菌門(Fungi)、子囊菌綱(Ascomycetes)、鹿角菌目(Xylariales)、鹿角菌科(Xylariaceae)、座堅殼屬(Rosellinia)。

2.4 生理生化特征

最適pH5～8，最適生長溫度24～28℃。能利用葡萄糖、玉米淀粉、可溶性淀粉、麥芽糊精、麥芽糖、乳糖等碳源；利用黃豆餅粉、棉籽餅粉、酵母粉、酵母浸粉、小麥胚芽等有機氮源；利用硫酸鎂、氯化鈉等無機鹽。

圖1 誘變菌株 CBR72-MCB-01菌絲與子囊孢子(×100)Fig.1 Mycelium and spora morphological characteristic of the strain(×100)

2.5 ITS rRNA序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹的建立

以提取的CBR72-MCB-01菌株基因組為模板，擴增ITS間隔區(qū)，通過PCR產(chǎn)物測序，從GenBank數(shù)據(jù)庫調(diào)集的其他菌株的ITS DNA相應(yīng)序列進(jìn)行blast序列比對，菌株CBR72-MCB-01的ITS rRNA序列(465bp)與Roselliniasp.MN140C11T相似性最高，其次是Xylariasp.dx-16T和Fungal endophyte WMS1T?；贗TS rRNA序列，以Roselliniasp.11E045T為基點，采用鄰位連接法(neighbour-joining)將菌株CBR72-MCB-01與其相似菌構(gòu)建進(jìn)化樹(圖2)，結(jié)果顯示菌株CBR72-MCB-01與其相似性最高的菌株Roselliniasp.MN140C11T(相似性最高99%)，Xylariasp.dx-16T和 Fungal endophyte WMS1T建樹不在一起，而在屬簇內(nèi)形成獨立分支，與Roselliniasp.DZ-3-2-1T和Rosellinia aquilaisolate EFS8T進(jìn)化距離較近，初步推斷菌株CBR72-MCB-01可能是屬的新種。

2.6 菌株CBR72-MCB-01的分類鑒定結(jié)果

基于培養(yǎng)特征、生理生化特征確定菌株CBR72-MCB-01屬于座堅殼屬(Rosellinia)，與文獻(xiàn)[12]報道一致，基于ITS rRNA基因序列分析結(jié)果初步推斷菌株CBR72-MCB-01可能是座堅殼屬的新種。

圖2 菌株CBR72 MCB 01基于ITS r RNA序列的以鄰接法進(jìn)化樹分析Fig.2 Neighbour-joing phylogenetic tree based on ITS r RNA gene sequences of strain CBR72-MCB-01 and its closest relative species

2.7 代謝產(chǎn)物液相、質(zhì)譜分析

對CBR72-MCB-01發(fā)酵液進(jìn)行HPLC分析得到色譜圖(圖3)，進(jìn)一步通過制備得到4種化合物的粗品(A～D)。進(jìn)一步通過MS測定，得到化合物A～D的分子量依次為987.46、895.43、971.46和1047.48，只有化合物C符合PF1022A鈉鹽的分子量，與文獻(xiàn)[13]報道的一致(圖4～7)。

2.8 結(jié)構(gòu)鑒定

對分子量971.46的化合物C通過核磁共振確定結(jié)構(gòu)，1H和13C核磁共振(NMR)(表1)無畸變極化轉(zhuǎn)移增強譜(DEPT90和135)、同核化學(xué)位移相關(guān)譜(H-HCOSY)、異核多量子相關(guān)譜(HSQC)及異核多鍵遠(yuǎn)程相關(guān)譜(HMBC)的測定圖略。

圖3 CBR72-MCB-01發(fā)酵液HPLC圖譜Fig.3 HPLC analyses of the fermentation broth of CBR72-MCB-01

圖4 化合物A質(zhì)譜分析圖Fig.4 MS spectrum of the compound A

圖5 化合物B質(zhì)譜分析圖Fig.5 MS spectrum of the compound B

圖6 化合物C質(zhì)譜分析圖Fig.6 MS spectrum of the compound C

圖7 化合物D質(zhì)譜分析圖Fig.7 MS spectrum of the compound D

表1 化合物C的13C和1H-NMR 化學(xué)位移值的歸屬Tab.1 1H-NMR and 13C-NMR data assignments of the compound C

續(xù)表1

化合物C的紫外、質(zhì)譜以及核磁共振的1H NMR譜和13C NMR譜的數(shù)據(jù)均與對照品PF1022A基本一致，且核磁共振數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)中報道[14]的PF1022A一致，可以確認(rèn)化合物C與PF1022A同質(zhì)，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖8。

3 討論

本實驗室通過紫外誘變篩選到一株高產(chǎn)PF1022A菌株，通過形態(tài)觀察、生理生化特征鑒定、ITS基因序列對比及系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析等相結(jié)合方法，鑒定突變株CBR72-MCB-01屬于座堅殼屬(Rosellinia)。通過培養(yǎng)突變株CBR72-MCB-01得到發(fā)酵液。進(jìn)一步通過LC-MS、1H NMR和13C NMR、DEPT90和135、1H-1HCOSY、HMQC、HMBC分析測定，確定突變株CBR72-MCB-01代謝產(chǎn)物符合PF1022A的結(jié)構(gòu)特征。

圖8 化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.8 Structure of PF1022A

PF1022A是合成emodepside必不可少的前體物質(zhì)，本實驗室通過發(fā)酵提取純化而得到，相比化工直接合成PF1022A，優(yōu)點是工藝簡單、成本低、污染少，因此廣受關(guān)注。公司開發(fā)此項目，旨在為獸藥產(chǎn)生菌的開發(fā)和利用奠定基礎(chǔ)，為以后的工業(yè)化放大提供依據(jù)。

Emodepside是一種有效的驅(qū)蟲藥，與吡喹酮聯(lián)合使用控制貓和狗的寄生蟲感染。目前國內(nèi)研究較少，由于emodepside潛在的治療盤尾絲蟲病臨床價值，加上emodepside目前已批準(zhǔn)的化合物[15]、制備[16-17]、部分劑型[18-19]、部分晶型[20]和部分用途已經(jīng)公開，另外吡喹酮和環(huán)縮肽類(包括emodepside)的藥物組合物[21-22]也已經(jīng)公開，所以在中國仿制emodepside的原料藥和部分劑型侵權(quán)較小。