李丹丹 劉蛟 王英群

摘要：為評(píng)估PTD-FNK蛋白對(duì)豬精子凍后質(zhì)量的影響，以探討其可能的作用機(jī)制。在豬精液冷凍稀釋液中添加不同濃度（0、0.1、1、10、100 nmol/L）的PTD-FNK蛋白，采用精子圖像分析儀分析凍后豬精子的質(zhì)量，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)凍后精子Annexin V-FITC/PI染色后的凋亡情況，利用相對(duì)熒光定量PCR和多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)不同凋亡途徑中精子相關(guān)基因的表達(dá)量變化或含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（caspase）的活性和染色后線粒體mPTP開放性。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，10 nmol/L PTD-FNK蛋白試驗(yàn)組豬精子凍后活性、活率和頂體完整率均顯著升高（P<0.05，P<0.01），凋亡率和Bax、caspase-3、caspase-9基因表達(dá)量、caspase-9蛋白酶活性、mPTP開放性均顯著降低（P<0.05）。說明PTD-FNK可能通過線粒體內(nèi)源性凋亡途徑抑制凍融豬精子的凋亡。

關(guān)鍵詞：PTD-FNK;豬;精子;凋亡;冷凍保護(hù)

中圖分類號(hào)： S828.3+4? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號(hào)：1002-1302（2019）11-0217-05

隨著人工授精技術(shù)成為現(xiàn)代常見的輔助生殖技術(shù)，冷凍精液技術(shù)得到廣泛應(yīng)用，提高冷凍精液質(zhì)量也就成為當(dāng)今研究熱點(diǎn)。自1975年起，豬精子冷凍方面的研究開始出現(xiàn)，近幾年豬精液冷凍快速發(fā)展，技術(shù)不斷提高，但在公豬育種的商業(yè)化進(jìn)程中未取得相應(yīng)的進(jìn)展[1]，且豬冷凍精液的人工授精使用率僅約1%。精子在液氮保存下，代謝水平低，其活力幾乎處于停滯水平，解凍后能使其恢復(fù)活力而又不失去在母畜體內(nèi)的受精能力。但低溫冷凍對(duì)精子的損傷較大，導(dǎo)致精子活力降低，僅有50%的精子存活，而存活的精子活力不能達(dá)到人工授精標(biāo)準(zhǔn)[2]。豬精液對(duì)環(huán)境變化非常敏感[3]，技術(shù)仍有許多急需攻克的難關(guān)，與實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用仍有一定差距，所以關(guān)于改進(jìn)豬精子低溫保存條件，發(fā)現(xiàn)冷凍保存破壞精子細(xì)胞功能的機(jī)制就成為現(xiàn)今需要解決的問題。在人工受精的應(yīng)用上，冷凍精液與新鮮精液相比，受胎率和窩產(chǎn)仔數(shù)都出現(xiàn)下降現(xiàn)象。因此，為提高凍后精子質(zhì)量，應(yīng)尋求一種更為有效的稀釋液。

PTD-FNK蛋白是人工構(gòu)建的抗凋亡蛋白[4]，其對(duì)不同類型細(xì)胞（神經(jīng)元、軟骨細(xì)胞、肝細(xì)胞、骨髓單核細(xì)胞等）受到的多種損傷刺激都有較好的防御作用，包括保護(hù)冷凍、解凍對(duì)細(xì)胞的損傷[5]。添加300 nmol/L PTD-FNK蛋白是有效提高豬精子抗凍能力的方法[6]，但其蛋白產(chǎn)量小且用量多。故本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過多重努力，成功構(gòu)建并可溶性表達(dá)PTD-FNK蛋白，得到有生物活性的PTD-FNK蛋白[7]。

根據(jù)含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（caspase）不同激活途徑，將凋亡激活途徑分為3種，死亡受體途徑（caspase-8）、線粒體途徑（caspase-9）以內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑（caspase-12）[8]。內(nèi)源性線粒體途徑主要通過活化caspase-9，進(jìn)一步激活caspase-3而產(chǎn)生caspase的一系列級(jí)聯(lián)效應(yīng);外源性死亡受體途徑，影響因子主要包括Fas和TNF等，產(chǎn)生有活性的caspase-8激活下游caspase級(jí)聯(lián)效應(yīng);與線粒體途徑同屬于內(nèi)源性細(xì)胞凋亡途徑的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑，通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激反應(yīng)已經(jīng)對(duì)鈣離子的調(diào)控參與細(xì)胞凋亡活動(dòng)[9]。3個(gè)途徑共同參與凋亡信號(hào)的傳導(dǎo)，引起細(xì)胞嚴(yán)重凋亡。本研究通過Annexin V-FITC/PI染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，相對(duì)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)不同凋亡途徑中相關(guān)凋亡基因的表達(dá)量，借助caspase的活性初步判斷PTD-FNK保護(hù)凍融精子的路徑，并進(jìn)一步檢測(cè)該路徑膜孔道的變化，進(jìn)而分析確定PTD-FNK保護(hù)凍融豬精子的主要途徑，初步探索PTD-FNK蛋白對(duì)凍融精子的保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

PTD-FNK蛋白，由廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院解剖實(shí)驗(yàn)室保存提供。caspase-8、caspase-9熒光檢測(cè)試劑盒，購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司;caspase-12 Fluorometric Assay Kit，購自BioVision公司;BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒和細(xì)胞線粒體分離試劑盒，均購自碧云天生物技術(shù)研究所;純化線粒體膜通道孔（mPTP）熒光檢測(cè)試劑盒，均購自美國Genmed公司;FITC Apoptosis Detection KitⅠ，購自美國BD公司;HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR，購自南京諾唯贊生物科技有限公司;SYBR Premix DimerEraserTM（Perfect Real Time），購自TaKaRa公司。

Digitcool程序化自動(dòng)冷凍儀及SCA自動(dòng)精液分析儀，購自法國卡蘇公司;SD-2數(shù)碼液晶顯微鏡，購自深圳泰宇星光電儀器有限公司;Tecan Infinite 200 Pro多功能酶標(biāo)儀，購自瑞士Tecan公司;BD AccuriTM C6流式細(xì)胞儀，購自美國BD公司;CFX96 TouchTM熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)，購自BIO-RAD公司。

1.2 精液采集

精液采自廣西科達(dá)畜禽改良有限責(zé)任公司的健康、正常采精的長白（Landrace）種公豬。經(jīng)常溫稀釋液1 ∶ 1等溫稀釋后，0.5 h內(nèi)運(yùn)至廣西畜禽品種改良站實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。選取鏡檢活力>0.8的精液，冷凍保存。

1.3 冷凍稀釋液配制

冷凍基礎(chǔ)液（TCG）：葡萄糖60 nmol/L，檸檬酸 75 nmol/L，Tris 200 nmol/L，1%青鏈霉素，調(diào)節(jié)pH值至6.8，0.22 μm濾器過濾后置于4 ℃保存。冷凍Ⅰ液：將80%TCG液和20%卵黃液（新鮮卵黃10 000 r/min離心15 min后取上清液待用）充分混合攪拌均勻;取冷凍Ⅰ液，分別加入PTD-FNK蛋白，使得PTD-FNK蛋白終濃度為0.1、1、10、100 nmol/L。冷凍Ⅱ液：91%TCG液與9%甘油上下顛倒充分混合。

1.4 精液的冷凍與解凍

將精液1 200 r/min離心6 min，去上清，取精液與冷凍Ⅰ液等體積混勻，置于常溫下孵育30 min，加入同等體積的冷凍Ⅱ液，使精液、冷凍Ⅰ液和冷凍Ⅱ液的比例為1 ∶ 1 ∶ 1，分裝于0.25 mL塑料細(xì)管封口，2 h內(nèi)按預(yù)設(shè)溫度梯度降溫至 5 ℃，置5 ℃平衡2 h。將細(xì)管取出，檢查平衡后活力合格，放入程序降溫儀內(nèi)，程序運(yùn)行結(jié)束后，馬上將細(xì)管投入液氮保存。解凍時(shí)，將細(xì)管投入62 ℃水中5 s，輕輕晃動(dòng)。擦除表面水珠，并剪開兩端。

1.5 精子質(zhì)量檢測(cè)

1.5.1 精子活力、活率 各取10 μL凍融精液于37 ℃預(yù)熱的載玻片上，使用精子圖像分析儀進(jìn)行分析。

1.5.2 頂體完整性 取凍后精子于3.7%多聚甲醛中固定，考馬斯亮藍(lán)染色后，取20 μL精子懸液置于血球計(jì)數(shù)板上，隨機(jī)選取400×普通光學(xué)顯微鏡5個(gè)視野進(jìn)行觀察，計(jì)算200個(gè)以上精子的頂體完整率。

1.5.3 質(zhì)膜完整性 取果糖-檸檬酸鈉低滲溶液稀釋將解凍后的精子稀釋，并將精子密度調(diào)整為1×106個(gè)/mL，37 ℃下孵育30 min后，取20 μL精子懸液置于血球計(jì)數(shù)板上，隨機(jī)選取400×普通光學(xué)顯微鏡5個(gè)視野進(jìn)行觀察，計(jì)數(shù)200個(gè)以上精子的質(zhì)膜完整性。

1.6 FITC Annexin V/PI雙標(biāo)記檢測(cè)精子凋亡

根據(jù)FITC Annexin V/PI雙標(biāo)記試劑盒說明，預(yù)冷PBS洗滌精子2次后，以1×的結(jié)合緩沖液重懸精子，并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL。取100 μL精子懸液，分別加入5 μL FITC Annexin V和5 μL PI混勻，避光室溫孵育15 min，再加入400 μL 1×結(jié)合緩沖液，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)每個(gè)精子的前向角散光（ESC）和側(cè)向角散光（SSA）。用波長為520 nm通帶濾器檢測(cè)FITC熒光（FL1），波長>610 nm濾器檢測(cè)PI（FL3），每樣本收集20 000個(gè)精子熒光信號(hào)。采用BD AccuriTM C6自帶軟件初步分析，F(xiàn)low-jo軟件分析流式結(jié)果并作圖。

1.7 總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄

取凍融后的精子，用Trizol法提取RNA，RNase free ddH2O溶解，測(cè)D260 nm值為1.8～2.0可用。用HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR[+gDNA wiper（基因組消除酶）]進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，樣品于 -80 ℃ 保存待用。

1.8 qRT-PCR

選取NCBI上豬精子凋亡部分基因的cDNA序列設(shè)計(jì)引物，以β-actin為基因。相關(guān)引物信息見表1。用SYBR Premix DimerEraserTM進(jìn)行Real Time PCR。反應(yīng)體系：SYBR Premix DimerEraser（2×）12.50 μL，上、下游引物各0.75 μL，cDNA模板2.00 μL，加ddH2O至25.00 μL體系。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃變性5 s，退火30 s（Tm均為60 ℃），72 ℃ 延伸30 s，45個(gè)循環(huán)，退火并收集熒光，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.9 凍融精子Caspase蛋白酶活性檢測(cè)

取凍融后的精子，PBS洗滌2次，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為5×106個(gè)，加入200 μL預(yù)冷的裂解液，充分裂解離心后使用BCA法測(cè)定蛋白濃度。吸取30 μL含100 μg蛋白的裂解液上清，參照caspase熒光檢測(cè)試劑盒加入反應(yīng)液，37 ℃下孵育1.5 h，使用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定3條通路關(guān)鍵caspase（caspase-8、caspase-9、caspase-12）的熒光強(qiáng)度（激發(fā) λ=485 nm，發(fā)射λ=535 nm）。

1.10 凍融精子線粒體膜通道孔開放性檢測(cè)

取凍融后的精子，預(yù)冷PBS洗滌后，參照線粒體分離試劑盒說明進(jìn)行精子線粒體的提取，取100 μL線粒體樣本（總含量0.2 mg），按照純化線粒體膜通道孔熒光檢測(cè)試劑盒說明加入反應(yīng)液染色，移取100 μL懸液到黑色96孔板，置于多功能酶標(biāo)儀中檢測(cè)RFU的變化（激發(fā)λ=488 nm，發(fā)射λ=525 nm）。

1.11 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0進(jìn)行多重分析，試驗(yàn)結(jié)果以“x±s”表示，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。采用Excel軟件和Flow jo軟件分析結(jié)果并作圖。qRT-PCR以 β-actin 作為內(nèi)參基因，試驗(yàn)組各基因的相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCT法計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 PTD-FNK蛋白對(duì)豬精子凍后質(zhì)量的影響

由表2可知，與對(duì)照組精子活力相比，0.1 nmol/L組無顯著差異（P>0.05），1、10、100 nmol/L組顯著升高（P<0.05）。與對(duì)照組活率相比，0.1 nmol/L組無顯著差異（P>0.05），1、100 nmol/L組顯著升高（P<0.05），10 nmol/L組有極顯著升高（P<0.01）。與對(duì)照組相比， 0.1、 1、100 nmol/L組的頂體完整率無顯著差異（P>0.05），10 nmol/L組顯著升高（P<0.05）。與對(duì)照組精子質(zhì)膜完整性相比，各試驗(yàn)組均無顯著差異（P>0.05）。

2.2 PTD-FNK蛋白對(duì)凍后精子凋亡的影響

由圖1可知，其中Q1：AV+-PI+內(nèi)為已經(jīng)壞死的精子，Annexin V和PI均為陽性，該象限內(nèi)精子質(zhì)膜的完整性還是在一定程度上得到維持但質(zhì)膜滲透性受到損傷;Q2：AV--PI+為凋亡晚期精子，該象限內(nèi)精子質(zhì)膜結(jié)構(gòu)可能已被打破或丟失，質(zhì)膜結(jié)構(gòu)已不完整，導(dǎo)致Annexin V反應(yīng)呈現(xiàn)陰性;Q3：AV+-PI-為凋亡早期精子，有活性的精子，Annexin V為陽性而PI為陰性，該象限內(nèi)的精子仍處于完整的質(zhì)膜結(jié)構(gòu)狀態(tài)，但是質(zhì)膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸（PS）部分已經(jīng)開始轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜的外側(cè)，呈現(xiàn)出早期凋亡狀態(tài);Q4：AV--PI-為凋亡早期精子，Annexin V和PI均為陰性，該象限內(nèi)質(zhì)膜的結(jié)構(gòu)和功能都保持完好?？梢?，添加PTD-FNK蛋白10 nmol/L試驗(yàn)組的凋亡率（Q2+Q3）顯著低于對(duì)照組（P<0.05）。

2.3 PTD-FNK蛋白對(duì)凍后精子凋亡相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響

采用β-actin基因作為管家基因，對(duì)照組各基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量均以1表示，比較各試驗(yàn)組與對(duì)照組凋亡相關(guān)基因mRNA表達(dá)的差異。由圖2可知，10 nmol/L試驗(yàn)組caspase-3及caspase-9表達(dá)量顯著下降（P<0.05），Bax表達(dá)量極顯著下降（P<0.01），死亡受體通路關(guān)鍵基因 csapase-8表達(dá)量與對(duì)照組相比無顯著差異（P>0.05）。

2.4 PTD-FNK蛋白對(duì)凍后精子caspase活性的影響

由圖3可知，與對(duì)照組相比，10 nmol/L試驗(yàn)組凍后精子線粒體通路關(guān)鍵蛋白酶caspase-9活性顯著下降（P<0.05），而死亡受體通路關(guān)鍵蛋白酶caspase-8及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路關(guān)鍵蛋白酶caspase-12活性無顯著差異（P>0.05）。

2.5 PTD-FNK蛋白對(duì)凍后精子mPTP通道開放性的影響

由線粒體膜內(nèi)外成分構(gòu)成的線粒體膜通道（mitochondrial permeability transition pore，mPTP）是非特異性鈣離子依賴性通道。在凋亡細(xì)胞，線粒體內(nèi)容物可通過mPTP釋放到胞漿中。線粒體膜通道的持續(xù)開放可導(dǎo)致細(xì)胞色素C釋放至細(xì)胞漿中，并造成細(xì)胞線粒體跨膜電位的降低。鈣黃綠素-AM是一種熒光探針，當(dāng)探針進(jìn)入線粒體后會(huì)被內(nèi)酯酶切離而被線粒體俘獲，從而產(chǎn)生熒光較強(qiáng)的鈣黃綠素。存在于線粒體外的鈣黃綠素可以利用離心或者鈷離子淬滅，檢測(cè)線粒體內(nèi)鈣黃綠素?zé)晒鈴?qiáng)度變化可以間接表明mPTP開放程度。由圖4可知，與對(duì)照組相比，10 nmol/L PTD-FNK蛋白組凍后精子線粒體膜通道孔開放性檢測(cè)結(jié)果RFU值顯著升高（P<0.05）。

3 討論

本試驗(yàn)從凍融精子的表觀質(zhì)量出發(fā)，以Annexin V/PI染色及mRNA表達(dá)量為基礎(chǔ)，篩選PTD-FNK蛋白對(duì)冷凍子保護(hù)的最優(yōu)濃度，通過caspase的活性初步篩選PTD-FNK保護(hù)凍融精子的路徑，并進(jìn)一步檢測(cè)該路徑膜通道的變化，初步探索PTD-FNK蛋白對(duì)凍融精子的保護(hù)機(jī)制。有研究表明，凍融豬精子質(zhì)膜、頂體和線粒體等結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，精子結(jié)構(gòu)的完整性遭到一定程度破壞，影響到了精子的正常代謝及正常生理功能的發(fā)揮，進(jìn)而影響到受精能力[10]。由表2可知，與對(duì)

照組相比，PTD-FNK蛋白的凍融豬精子的活力、活率、頂體完整率均顯著升高，說明10 nmol/L PTD-FNK蛋白就能夠有效保護(hù)凍融豬精子。而當(dāng)其濃度升高至 100 nmol/L 時(shí)，與對(duì)照組并無顯著性差異。這與Shimokawa等研究的 300 nmol/L 的最優(yōu)濃度[6]相比，PTD-FNK蛋白的使用量明顯減少。

細(xì)胞凋亡是一個(gè)復(fù)雜的過程，包括誘導(dǎo)、執(zhí)行及降解3個(gè)主要步驟，質(zhì)膜磷脂酰絲氨酸（PS）位置的外移[11]是細(xì)胞凋亡過程中的特征性現(xiàn)象[12]。由圖1可知，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)PS與Annexin-V的結(jié)合以及PI檢測(cè)，添加10 nmol/L PTD-FNK蛋白使豬凍融精子的凋亡比率顯著降低，說明其在該濃度下可抑制凍融豬精子的凋亡，該結(jié)果與表觀質(zhì)量結(jié)果相吻合。研究表明，由線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡途徑中[13]，Bax可以促進(jìn)mPTP的開放而促進(jìn)凋亡[14]。由圖2中的mRNA表達(dá)量可知，添加10 nmol/L PTD-FNK蛋白對(duì)線粒體通路相關(guān)基因Bax和caspase-9有明顯的下調(diào)作用。下游基因凋亡執(zhí)行者caspase-3是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵之一，它的激活標(biāo)志著細(xì)胞凋亡進(jìn)入不可逆的進(jìn)程[15]。

由上述幾個(gè)結(jié)果推測(cè)，10 nmol/L是PTD-FNK的最優(yōu)濃度，能夠有效地抑制凍融豬精子凋亡，同時(shí)提示其保護(hù)作用可能與線粒體內(nèi)源性途徑有關(guān)。細(xì)胞凋亡是影響凍后精子質(zhì)量的主要因素，它顯著影響凍后精子的活力，caspase高活性表達(dá)的精子預(yù)示其對(duì)抗低溫環(huán)境的能力也較弱[16]，結(jié)合前面的研究，選取最優(yōu)濃度10 nmol/L為研究濃度，以及caspase系列3個(gè)通路代表檢測(cè)其蛋白酶活性。同時(shí)，有研究表明冷凍損傷造成的凋亡不涉及非caspase蛋白酶為依賴途徑，而是由線粒體途徑介導(dǎo)[17]。由圖3可知，線粒體的代表蛋白酶caspase-9也發(fā)生明顯下調(diào)。值得注意的是，caspase-8不管在蛋白酶活性或者基因表達(dá)量上均與對(duì)照組無顯著性差異，這與Shimokawa等的研究[6]是一致的。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡途徑中caspase-12起著至關(guān)重要的作用[14，18]，本研究對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑相關(guān)蛋白酶caspase-12活性的檢測(cè)，與對(duì)照組無顯著差異，結(jié)合mRNA表達(dá)結(jié)果可推測(cè)PTD-FNK對(duì)凍融精子的抗凋亡作用有可能是通過阻礙線粒體凋亡途徑，而不通過死亡受體途徑以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑。在誘導(dǎo)凋亡過程發(fā)生后，隨著線粒體孔道的開放，線粒體膜電位發(fā)生下降及細(xì)胞色素C釋放至胞漿，細(xì)胞色素在細(xì)胞凋亡執(zhí)行過程中位于樞紐作用[19]，于是試驗(yàn)又進(jìn)一步驗(yàn)證了線粒體膜孔道的開放性，結(jié)果顯示，試驗(yàn)組與對(duì)照組相比，mPTP的開放程度顯著性降低，進(jìn)一步推測(cè)PTD-FNK有可能是通過阻礙線粒體膜孔道的開放，進(jìn)而抑制線粒體途徑誘導(dǎo)凋亡，起到保護(hù)凍融精子的作用。

綜上所述，PTD-FNK蛋白對(duì)凍融豬精子具有保護(hù)作用，且10 nmol/L時(shí)的保護(hù)效果最佳，而其作用機(jī)制有可能是通過抑制線粒體與mPTP相關(guān)BH3-only中Bax的表達(dá)進(jìn)而抑制mPTP的開放，進(jìn)一步抑制相關(guān)caspase的活性，阻礙了線粒體內(nèi)源性途徑的凋亡，從而起到保護(hù)凍融精子的作用。其中，具體的通路交聯(lián)方式需要更深一步的研究來說明。本試驗(yàn)為深入研究PTD-FNK蛋白抑制凍融精子凋亡的機(jī)制并促進(jìn)其實(shí)際應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

研究結(jié)果表明，PTD-FNK蛋白可能是通過抑制內(nèi)源性線粒體途徑介導(dǎo)的凋亡發(fā)揮對(duì)精子冷凍解凍的保護(hù)作用。

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