劉 秀，鄭宜令，李艷秋，范亞軍

（長春師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，長春 130032）

多胺作為一類帶正電荷的小分子脂肪族化合物，廣泛存在于原核生物與真核生物體內(nèi)，在微生物細(xì)胞中多胺參與細(xì)菌的增殖與分化，維持細(xì)胞膜及核酸的穩(wěn)定性［1］。在酸性條件下，多胺通過控制轉(zhuǎn)錄與翻譯過程誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生精氨酸脫羧酶（adiA）、鳥氨酸脫羧酶（speF）和賴氨酸脫羧酶（cadA），并進(jìn)一步誘導(dǎo)產(chǎn)生多胺以適應(yīng)酸性條件［2，3］。 Tkachenko 等［4］的研究結(jié)果表明，多胺可以通過上調(diào)rpoS、rmf、yqjD基因的表達(dá)促進(jìn)抗生素條件下休眠細(xì)胞的形成，促使細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性，可見多胺參與細(xì)菌的多種應(yīng)激過程。

在高等植物體內(nèi)，多胺在多個(gè)方面參與植物的生長過程［5-7］。 Ahmed 等［8］通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究表明，過表達(dá)多胺轉(zhuǎn)運(yùn)基因OsPUT1的擬南芥與野生型相比延遲開花16 d，而多胺轉(zhuǎn)運(yùn)put5基因突變株比野生型提前開花4 d，表明多胺在影響植物生長發(fā)育及形態(tài)建成方面具有非常重要的作用。不僅如此，近年來的研究發(fā)現(xiàn)，多胺參與植物非生物脅迫條件下的抗逆調(diào)節(jié)，外源多胺能夠降低干旱、澇害、鹽脅迫等對(duì)植物造成的傷害［9-13］。

在前期研究工作中，作者所在項(xiàng)目組利用精氨酸為惟一氮源從羊草根際土壤中篩選出一株對(duì)植物具有促生作用的陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）菌株DM，促生試驗(yàn)結(jié)果表明該菌能夠顯著提高西紅柿苗在NaCl脅迫條件下的抗逆能力，結(jié)合外源多胺與植物抗逆關(guān)系的報(bào)道，項(xiàng)目組推測陰溝腸桿菌菌株DM在脅迫條件下產(chǎn)生的多胺成分發(fā)生變化，進(jìn)而影響植物逆境條件下的生長發(fā)育。本研究對(duì)不同脅迫條件下該菌產(chǎn)多胺成分進(jìn)行了初步分析，為進(jìn)一步明確其促生作用機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株 所用植物促生菌為陰溝腸桿菌菌株DM，由作者所在實(shí)驗(yàn)室篩選、鑒定并保存。

1.1.2 試劑 試驗(yàn)所用腐胺、亞精胺、精胺標(biāo)準(zhǔn)品均購自Solarbio科技有限公司；苯甲酰氯購自Aladdin試劑公司；乙腈、甲醇購自美國Fisher公司；乙醚購自北京精細(xì)化學(xué)品有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基 ①ADF液體培養(yǎng)基。KH2PO44 g，Na2HPO46 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，葡萄糖 2 g，葡萄糖酸 2 g，檸檬酸 2 g，精氨酸 2 g，pH 7.2，定容至 1 L，高壓滅菌后備用。②ADF固體培養(yǎng)基。ADF液體培養(yǎng)基1 L加入15 g瓊脂粉，高壓滅菌后備用。③含不同NaCl濃度ADF培養(yǎng)基。取等體積ADF培養(yǎng)基，加入不同質(zhì)量 NaCl， 使其終濃度分別為 50、100、150、200、250、300 mmol／L，高壓滅菌后備用。 ④不同 pH的ADF培養(yǎng)基。取等體積ADF培養(yǎng)基，分別調(diào)節(jié)pH 至 5、6、7、8、9、10，高壓滅菌后備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌體培養(yǎng) 從-70℃冰箱取出凍存菌種，在ADF固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)12～16 h。挑取單菌落于10 mL液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12～16 h。吸取等量菌液接種于不同pH及不同NaCl濃度的培養(yǎng)基中培養(yǎng)（每個(gè)梯度重復(fù)5次）12～16 h。吸取菌液100 μL加入96孔板，利用酶標(biāo)儀測定吸光度OD600nm（每個(gè)梯度重復(fù)3次）。

1.2.2 多胺衍生 DM菌體10 000×g離心5 min，收集上清液，將上清液于-70℃冰箱中過夜冷凍。用冷凍真空干燥儀冷凍72 h，將樣品凍干，用5 mL去離子水溶解凍存液，取2 mL進(jìn)行衍生試驗(yàn)。2 mL樣品置于10 mL離心管中加入1 mL氫氧化鈉（2 mol／L）、20 μL苯甲酰氯，漩渦混勻30 s，置于37℃水浴20 min，中間每隔5 min振蕩30 s。衍生完畢后加入1 g氯化鈉，2 mL乙醚，漩渦振蕩混勻30 s靜置，溶液分層后將乙醚層移至5 mL離心管中，用氮?dú)獯蹈伞＜尤? mL甲醇溶解，用濾膜抽濾，作為液相色譜分析上樣。

1.2.3 多胺標(biāo)準(zhǔn)品的衍生及萃取 準(zhǔn)確稱取腐胺、亞精胺及精胺分別配制各樣品1 mg／mL儲(chǔ)備液，稀釋各儲(chǔ)備液至0.1 mg／mL工作液。將稀釋后的工作液進(jìn)行衍生和萃取，吹干后加入1 mL甲醇溶解，用濾膜抽濾后備用。

1.2.4 高效液相色譜檢測標(biāo)準(zhǔn)品及樣品 柱溫為室溫；流動(dòng)相為 A（乙腈）、B（H2O），檢測波長為 254 nm；進(jìn)樣量為 10 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同NaCl濃度對(duì)DM菌體濃度的影響

等體積不同NaCl濃度ADF培養(yǎng)基接種相同體積的DM菌液，每個(gè)NaCl濃度重復(fù)5次，培養(yǎng)12～16 h后測定菌體OD600nm。 結(jié)果（圖1）表明，加入NaCl后 OD600nm下降，NaCl 濃度在小于 200 mmol／L時(shí)菌體OD600nm變化不大；NaCl濃度高于200 mmol／L時(shí)，OD600nm明顯下降。

圖1 不同NaCl濃度對(duì)DM菌體濃度的影響

2.2 不同pH對(duì)DM菌體濃度的影響

等體積不同pH的ADF培養(yǎng)基接種相同體積的DM菌液，每個(gè)pH重復(fù)5次，培養(yǎng)12～16 h后測定菌體OD600nm。結(jié)果（圖2）表明，DM菌在pH 7時(shí)菌體濃度最高，在酸性及堿性條件下菌體生物量下降。

2.3 不同NaCl濃度對(duì)DM菌產(chǎn)多胺的影響

菌體離心后將上清液凍干，按常規(guī)方法進(jìn)行衍生及萃取，甲醇溶解后進(jìn)行液相色譜分析。結(jié)果（圖3）表明，DM促生菌在對(duì)照組中（NaCl濃度為0）可檢出腐胺、亞精胺及精胺，其中以亞精胺含量較高，菌液中腐胺、亞精胺含量隨著培養(yǎng)基中NaCl濃度的升高而增加；結(jié)合定量分析結(jié)果可知，NaCl濃度為150 mmol／L時(shí)多胺濃度達(dá)到高峰值，隨后下降。

圖2 不同pH對(duì)DM菌體濃度的影響

2.4 不同pH對(duì)DM菌產(chǎn)多胺的影響

高效液相色譜檢測不同pH條件下DM菌產(chǎn)多胺成分的變化，通過與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比，pH 5的培養(yǎng)液上樣10 μL幾乎不能檢出腐胺，但可檢出亞精胺和精胺；pH 6、7的培養(yǎng)液中可檢出3種多胺，pH 8時(shí)亞精胺和腐胺含量達(dá)到高峰，隨后開始下降（圖4）。

圖3 液相色譜檢測不同NaCl濃度條件下DM菌產(chǎn)多胺成分變化

3 討論

圖4 液相色譜檢測不同pH條件下DM菌產(chǎn)多胺成分變化

近年的研究表明，多胺參與植物非生物脅迫條件下的抗逆調(diào)節(jié)，其通過與多胺轉(zhuǎn)運(yùn)體共同決定植物體內(nèi)多胺的穩(wěn)態(tài)，并進(jìn)一步激活或抑制基因表達(dá)調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育［7］。體外噴施亞精胺能抑制水脅迫下膜透性的增加［9］；腐胺可以降低鎘金屬脅迫對(duì)植物的損傷，同時(shí)腐胺可能參與協(xié)調(diào)植物螯合肽的生物合成來參與植物的應(yīng)激反應(yīng)［10］。另外多胺能夠清除植物體內(nèi)氧自由基，提高超氧化物歧化酶（SOD）及過氧化物酶（POD）活性，降低膜脂過氧化作用，減緩葉片衰老，抵御干旱及鹽脅迫，提高番茄高溫脅迫下花粉萌發(fā)率［12，13］。 本研究所用植物促生菌為陰溝腸桿菌菌株DM，前期的研究表明該菌在鹽脅迫條件下具有明顯的促生作用（尚未發(fā)表），為了進(jìn)一步明確該菌的促生機(jī)制，本研究利用高效液相色譜對(duì)不同脅迫條件下該菌產(chǎn)多胺成分進(jìn)行了初步分析，在NaCl脅迫下，培養(yǎng)液中NaCl濃度影響DM菌生物量，隨著NaCl濃度升高，菌液中腐胺、亞精胺、精胺濃度升高，在150 mmol／L NaCl培養(yǎng)液中3種多胺濃度均最大，之后多胺濃度隨NaCl濃度升高而降低。在酸性（pH 5、6）培養(yǎng)液中多胺含量明顯低于中性培養(yǎng)基，但在pH 8培養(yǎng)液中腐胺、亞精胺濃度最高，隨后降低。結(jié)合DM菌在鹽脅迫條件下的促生作用，其促生機(jī)制可能由于DM菌在鹽脅迫條件下進(jìn)行應(yīng)激反應(yīng)而產(chǎn)生3種多胺，所產(chǎn)生的多胺作為外源多胺進(jìn)一步作用于植物，影響植物的生長發(fā)育，但其確切的分子機(jī)制，如多胺轉(zhuǎn)運(yùn)酶的變化，DM菌在脅迫條件下與多胺合成相關(guān)的機(jī)制需要進(jìn)一步研究。