李亞超，馬云云，陶金忠，袁莉剛，李琪，梁晶晶

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，甘肅 蘭州 730070；2.寧夏大學農(nóng)學院，寧夏 銀川 750021)

哺乳動物睪丸局部激素調(diào)控是精子發(fā)生過程中的關鍵步驟，其中促黃體生成激素(luteinizing hormone，LH)是主要調(diào)節(jié)激素之一.LH又稱leydig細胞刺激素，是leydig細胞合成和分泌雄激素至關重要的調(diào)節(jié)因子，亦可反饋抑制下丘腦GnRH和腺垂體FSH及LH的分泌.LH主要通過與睪丸leydig細胞上的促黃體生成素受體(luteinizing hormone receptor，LHR)結合，在內(nèi)分泌細胞的信號傳導過程發(fā)揮作用，并參與精子生成、受精卵著床、性腺發(fā)育等一系列生理活動[1].免疫組化研究表明，相較于其他各生殖器官，倉鼠睪丸中LHR表達量最高[2].研究發(fā)現(xiàn)水牛卵泡期卵巢中LHR的表達量高于黃體期，在黃體期子宮中LHR的表達量高于卵泡期，表明其參與卵巢黃體生成及誘發(fā)排卵等功能的調(diào)節(jié)[3].研究表明，同一發(fā)情周期中不同發(fā)育階段的山羊子宮內(nèi)LHR mRNA表達差異明顯，提示其參與發(fā)情周期的調(diào)節(jié)[4].研究報道繁殖季節(jié)野生公鹿和母鹿垂體中LH陽性表達比非繁殖季節(jié)強烈[6].研究資料表明，狍、白尾鹿和紅鹿等FSH和LH季節(jié)性分泌的起伏與繁殖期變化相一致[7-9].因此，LH及其受體在生殖器官的表達差異與動物的季節(jié)性繁殖及其調(diào)控關系密切.

牦牛為高原環(huán)境中的季節(jié)性繁殖動物，表現(xiàn)為暖季發(fā)情，其生殖發(fā)育相關調(diào)節(jié)因子在不同繁殖期有一定的表達差異.研究報道VEGF及其受體在性成熟牦牛不同繁殖期睪丸組織中表達差異明顯，二者參與精子發(fā)生及局部微環(huán)境的調(diào)節(jié)[10].早期研究表明，LHR在不同年齡牦牛睪丸leydig細胞及支持細胞中有表達，在性成熟及老齡牦牛睪丸呈中等陽性表達，性成熟青年期牦牛陽性表達弱有降低，表明其主要起到調(diào)節(jié)leydig細胞及支持細胞生理功能的作用[11].在此基礎上，本研究通過組織化學染色及免疫組織化學技術結合形態(tài)計量比較LHR在不同繁殖期牦牛睪丸組織的表達，分析LHR分布變化與牦牛季節(jié)性發(fā)情的關系，旨在為高原哺乳動物季節(jié)性調(diào)控研究提供形態(tài)學參考.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

在青海西寧市大通養(yǎng)殖戶采集5歲繁殖期(7～9月)和繁殖間期(1～2月)成年牦牛睪丸樣品，于4%的多聚甲醛溶液固定.

免疫組化染色試劑盒(SP-9001，由美國ZYED 生產(chǎn)，購自北京中杉金橋生物技術有限公司)；DAB顯色試劑盒(ZLI-9108，北京中杉金橋生物技術有限公司)；蘇木精-伊紅染料(臺山市化工有限公司)；過碘酸Schiff染色試劑和阿爾辛藍過碘酸Schiff染色試劑；LHR抗體(北京中杉金橋生物技術有限公司).

EPON812包埋機，LKB8800型超薄切片機，NIKON ECLIPSE 80i顯微攝像系統(tǒng).

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品制備 將組織樣品切成1 cm×1 cm×0.6 cm大小，4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液中固定，不同梯度酒精脫水，二甲苯透明，組織浸蠟，包埋，連續(xù)切片(5 μm)，制成石蠟切片.

1.2.2 蘇木精-伊紅(H.E)常規(guī)染色 切片梯度酒精脫蠟后，放入蘇木精染液2 min，流水沖洗2次，5 min/次，隨后用1%的鹽酸分化2次，每次2 s；之后用流水沖洗10 min，待切片返藍后，伊紅染液染色1 min，梯度酒精脫水，二甲苯溶液透明20 min，最后用中性樹脂封片.

1.2.3 PAS和AB糖原染色 切片脫水、脫蠟后，滴加1% AB醋酸水溶液10～20 min，蒸餾水洗2次，用1%過碘酸水溶液氧化5～10 min，滴加Schiff氏試劑染色10～20 min，每張切片滴加50 μL偏重亞硫酸鈉連續(xù)3次，每次2 min，間隔1 min，流水沖洗5～10 min，用蘇木精染液過染2～3 min，鹽酸分化液分化1次，流水沖洗10 min，常規(guī)脫水透明、封片.PAS染色，蘇木精復染.染色后中性粘蛋白呈紅色.AB染色(pH=2.5)酸性粘蛋白呈藍色，核淡紅色[12].

1.2.4 免疫組織化學法 免疫組化(streptavidin-perosidase，SP)法染色，切片梯度酒精脫水、脫蠟后，酒精梯度分化；使用30 g/L H2O2溶液在37 ℃條件下孵育15 min阻斷過氧化物酶活性，隨后用蒸餾水洗1次，5 min/次，PBS洗3次，5 min/次，將5%～10%正常山羊血清(PBS稀釋)封閉，37 ℃孵育15 min后傾去血清(即正常山羊血清白蛋白)；在切片上滴加50 μL兔多克隆抗鼠，稀釋度為1∶400的促黃體生成素受體-IgG，在37 ℃條件下孵育4 h， PBS洗滌3次，5 min/次，之后將50 μL生物素標記的山羊抗兔IgG工作溶液加入到每個切片中，37 ℃孵育15 min，PBS洗滌3次，5 min/次，隨后加50 μL適當比例PBS稀釋的辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，37 ℃條件孵育15 min后用PBS沖洗5 min，洗3次；隨后滴加新鮮配的DAB顯色溶液顯色，常規(guī)脫水透明、封片.陰性對照用PBS替代兔源一抗進行染色.

1.3 數(shù)據(jù)處理

NIKON ECLIPSE 80i顯微攝像系統(tǒng)進行照相.采用半定量的形式對染色結果的分布密度進行描述，-：無陽性表達；+/-：偶有陽性表達；+：陽性表達；++：中等強度陽性表達；+++：強陽性表達；++++：高密度強陽性[13].

隨機選取5張切片，每張切片隨機選取6個不重復視野(×400)，用Image Pro Plus 6.0軟件統(tǒng)計染色結果中每個視野下陽性信號強度均值與陽性面積計算表達平均吸光度；1組共計30個統(tǒng)計數(shù)據(jù)，結果計為均值±標準差，SPSS 15.0軟件統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析同一蛋白組間表達量的差異.

2 結果與分析

2.1 不同繁殖季節(jié)牦牛睪丸的組織化學特點

光鏡下，繁殖期性成熟牦牛睪丸組織生精上皮由4～8層生精細胞及sertoli細胞構成，大量成熟精子明顯分布于腔面，管周肌樣細胞圍繞于生精小管固有膜外周，間質結締組織分布明顯，leydig細胞散布其中(圖1-A,1-B).特殊染色表明，睪丸生精上皮及間質PAS紫紅色陽性條帶明顯，生精上皮近腔面處亦可見陽性反應(圖1-C)；AB藍色陽性條帶清晰分布于間質毛細血管壁，leydig細胞周圍無明顯表達(圖1-D).繁殖間期睪丸組織的生精上皮為4～6層細胞，與繁殖期相比，睪丸組織結構變化不明顯(圖1-G,1-H)，PAS紫紅色陽性在睪丸小管基膜及間質表達明顯減弱(圖1-I)，但間質毛細血管壁及生精小管固有膜AB藍色陽性條帶清晰明顯(圖1-J).

2.2 LHR在成年牦牛睪丸組織中的表達

免疫組織化學染色結果顯示，LHR在繁殖期牦牛睪丸組織leydig細胞、sertoli細胞為弱陽性表達，各級生精細胞幾乎無表達(圖1-E，表1)，陰性對照無表達(圖1-F).繁殖間期，LHR在leydig細胞呈高密度強陽性表達，生精上皮未見明顯表達(圖1-K)，陰性對照無表達(圖1-L).

2.3 LHR在不同周期牦牛睪丸免疫組織化學檢測結果對比分析

免疫組織化學圖像統(tǒng)計結果顯示，牦牛睪丸組織中LHR在繁殖間期的平均吸光度高于繁殖期，統(tǒng)計學差異顯著(圖2).

3 討論

PAS及AB-PAS陽性反應的糖原、糖蛋白以及蛋白多糖很典型的存在于睪丸結締組織、粘液以及基膜中，受體蛋白、腫瘤細胞表面抗原等亦均屬糖蛋白，粘蛋白及糖類物質與睪丸生精功能及激素合成密切相關.早期研究表明，單峰駝睪丸PAS陽性反應條帶主要在血管壁及生精小管外周，PAS隨生精小管上皮發(fā)育周期階段性變化而差異明顯，生殖周期早期PAS反應最豐富，后期則明顯缺乏[14].單峰駝精子發(fā)生需要多種糖綴合物，其含量隨不同繁殖季節(jié)差異明顯，繁殖期尤為豐富[15].與此相一致，本研究中，PAS在繁殖間期較繁殖期表達減弱，表明PAS與繁殖上皮發(fā)育營養(yǎng)需要密切相關.研究報道，AB陽性反應在老齡小鼠睪丸 leydig 細胞及基質中會較青年小鼠增強[16]；與此相似，繁殖間期的老齡牦牛睪丸間質血管及生精小管固有膜中AB陽性反應較青年牦牛增強[17].本研究中，繁殖間期反映酸性粘多糖表達增強的AB陽性反應較繁殖期明顯，繁殖期PAS陽性反應的中性粘蛋白表達則較強，且不同繁殖季節(jié)睪丸局部粘多糖的表達差異明顯，糖蛋白參與免疫、分泌、物質轉運、信息傳遞、分化的調(diào)節(jié)及再生等，酸性粘多糖可在局部組織中生物還原為相應的中性粘多糖，繁殖間期以酸性粘多糖為主，提示可能與局部組織生化反應的改變有關，繁殖活動增強主要與中性粘蛋白關系密切.

LH是動物機體內(nèi)重要的生殖激素，與細胞的特異性糖蛋白受體(LHR)結合激活腺苷酸-蛋白激酶(cAMP/PKA)信號通路而刺激類固醇激素的合成，在生殖過程發(fā)揮作用[1]；LH與LHR結合后，細胞內(nèi)cAMP活化并增多，與Leydig細胞的發(fā)育、青春期睪酮的分泌以及精子成熟密切相關[2].盧全生等[18]發(fā)現(xiàn)，SD大鼠睪丸組織LHR水平表現(xiàn)為冬高夏低，表明LHR的表達受季節(jié)因素的影響.本研究中，LHR在繁殖期牦牛睪丸sertoli細胞為弱陽性，不同繁殖期的生殖上皮均未見明顯表達，提示LHR或者并不直接參與性成熟后牦牛不同季節(jié)生精過程的調(diào)節(jié)；大鼠睪丸免疫組化定位顯示，LHR主要表達于Leydig細胞膜，也有少量表達于Leydig細胞質[19]，與此相一致，本研究中LH在leydig細胞分布為主，繁殖間期的陽性表達強于繁殖期，提示高原地區(qū)繁殖季節(jié)對LHR在leydig細胞的表達有調(diào)節(jié)作用.

A～F：繁殖期牦牛睪丸組織；G～L：繁殖間期牦牛睪丸組織；A、B、G、H：HE染色；C、I：PAS染色；D、J：AB染色；E、K：LHR免疫組化染色；F、L：免疫組化染色陰性對照；BC：毛細血管；IT：間質；Ley：間質細胞；ST：生精小管.A～F：The structure of yak testicle in breeding season；G～L：The structure of yak testicle in non-breeding season；A、B、G、H：The hematoxylin-eosin staining；C、I：The periodic acid Schiff staining；D、J：The Alcian-Blue staining；E、K：The LHR immunohistochemical staining；F、L：The immunohistochemical staining negative control；BC：Blood capillary；IT：Interstitial；Ley：Leydig cells；ST：Seminiferous tubue.圖1 不同繁殖周期成年牦牛睪丸組織化學特點及LHR表達比較Figure 1 The comparison of histochemical characteristics and LHR expression in the testicle of adult yak between breeding and non-breeding seasons

表1 LHR在牦牛睪丸繁殖期和繁殖間期不同部位的分布密度Table 1 The density of LHR in different parts of yak testis in the breeding season and the non-breeding season

*同一蛋白組間差異顯著(P<0.05).* means significant difference between groups(P<0.05).圖2 不同繁殖期成年牦牛睪丸LHR表達統(tǒng)計Figure 2 The comparison of LHR expression in the testicle of adult yak between breeding and non-breeding seasons

季節(jié)性繁殖雄性動物，睪丸酮在非繁殖季節(jié)減少，局部粘附分子的表達降低，同時誘導生殖細胞生成減少[20].研究表明，人LHR胞外區(qū)占50%以上，有6個潛在的糖基化位點，與其所處微環(huán)境中糖蛋白生化條件密切相關[21 ].研究表明，小鼠在試驗性長距離運輸后，睪丸中睪酮水平下降，精子數(shù)量減少，但是LHR表達增加，可能影響了精子的生成[22].本研究中繁殖間期牦牛睪丸間質組織以酸性粘多糖陽性表達為主，LHR表達量明顯增加，二者是否存在一定關系需進一步研究.資料表明，LHR mRNA主要表達在日本黑熊的Leydig細胞，且隨不同繁殖季節(jié)在睪丸活躍期、退化期和復蘇期表達量逐漸增加[23].本研究中LHR在繁殖間期牦牛睪丸leydig細胞強表達，顯著強于繁殖期，也可能與日本黑熊的表達相一致，LHR通過對睪丸局部leydig細胞的抑制，減少睪酮分泌，由此睪丸精子生成功能亦相對降低，其機理有待于進一步研究.

4 結論

PAS和AB在成年牦牛睪丸組織分布繁殖期略強于繁殖間期，提示其與繁殖期生精活動增強有關；LHR表達在睪丸以leydig細胞陽性分布為主，提示高原地區(qū)繁殖季節(jié)對LHR在leydig細胞的表達有調(diào)節(jié)作用.