李夏瑩 劉鵬程 梁晉剛

摘要：目前的轉(zhuǎn)基因生物（GMOs）檢測(cè)流程在檢測(cè)非授權(quán)轉(zhuǎn)基因生物方面存在很大的局限?；谙乱淮鷾y(cè)序（NGS）技術(shù)提出了一個(gè)新的工作程序，來(lái)克服存在的問(wèn)題。利用下一代測(cè)序技術(shù)高通量獲取DNA的序列信息，可以區(qū)分授權(quán)和非授權(quán)的GMOs。考慮新檢測(cè)流程在官方實(shí)驗(yàn)室的可操作性，還討論了這一創(chuàng)新流程的局限性及其隨時(shí)間推移的可持續(xù)性。

關(guān)鍵詞：非授權(quán)轉(zhuǎn)基因生物;創(chuàng)新方法;下一代測(cè)序技術(shù);全基因組測(cè)序;DNA步移法;NGS誘捕方法

中圖分類號(hào)： S188? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號(hào)：1002-1302（2019）11-0082-04

為了保證食品和飼料鏈安全、可追溯以及消費(fèi)者的選擇自由，世界上的一些國(guó)家已開(kāi)始為轉(zhuǎn)基因生物立法。大多數(shù)轉(zhuǎn)基因的法律框架，目的是規(guī)范食品和飼料鏈中轉(zhuǎn)基因生物（GMOs）的引入。為了獲得官方轉(zhuǎn)基因授權(quán)，申請(qǐng)者必須對(duì)轉(zhuǎn)基因生物進(jìn)行一對(duì)一的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)分析，提供準(zhǔn)確的使用、保存、標(biāo)識(shí)信息。然而，有些立法要求在不同的國(guó)家是有差異的，如標(biāo)識(shí)閾值（0.9%～5%）。未經(jīng)授權(quán)的GMOs指的是GMOs釋放到某一國(guó)家的市場(chǎng)，但沒(méi)有經(jīng)過(guò)事先的授權(quán)。

市場(chǎng)上可能發(fā)現(xiàn)2種主要的未經(jīng)授權(quán)的轉(zhuǎn)基因生物。第一種情況是非同步審批，轉(zhuǎn)基因生物在一些國(guó)家已經(jīng)得到批準(zhǔn)（如美國(guó)、加拿大、日本），但在其他國(guó)家（如歐盟）還沒(méi)有被批準(zhǔn)，或者批準(zhǔn)時(shí)限已經(jīng)過(guò)期，沒(méi)有繼續(xù)申請(qǐng)[1]。這類GMOs被認(rèn)為是安全的，因?yàn)槔霉俜綄?shí)驗(yàn)室發(fā)布的轉(zhuǎn)化體特異性檢測(cè)方法可以對(duì)其進(jìn)行監(jiān)測(cè)的。相比之下，另一種情況更應(yīng)該引起關(guān)注，即偶然或故意導(dǎo)致未經(jīng)許可的GMOs在市場(chǎng)上出現(xiàn)。比如從實(shí)驗(yàn)室或現(xiàn)場(chǎng)試驗(yàn)釋放出來(lái)的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品（例如BT10玉米、601水稻、Bt63水稻、PRSV木瓜、mon71800小麥等）[2]。這一類型的非授權(quán)GMOs通常在任何國(guó)家都沒(méi)有得到任何監(jiān)管機(jī)構(gòu)的批準(zhǔn)，所以它們可以被認(rèn)為是不安全的和未知的。此外，這一類GMOs通常沒(méi)有建立特異性的檢測(cè)方法來(lái)確保它們?cè)谑称泛惋暳现械目勺匪菪?。本研究所討論的未?jīng)授權(quán)的轉(zhuǎn)基因生物特指第2類未經(jīng)批準(zhǔn)的轉(zhuǎn)基因生物。

許多國(guó)家對(duì)非授權(quán)GMOs管理實(shí)行零容忍政策（比如歐盟和日本）或閾值管理政策（比如俄羅斯、韓國(guó)和瑞士）。不同于授權(quán)的GMOs轉(zhuǎn)基因作物，一個(gè)未經(jīng)授權(quán)批準(zhǔn)的GMOs的主要問(wèn)題是主管機(jī)關(guān)，如歐盟的歐洲食品安全局（EFSA）沒(méi)有評(píng)估GMOs及其衍生產(chǎn)品的生物安全性。此外，官方實(shí)驗(yàn)室很少制定針對(duì)此類GMOs的檢測(cè)方法（比如T35S pCAMBIA、gat-tpinll、RVYK木瓜和黃金大米2）[3-16]。因此，檢測(cè)非授權(quán)GMOs的高通量方法是保證GMOs在食品和飼料鏈安全可追溯性的關(guān)鍵。

歐盟官方實(shí)驗(yàn)室目前使用的檢測(cè)方法是針對(duì)歐盟授權(quán)GMOs的實(shí)時(shí)定量PCR（qPCR）。首先，轉(zhuǎn)基因生物構(gòu)建時(shí)常用的元件p35S和tNOS可以覆蓋大多數(shù)的GMOs。篩選步驟針對(duì)的是特異性的標(biāo)記物，能夠鑒別不同的GMOs，篩選標(biāo)記物的組合在官方實(shí)驗(yàn)室中各不相同。鑒于大多數(shù)篩選元件來(lái)自于自然界，檢測(cè)結(jié)果只能表明測(cè)試樣本中GMOs的潛在存在。在許多國(guó)家如歐盟列出授權(quán)GMOs清單，根據(jù)轉(zhuǎn)化體特異性的檢測(cè)方法明確是否存在GMOs。但是，目前定量篩查的工作程序中不包含轉(zhuǎn)化體特異性檢測(cè)方法[3-5，9，11，16-18]。此外，由于非授權(quán)GMOs和授權(quán)GMOs含有相同的轉(zhuǎn)化元件，通過(guò)qPCR篩查檢測(cè)確定GMOs可以會(huì)遺漏可能存在的非授權(quán)的GMOs。例如，含有p35S和tNOS的GTS-40-3-2大豆，這2個(gè)元件是GMOs中最常見(jiàn)的，如果篩查這2個(gè)元件很難鑒別出授權(quán)和非授權(quán)的GMOs。因此，目前的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)系統(tǒng)在檢測(cè)非授權(quán)的轉(zhuǎn)基因作物方面存在很高的錯(cuò)誤率。

為了克服以上問(wèn)題，借助下一代測(cè)序（NGS）技術(shù)可以嘗試新的GMOs檢測(cè)工作程序（圖1、圖2、圖3）[3，19-20]。

1 下一代測(cè)序（NGS）

NGS允許大量樣本的并行DNA測(cè)序，這和后續(xù)的生物信息學(xué)分析是不同的，生物信息學(xué)分析依賴于DNA文庫(kù)[21]。此外，NGS也不同于傳統(tǒng)的Sanger技術(shù)，NGS可以實(shí)現(xiàn)高通量的檢測(cè)，同時(shí)會(huì)減少基因克隆技術(shù)的使用[22]。目前，有2種主要的NGS策略可用于GMOs的檢測(cè)。

1.1 全基因組測(cè)序（WGS）

WGS適用于序列信息未知的樣本，因此稱為無(wú)目標(biāo)NGS。WGS最近有很多在GMOs分子特征描述方面取代Southern blot的成功案例，比如轉(zhuǎn)基因大豆MON17903和MON87704，轉(zhuǎn)基因水稻LLRICE62、TT51-1和 T1c-19[21，23-26]。

1.2 針對(duì)目標(biāo)片段的NGS

該方法適用于對(duì)目的片段有一定了解的樣本，因此，被稱為有目標(biāo)NGS。目的片段的分離可以通過(guò)PCR擴(kuò)增或者借助特異性探針的雜交（磁性小球或芯片），分離的目的片段用于確認(rèn)是否是授權(quán)的GMOs[3，21]。

根據(jù)NGS平臺(tái)的不同，后續(xù)使用的生物信息學(xué)分析方法不同。在Illumina平臺(tái)，隨機(jī)剪切特定大小的DNA片段用于建立DNA文庫(kù)（200～500 bp），用于篩選特定片段的DNA（100、125、150、300 bp）。為明確外源插入的元件和目的基因旁側(cè)序列，以證明檢測(cè)樣本中GMOs的存在。對(duì)產(chǎn)生短片段從頭測(cè)序之后，與篩選片段進(jìn)行比較，找到重疊區(qū)域。利用Pacic Biosciences或Oxford Nanopore，不需要從頭測(cè)序，因?yàn)檫@項(xiàng)技術(shù)可以處理基因庫(kù)（不同大小的DNA片段），也可以處理長(zhǎng)的DNA片段（60 kbp或200 kbp），不需要從DNA文庫(kù)中分離NGS的目標(biāo)片段[3，21-27]。

2 非授權(quán)GMOs檢測(cè)方法

為了更廣譜地檢測(cè)GMOs是否是歐盟授權(quán)，qPCR篩選分析只能作為一個(gè)最初的步驟。針對(duì)轉(zhuǎn)基因篩選元件的分析存在很大的局限，因?yàn)楹Y選可能同時(shí)存在授權(quán)和非授權(quán)的GMOs中，比如p35S、tNOS、t35S pCAMBIA。檢測(cè)t35S pCAMBIA可以在一定范圍內(nèi)檢測(cè)出樣本中歐盟非授權(quán)GMOs的存在，因?yàn)檫@個(gè)元件在授權(quán)GMOs中不存在，但在非授權(quán)GMOs中的存在概率是30%。使用特異性標(biāo)記物檢測(cè)非授權(quán)GMOs是非常有必要的，遺憾的是，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何篩選元件可以完全覆蓋非授權(quán)GMOs。檢測(cè)p35S、tNOS等通用元件很難判斷非授權(quán)GMOs的存在，因?yàn)檫@些元件在GMOs中是普遍存在的，與是否授權(quán)無(wú)關(guān)[28]。

通過(guò)qPCR篩選，如果關(guān)鍵的轉(zhuǎn)基因元件出現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào)，就要獲取篩選元件旁側(cè)序列信息。這些序列信息會(huì)與歐盟已經(jīng)授權(quán)的GMOs進(jìn)行對(duì)比，以確認(rèn)樣本中是否含有非授權(quán)的GMOs，目前有2種NGS策略可以實(shí)現(xiàn)該目標(biāo)。

2.1 DNA步移法

錨定在檢測(cè)轉(zhuǎn)基因元件的DNA步移法，通過(guò)NGS方法對(duì)PCR終產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，錨定在p35S、tNOS、t35S pCAMBIA和VIP3A上的DNA步移法，已經(jīng)成功應(yīng)用于GMOs檢測(cè)中。包括痕量水平的GMOs、GMOs加工品等[13]。在NGS平臺(tái)中，可考慮2種NGS方法。一是Illumina系統(tǒng)，可以產(chǎn)生數(shù)以百萬(wàn)計(jì)的小片段（例如100～300 bp）;二是利用Pacic Biosciences或Oxford Nanopore，這項(xiàng)技術(shù)可以處理基因庫(kù)（不同大小的DNA片段），可以處理長(zhǎng)的DNA片段（60 kbp或200 kbp），應(yīng)用這種方法，生物信息學(xué)分析的復(fù)雜度會(huì)顯著降低，因?yàn)檎麄€(gè)序列的信息會(huì)被直接獲取，而不需要重新將小片段重組為長(zhǎng)片段。第2種NGS的特點(diǎn)對(duì)于混合有多個(gè)含有相同元件的GMOs的樣品很有優(yōu)勢(shì)。此外，最近有試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，DNA步移法結(jié)合Pacic Biosciences在食品和飼料市場(chǎng)被廣泛應(yīng)用[29]。但是，考慮到成本的問(wèn)題，更為經(jīng)濟(jì)的NGS Illumina平臺(tái)將會(huì)是一個(gè)好的選擇[30]。然而，在常規(guī)轉(zhuǎn)基因分析中使用不同的轉(zhuǎn)基因樣品需要額外的支持實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。更重要的是，成功地應(yīng)用該項(xiàng)技術(shù)依賴于數(shù)據(jù)庫(kù)，數(shù)據(jù)庫(kù)應(yīng)包含歐盟授權(quán)的GMOs的轉(zhuǎn)化元件以及旁側(cè)序列，但是目前還沒(méi)有這樣的數(shù)據(jù)庫(kù)。因此，開(kāi)發(fā)一個(gè)盡可能完整的數(shù)據(jù)庫(kù)是最重要的。然而，某些GMOs序列的機(jī)密性可能會(huì)使數(shù)據(jù)庫(kù)的可訪問(wèn)性變得更加復(fù)雜。

2.2 NGS誘捕方法

NGS誘捕方法通過(guò)特定的雜交探針來(lái)捕獲GMOs中常見(jiàn)的元件[31-34]。然而，據(jù)筆者所知，該方法除了在比利時(shí)主管當(dāng)局資助的一項(xiàng)研究項(xiàng)目?jī)?nèi)進(jìn)行了初步的試驗(yàn)外還未被廣泛應(yīng)用。然而，無(wú)論是否有一些令人鼓舞的結(jié)果，試驗(yàn)和數(shù)據(jù)分析仍然需要通過(guò)官方實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行優(yōu)化。

雜交探針用于未經(jīng)授權(quán)的轉(zhuǎn)基因生物的篩選，必須考慮2個(gè)重要方面。首先，使用針對(duì)未獲授權(quán)的轉(zhuǎn)基因生物的雜交探針依賴于探針序列的可用性，必須保證捕獲的DNA片段足夠長(zhǎng)（至少>500 bp），才便于了解目的片段的旁側(cè)序列[35]。即使NGS捕獲方法可以單獨(dú)執(zhí)行，仍建議使用qPCR篩選以提高其有效性，保證快速而廉價(jià)地檢測(cè)到GMOs。然而，考慮到qPCR篩選的限制，qPCR標(biāo)記物應(yīng)是在GMOs中廣泛存在的（如p35S和tNOS）。對(duì)于后續(xù)的NGS誘捕分析，雜交探針的設(shè)置應(yīng)至少包括qPCR篩選為陽(yáng)性的元件。

考慮到歐盟非授權(quán)的GMOs可能含有qPCR篩選不到的轉(zhuǎn)化元件，NGS全基因組測(cè)序可能更方便，因?yàn)榍捌诓恍枰魏涡畔20，36-38]。然而，盡管這種方法可以用于樣本中GMOs含量為100%和10%，但是對(duì)于痕量的GMOs或者GMOs的混合物還是不適用[36]。例如，有研究數(shù)據(jù)表明，確認(rèn)轉(zhuǎn)基因大豆含量為0.1%的樣本，從理論上說(shuō)，須要產(chǎn)生450億的配對(duì)讀數(shù)，對(duì)應(yīng)的是使用Illumina Hiseq系統(tǒng)運(yùn)行大約20次。此外，生物信息學(xué)分析對(duì)專業(yè)知識(shí)的要求也很高[20，36]。因此，須要開(kāi)發(fā)便于官方實(shí)驗(yàn)室使用的分析工具。在這些不方便的情況下，WGS方法代表了一種很有前途的策略，可以在市場(chǎng)上監(jiān)控轉(zhuǎn)基因生物，包括在GMOs常規(guī)分析中所遇到的大多數(shù)樣品，是沒(méi)有任何關(guān)于目標(biāo)序列的背景信息的。

3 結(jié)束語(yǔ)和展望

新的工作流程有望改進(jìn)目前針對(duì)非授權(quán)GMOs的檢測(cè)流程，工作流程有2個(gè)主要的優(yōu)點(diǎn)：一是該檢測(cè)流程有助于官方實(shí)驗(yàn)室更好地檢測(cè)非授權(quán)GMOs。序列信息被確認(rèn)的歐盟非授權(quán)GMOs可以在前期的qPCR篩選中被覆蓋。另一方面，NGS技術(shù)的高通量性能可以大幅度增加每次測(cè)試的樣本數(shù)量。通過(guò)這種方式，檢測(cè)市場(chǎng)產(chǎn)品中非授權(quán)GMOs是可以負(fù)擔(dān)得起的，這與目前的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)系統(tǒng)不一樣。

目前，生物技術(shù)作物可以通過(guò)基因編輯技術(shù)研發(fā)，但歐盟主管部門(mén)還未確定這些生物的監(jiān)管方法，美國(guó)、澳大利亞、新西蘭、阿根廷等國(guó)提出使用新的工作程序來(lái)監(jiān)控此類生物?？煽紤]通過(guò)WGS去檢測(cè)qPCR篩選不到的歐盟非授權(quán)GMOs，如基因組發(fā)生了很小的修飾（比如改變1個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)）的GMOs。最近通過(guò)使用CRISPR/Cas9方法獲得了抗褐變白蘑菇、耐除草劑玉米以及抗豬繁殖和呼吸綜合征病毒的豬;2016年初，美國(guó)主管部門(mén)裁定，通過(guò)該技術(shù)獲得的菌菇不受美國(guó)農(nóng)業(yè)部法規(guī)的約束[39-44]。

因此，由于新檢測(cè)程序的眾多優(yōu)點(diǎn)，它可以靈活應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因生物和新技術(shù)研發(fā)的生物。在歐盟，常規(guī)的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)主要用于評(píng)估食品鏈和飼用鏈中歐盟授權(quán)的轉(zhuǎn)基因食品標(biāo)識(shí)的正確性。然而，考慮到公眾健康和消費(fèi)者的自由選擇權(quán)，檢測(cè)非授權(quán)的GMOs應(yīng)具有更高的優(yōu)先權(quán)，因?yàn)榉鞘跈?quán)GMOs沒(méi)有經(jīng)過(guò)權(quán)威機(jī)構(gòu)的生物安全評(píng)估，對(duì)人、動(dòng)物的健康以及環(huán)境存在潛在的風(fēng)險(xiǎn)。因此，應(yīng)該盡更大的精力研究非授權(quán)GMOs，在歐盟當(dāng)局和世界范圍內(nèi)認(rèn)真討論這個(gè)問(wèn)題是很重要的。歐盟的主管部門(mén)已將非授權(quán)GMOs的檢測(cè)作為重點(diǎn)工作，已經(jīng)發(fā)布的“Decision 2013/287/EU”建立了檢測(cè)食用鏈和飼用鏈中非授權(quán)轉(zhuǎn)基因水稻的檢測(cè)方法。此外，允許食用鏈和飼用鏈中非授權(quán)GMOs檢測(cè)信息快速交流的食品和飼料快速警報(bào)系統(tǒng)（RASFF）也在歐盟被廣泛應(yīng)用[5，19]。

這些創(chuàng)新的工作程序很有可能在未來(lái)的幾年變成現(xiàn)實(shí)。然而，在官方實(shí)驗(yàn)室推廣使用這項(xiàng)技術(shù)存在難度。因?yàn)榇蠖鄶?shù)官方實(shí)驗(yàn)室都是使用qPCR的方法，一些新技術(shù)比如NGS須要投入專業(yè)的人才和計(jì)算機(jī)設(shè)備[19-20，45]，預(yù)計(jì)創(chuàng)新的檢測(cè)程序只能在少數(shù)具有代表性的官方實(shí)驗(yàn)室執(zhí)行。

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