陳曉倩，吳國華,郭小臘，楊靜，吳金恩，顏魯軍，周雪雁，鄭亞東，陳軼霞

(1.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，家畜疫病病原生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅省動物寄生蟲病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730046)

羊痘是由羊痘病毒屬(Capripoxvirus)的綿羊痘病毒(sheeppox virus,SPPV)或山羊痘病毒(goatpox virus,GTPV)引起的羊的一種急性、熱性、接觸性傳染病，是所有動物痘病毒中最嚴(yán)重的一種[1]，廣泛分布于亞洲、歐洲、北美和非洲的許多國家.世界動物衛(wèi)生組(OIE)將該病列為法定通報(bào)傳染病，我國將其列為Ⅰ類動物疾病.此外，SPPV還可作為生物武器，威脅國防安全，被劃歸到Ⅱ類危險(xiǎn)戰(zhàn)劑[4-5].近年來我國的一些省份均有本病的流行.由于感染羔羊有較高的病死率，因此阻礙了我國畜牧業(yè)的健康發(fā)展[2-3].

RING (really interesting new gene) finger 蛋白是一類含有環(huán)指結(jié)構(gòu)域的蛋白，是一個(gè)龐大的蛋白家族，廣泛存在于動物和酵母等所有的真核生物中[6]，在擬南芥、辣椒、水稻等植物中都成功分離并鑒定了RING finger蛋白[7-9].RING結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列為Cys-X2-Cys-Xn(9-39)-Cys-X1～3-His-X2～3-Cys-X2-Cys-Xn (4-48)-Cys-X2-Cys，其中X可以代表任意1種氨基酸殘基，數(shù)字代表氨基酸數(shù)量[10-11]，根據(jù)與鋅離子結(jié)合的第5個(gè)氨基酸是半胱氨酸還是組氨酸可以將其分為C3H2C3( RING-H2)或C3H1C4 ( RING-HC)構(gòu)型[12].近年來，越來越多的RING finger蛋白被證明能作為E3泛素連接酶來介導(dǎo)底物特異性泛素化[13].

許多病毒可以通過編碼它們自己的E3連接酶或宿主的E3連接酶來操縱泛素-蛋白酶體系，促進(jìn)其感染.正痘病毒屬成員編碼1個(gè)高度保守的28 ku的毒力因子(p28)，其C末端有1個(gè)典型的RING finger基序(C3HC4)，N末端包含1個(gè)KilA-N DNA結(jié)合域，是一個(gè)RING finger蛋白.研究表明，p28受到蛋白酶體降解和泛素化的高度調(diào)控，還可通過自身泛素化進(jìn)行自我調(diào)節(jié)[14-15].在鼠痘病毒感染的過程中，p28參與抑制病毒感染誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)病毒復(fù)制，且其具有E3泛素連接酶活性[16-17]；禽痘病毒在感染過程中也編碼2個(gè)具有E3泛素連接酶活性的p28樣蛋白[18].

羊痘病毒的基因組為線性、雙鏈DNA，共有147個(gè)開放閱讀框(open reading frame,ORF)， 其中第140個(gè)ORF編碼1個(gè)RING finger蛋白[19]，其生物功能還未見報(bào)道.因此，本研究以綿羊痘病毒甘肅古浪株(sheeppox virus gansu gulang strain,SPPV GS-GL)DNA為模板，擴(kuò)增并表達(dá)綿羊痘病毒RING finger蛋白(sheeppox virus RING finger protein，SPPVRFP)，為進(jìn)一步研究SPPVRFP的功能奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

綿羊痘病毒古浪株基因組DNA、綿羊痘病毒陽性血清、pGEX-4T-1表達(dá)載體由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所提供；pEASY-T1載體購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；新西蘭大白兔購于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所動物場.

1.2 試驗(yàn)試劑

PrimeSTAR HS DNA 聚合酶、DL2000 DNA Marker、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ、Agarose gel DNA Fragment Purification Kit、MiniBEST Plasmid Purification Kit均購自Takara公司.Trans5α、Trans1-T1、BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司.T4 DNA連接酶、蛋白預(yù)染Marker購自Thermo Scientifc公司.4x蛋白上樣緩沖液購自Salarbio公司.Glutathione Sepharose 4B蛋白純化試劑盒購自美國GE公司.弗氏佐劑購自Sigma公司.HRP酶標(biāo)山羊抗家兔IgG購自SeraCare Life Sciences公司.HRP酶標(biāo)驢抗綿羊IgG購自Abcam公司.ECL發(fā)光試劑盒購自Invitrogen公司.X光底片、顯影液和定影液均購自Carestream公司.

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中收錄的綿羊痘病毒TU株的RINGfinger基因(GenBank登錄號：AY077832.1)序列，利用DNAMAN分別設(shè)計(jì)上下游引物，并插入BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)(下劃線處).上游引物的序列為：5′-CGCGGATCCATGGATTCTAATAGTCGAAACGG-3′，下游引物的序列為5′-CCGCTCGAGCGGTTATGGAAAAAATCTACTTTTTATAAC-3′.引物由蘇州金唯智生物技術(shù)有限公司合成.

1.3.2 SPPVRFP基因的克隆及序列分析 以SPPV GS-GL DNA為模板，用合成的SPPVRFP基因上、下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增.98 ℃ 10 s ，55 ℃ 5 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)擴(kuò)增.PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化后回收，將回收產(chǎn)物與pEASY-T1載體進(jìn)行連接并轉(zhuǎn)入Trans1-T1大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)鑒定后，提取陽性質(zhì)粒進(jìn)行測序.陽性克隆質(zhì)粒命名為pEASY-SPPVRFP.

利用Pfam數(shù)據(jù)庫(http://pfam.xfam.org/)預(yù)測分析其結(jié)構(gòu)域.利用DNAStar對測序結(jié)果進(jìn)行序列分析，并與不同羊痘病毒株的(表1)RINGfinger基因進(jìn)行核苷酸和氨基酸序列同源性分析，繪制系統(tǒng)發(fā)育樹.

1.3.3 不同RING finger蛋白間的氨基酸序列比對 利用DNAMAN軟件對鼠痘病毒RING finger蛋白p28、牛痘病毒p28樣蛋白、禽痘病毒FWPV150 、FWPV157 、粘液瘤病毒M143R、大腸桿菌N1R p28樣蛋白及SPPV GS-GL株SPPVRFP的氨基酸序列進(jìn)行比對.

1.3.4SPPVRFP原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切pGEX-4T-1和pEASY-SPPVRFP質(zhì)粒，回收目的片段.用T4 DNA連接酶于16 ℃過夜連接SPPVRFP基因片段和線性化的pGEX-4T-1，轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Trans5α中，涂于(含100 μg/mL氨芐青霉素)LB瓊脂平板，挑取單克隆菌落提取質(zhì)粒經(jīng)PCR以及雙酶切鑒定后進(jìn)行測序，將鑒定為陽性的重組表達(dá)質(zhì)粒命名為pGEX-SPPVRFP.

1.3.5 SPPVRFP重組蛋白的表達(dá)及純化 將構(gòu)建正確的重組質(zhì)粒pGEX-SPPVRFP和pGEX-4T-1空載體分別轉(zhuǎn)入BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，挑選單克隆，過夜培養(yǎng)，培養(yǎng)物以1∶100的體積比接種于20 mL LB液體培養(yǎng)基(含100 μg/mL氨芐青霉素)中，37 ℃,220 r/min培養(yǎng)至D600為0.6～1.0時(shí)加入終濃度0.5 mmol/mL IPTG，16 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)14 h，同時(shí)設(shè)立相同條件下未做誘導(dǎo)的對照組，收集菌液進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，檢測重組蛋白表達(dá)情況.

取pGEX-4T-1空載體誘導(dǎo)表達(dá)菌液和pGEX-SPPVRFP誘導(dǎo)表達(dá)菌液8 000 r/min，4 ℃條件下離心10 min，棄上清.沉淀分別用PBS洗滌3次后用Buffer進(jìn)行重懸.重懸后的菌體懸液于冰上超聲裂解后，4 ℃ 10 000 r/min離心10 min，收集上清，采用Glutathione Sepharose 4B蛋白純化試劑盒純化目的蛋白.

1.3.6 SPPVRFP重組蛋白兔陽性血清的制備及Western-blot鑒定 SPPVRFP重組蛋白采用背部皮下多點(diǎn)注射法免疫新西蘭大白兔，設(shè)未免疫對照組.間隔2周免疫1次，共免疫4次.首次免疫時(shí)，將純化的蛋白與弗氏完全佐劑混合，每只注射1 mg.其后與弗氏不完全佐劑混合，每次免疫蛋白量減半.每次免疫前對試驗(yàn)組和對照組進(jìn)行耳緣靜脈采血，分離血清，檢測其抗體水平，收集陽性血清備用.將純化后的SPPVRFP重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，用濕轉(zhuǎn)電轉(zhuǎn)儀將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，以上述制備的重組蛋白兔陽性血清和綿羊痘病毒陽性血清作為一抗(1∶1 000稀釋)，同時(shí)設(shè)置陰性血清對照組，4 ℃過夜，然后分別加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體(1∶10 000稀釋)和驢抗綿羊IgG抗體(1∶10 000稀釋)，室溫孵育1 h，用ECL顯色液顯色后于暗室曝光.

2 結(jié)果與分析

2.1 SPPVRFP基因序列擴(kuò)增

以綿羊痘病毒古浪株病毒DNA為模板，PCR擴(kuò)增SPPVRFP基因，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，出現(xiàn)1條大小約723 bp的特異條帶，如圖1所示.

2.2 SPPVRFP基因的序列及遺傳進(jìn)化分析

Pfam數(shù)據(jù)庫預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)其含有2個(gè)結(jié)構(gòu)域，分別為KIlA-N結(jié)構(gòu)域和RING finger結(jié)構(gòu)域(圖2).利用DNAStar軟件對SPPVRFP基因序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其由723個(gè)核苷酸組成，編碼240個(gè)氨基酸，分子量約為28.5 ku.同源性分析顯示，SPPVRFP基因同其他羊痘病毒毒株的RINGfinger基因核苷酸的同源性為95.5%～99.2%，氨基酸序列的同源性為92.9%～98.3%(表2).系統(tǒng)進(jìn)化樹分為2個(gè)分枝，綿羊痘病毒和山羊痘病毒在不同的分枝上，SPPV GS-GL 株的RINGfinger基因與其它3株綿羊痘病毒處在同一分支上(圖3).

M：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：SPPVRFP 基因PCR產(chǎn)物.M：DNA Marker；1：PCR product of SPPVRFP.圖1 SPPVRFP基因的PCR擴(kuò)增Figure 1 PCR amplification of SPPVRFP

圖2 SPPVRFP結(jié)構(gòu)域預(yù)測Figure 2 SPPVRFP domain prediction

右上角為核苷酸同源性；左下角為氨基酸同源性.

Nucleotide homology in the upper right corner；amino acid homology in the lower left corner.

圖3 CPV不同毒株RING finger基因系統(tǒng)進(jìn)化樹Figure 3 Phylogenetic tree of RING finger of different CPV strains

2.3 不同RING finger蛋白間的氨基酸序列比對

利用DNAMAN軟件對不同RING finger蛋白(表3)進(jìn)行氨基酸序列比對，發(fā)現(xiàn)它們都含有8個(gè)高度保守的半胱氨酸和組氨酸，且都具有RING finger結(jié)構(gòu)域(圖4).

表3 毒株信息

2.4 SPPVRFP重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定

利用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ同時(shí)對pGEX-SPPVRFP重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，分別獲得了約723、4 900 bp的2條條帶(圖5)，與理論值一致，測序結(jié)果也表明pGEX-SPPVRFP重組質(zhì)粒構(gòu)建成功.

M：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：重組質(zhì)粒pGEX-SPPVRFP的BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切產(chǎn)物.M：DNA marker；1：The product from recombinant plasmid pGEX-SPPVRFP digested by BamHⅠ and XhoⅠ圖5 重組質(zhì)粒pGEX-SPPVRFP的鑒定Figure 5 Identification of recombinant pGEX-SPPVRFP plasmid

2.5 SPPVRFP重組蛋白的表達(dá)及純化

對pGEX-SPPVRFP和pGEX-4T-1空載體分別進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，菌液的SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果表明，pGEX-SPPVRFP誘導(dǎo)組在55 ku處出現(xiàn)明顯的蛋白條帶(圖6-A)，pGEX-4T-1空載體誘導(dǎo)組在26 ku處出現(xiàn)明顯的蛋白條帶(圖6-B).對SPPVRFP重組蛋白和pGEX-4T-1空載體誘導(dǎo)表達(dá)蛋白進(jìn)行純化，SDS-PAGE電泳檢測顯示，在26、55 ku處分別出現(xiàn)單一條帶(圖6-C).

圖4 不同RING finger蛋白氨基酸序列比對Figure 4 Comparison of amino acid sequence for different RING finger proteins

M：蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；A(1)：未誘導(dǎo)的pGEX-SPPVRFP；A(2)：誘導(dǎo)的pGEX-SPPVRFP；B(1)：未誘導(dǎo)的pGEX-4T-1；B(2)：誘導(dǎo)的pGEX-4T-1；C(1)：SPPVRFP純化；C(2)：pGEX-4T-1標(biāo)簽蛋白純化.M：Protein molecular weight Marker；A(1)：Uninducd pGEX-SPPVRFP；2(A)：Inducd pGEX-SPPVRFP；B(1)：Uninducd pGEX-4T-1；B(2)：Inducd pGEX-4T-1；C(1)：Purification of SPPVRFP；C(2)：Purification of PGEX-4T-1.圖6 SPPVRFP的表達(dá)及純化Figure 6 Expression and purification of recombinant SPPVRFP

2.6 SPPVRFP重組蛋白的Western-blot鑒定

將純化后的SPPVRFP重組蛋白進(jìn)行Western-blot鑒定，結(jié)果如圖7所示，SPPVRFP重組蛋白能夠與其純化蛋白制備的兔陽性血清發(fā)生反應(yīng)，在55 ku處出現(xiàn)明顯特異性條帶，而與綿羊痘病毒陽性血清和兔陰性血清不發(fā)生反應(yīng).

M：蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：重組蛋白兔陽性血清；2：陰性血清；3：綿羊痘病毒陽性血清.M：Protein marker；1：Rabbit polyclonal serum；2：Negative control serum；3：SPPV polyclonal serum.圖7 SPPVRFP重組蛋白Western-blot分析Figure 7 Western-blot analysis of recombinant SPPVRFP

3 討論

痘病毒可編碼操縱泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的蛋白，包括細(xì)胞泛素同源物、充當(dāng)泛素連接酶底物連接蛋白的蛋白，以及編碼具有內(nèi)源性泛素連接酶活性的蛋白；痘病毒也可直接抑制細(xì)胞E3連接酶的功能以利于病毒的感染、致病.RING finger結(jié)構(gòu)域蛋白在痘病毒中高度保守，越來越多的RING finger蛋白被鑒定為E3泛素連接酶[20-21].對綿羊痘病毒古浪分離株進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測，發(fā)現(xiàn)其具有RING finger結(jié)構(gòu)域.將其與其他6株羊痘病毒分離株的RINGfinger基因進(jìn)行同源性分析，發(fā)現(xiàn)它們的核苷酸序列同源性高達(dá)99.2%，氨基酸序列同源性高達(dá)98.3%，進(jìn)一步證實(shí)了RINGfinger基因在痘病毒間的保守性.將SPPVRFP與不同的RING finger蛋白氨基酸序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)它們都含有8個(gè)高度保守的半胱氨酸和組氨酸殘基，且它們都具有RING finger結(jié)構(gòu)域，我們推測SPPV GS-GL株RING finger蛋白可能也具有E3泛素連接酶活性.

本試驗(yàn)構(gòu)建的原核表達(dá)載體pGEX-SPPVRFP誘導(dǎo)表達(dá)出分子量約為55 ku的重組蛋白，該蛋白含有GST標(biāo)簽以融合方式表達(dá)，GST標(biāo)簽大小約為26 ku，故重組SPPVRFP的大小約為55 ku.Western-blot分析顯示，重組SPPVRFP能夠與其純化蛋白制備的兔陽性血清發(fā)生反應(yīng)，但該蛋白不與綿羊痘病毒陽性血清反應(yīng)，其原因有可能是在綿羊痘病毒感染宿主的過程中，RING finger蛋白不能被宿主的免疫系統(tǒng)識別，不產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)，不刺激抗體的產(chǎn)生，詳細(xì)機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究.

4 結(jié)論

本研究成功克隆、表達(dá)了綿羊痘病毒甘肅古浪株RINGfinger基因，并純化了RING finger蛋白.生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)SPPVRINGfinger基因具有RING finger結(jié)構(gòu)域，且其在羊痘病毒間的保守性良好，與不同的RING finger蛋白氨基酸序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)它們都含有8個(gè)高度保守的半胱氨酸和組氨酸殘基；Western-blot分析顯示，重組SPPVRFP不與綿羊痘病毒陽性血清發(fā)生反應(yīng).