吳合亮 潘靖丹 李美辰 杜晶晶 陰皓鋒 安子熙 杜孌英

承德醫(yī)學(xué)院，河北省承德市 067000

肺癌是一種對(duì)人類(lèi)健康和生命威脅很大的惡性腫瘤，在我國(guó)肺癌發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢(shì)[1]。目前肺癌已位居惡性腫瘤發(fā)病率和死亡率之首，尋找一種作用靶點(diǎn)多而副作用少的藥物至關(guān)重要。旋毛蟲(chóng)(Trichinella spiralis,T.spiralis)肌幼蟲(chóng)(Muscle-larva, ML)排泄分泌蛋白(Excretory-secretory proteins,ESPs)是從旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)培養(yǎng)液中提取的一種生物活性物質(zhì)。已有研究表明，旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)排泄分泌蛋白體外作用于某些腫瘤細(xì)胞能使其生長(zhǎng)受到抑制，并能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡[2]。腫瘤熱療(Hyperthermia,HT)主要是通過(guò)紅外線、高頻電磁波、熱水浴、超聲波等致熱源，將腫瘤局部或全身加熱到有效治療溫度并維持一段時(shí)間，以達(dá)到既可殺滅腫瘤細(xì)胞，又可不損害正常組織細(xì)胞的一種治療方法，在腫瘤的綜合治療中發(fā)揮著重要的作用[3]。本研究以人小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞作為研究對(duì)象，觀察了熱療聯(lián)合旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)排泄分泌蛋白對(duì)H446細(xì)胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 旋毛蟲(chóng)、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞株 實(shí)驗(yàn)所用旋毛蟲(chóng)為豬源旋毛蟲(chóng)，由本教研室保種。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為清潔型健康成年昆明小鼠，體重18～32g，購(gòu)自承德醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。人小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞株購(gòu)自上海北諾生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 MTT，二甲基亞砜(DMSO)，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒均購(gòu)自上海索萊寶生物科技有限責(zé)任公司；RPMI1640培養(yǎng)基，胎牛血清，胰蛋白酶消化液(0.25%)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；氯化鈉購(gòu)自天津市百世化工有限責(zé)任公司。

1.3 旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)的收集和排泄分泌蛋白的制備 參照文獻(xiàn)4的方法，提取旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)，經(jīng)過(guò)純水多次洗滌沉淀后，用4%的明膠作為佐劑，對(duì)旋毛蟲(chóng)進(jìn)行計(jì)數(shù)，調(diào)整蟲(chóng)體密度約為3 000條/ml,每只小鼠經(jīng)口灌服0.1ml含旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)的明膠，保蟲(chóng)35d后，采用頸椎離斷法處死，去其四肢、內(nèi)臟、脂肪等。取其肌肉，先用純水多次洗滌，用干凈的剪刀剪成小塊狀，再置于粉碎機(jī)內(nèi)攪碎，加入1.5%的胃蛋白酶和1.5%的鹽酸，于37℃恒溫水浴鍋中消化3～4h后，加入0.9%NaCl終止消化，100目無(wú)菌銅網(wǎng)過(guò)濾沉淀45min，去掉肉液，用生理鹽水多次洗滌，獲取旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)。將純凈的旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)移入含青鏈霉素的無(wú)血清培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，選擇無(wú)污染、死蟲(chóng)率<5%的培養(yǎng)皿收集上清液(旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)排泄分泌蛋白)，4℃、12 000g離心30min，0.22μm濾膜過(guò)濾除菌后分裝，采用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒定量，-80℃保存。

1.4 H446細(xì)胞的培養(yǎng)與傳代 在液氮中取出裝有H446細(xì)胞的凍存管，置于37℃恒溫水浴鍋中快速完全消融，避免結(jié)晶傷害細(xì)胞。解凍后將凍存管置于離心機(jī)中離心，在超凈臺(tái)中小心棄掉凍存液。往凍存管中加入0.5ml RPMI1640培養(yǎng)基(含10%血清和1%青鏈霉素混合液)，重新懸浮細(xì)胞，吹打混勻后移入60mm培養(yǎng)皿，補(bǔ)加2.5ml培養(yǎng)基，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)到培養(yǎng)皿的90%～95%，進(jìn)行細(xì)胞傳代，3次傳代后取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H446細(xì)胞待用。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組及給藥 實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、熱處理組、ESPs處理組、熱處理聯(lián)合ESPs組。對(duì)照組：H446細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中不作任何處理；熱處理組：將細(xì)胞消化后放置離心管中在42℃水浴中加熱2h；ESPs處理組：將提取的旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)ESPs用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋成0.15mg/ml、0.3mg/ml、0.6mg/ml，分別與H446細(xì)胞共培養(yǎng)；熱處理聯(lián)合ESPs組：先經(jīng)水浴處理后加入各濃度的ESPs。

1.6 MTT法檢測(cè)H446細(xì)胞增殖抑制率 按1.5分組處理細(xì)胞，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H446細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化后，以6×103個(gè)/孔，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100μl，每組各設(shè)5個(gè)復(fù)孔，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，吸棄上清。ESPs組、熱處理聯(lián)合ESPs組每孔加入200μl ESPs。對(duì)照組、熱處理組每孔加入200μl不含ESPs的RPMI1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h、48h后，每孔補(bǔ)加20μl MTT溶液(5mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4h后吸棄上清，每孔加入150μl DMSO，振板10min,通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度OD值，計(jì)算不同處理方法對(duì)細(xì)胞的抑制率。抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×100%。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,數(shù)據(jù)間的比較采用ONEWAY-ANOVA，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

結(jié)果顯示，熱處理組、ESPs處理組、熱處理聯(lián)合ESPs處理組均對(duì)H446細(xì)胞有明顯的抑制作用，呈現(xiàn)出劑量—時(shí)間依賴性效應(yīng)(圖1、圖2)。H446細(xì)胞在ESPs單獨(dú)作用下，隨著藥物濃度的逐漸增大，時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制率也在增大，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)。熱處理聯(lián)合ESPs處理能抑制小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞增殖，并且隨著藥物濃度的逐漸增大，時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制率也增大，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)。熱療聯(lián)合ESPs處理組對(duì)H446細(xì)胞的抑制作用最強(qiáng)，與同時(shí)間同濃度ESPs處理組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)，與同時(shí)間熱處理組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)。見(jiàn)表1、表2。

圖1 ESPs對(duì)H446細(xì)胞的抑制率

圖2 熱療聯(lián)合ESPs對(duì)H446細(xì)胞的抑制率

ESPs濃度(mg/ml)24h48h 0.1512.72±1.07?16.25±0.95? 0.3017.11±0.59?20.25±1.45? 0.6020.98±1.39?28.09±3.17?

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

3 討論

根據(jù)國(guó)家癌癥中心發(fā)布的《2018中國(guó)腫瘤登記年報(bào)》顯示，由于人口老齡化和新的不健康生活方式的出現(xiàn)，世界范圍內(nèi)的癌癥負(fù)擔(dān)正在迅速上升。

表2 熱療聯(lián)合旋毛蟲(chóng)ESPs對(duì)H446細(xì)胞抑制率

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

癌癥是導(dǎo)致人死亡的主要原因之一，并在中國(guó)造成了沉重的疾病負(fù)擔(dān)。其中肺癌位居惡性腫瘤發(fā)病率和死亡率第一位，且人數(shù)呈遞增趨勢(shì)[5]。因此如何安全、有效治療肺癌在醫(yī)學(xué)界受到廣泛關(guān)注。

近年來(lái)腫瘤生物制劑的發(fā)現(xiàn)成為了研究熱點(diǎn)。李慧萍等[6]成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET-28a(+)-A200711，A200711蛋白以包涵體形式在大腸桿菌中進(jìn)行了高效表達(dá)。經(jīng)SDS-PAGE及Westernblot分析確定蛋白為旋毛蟲(chóng)抗腫瘤基因A200711表達(dá)產(chǎn)物。將A200711蛋白作用于H7402細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)隨著濃度的增大，增殖抑制率也在增大，增殖抑制率與濃度之間存在量效關(guān)系，同時(shí)隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)增殖抑制率也明顯增加。陳文輝等[7]發(fā)現(xiàn)感染不同階段旋毛蟲(chóng)的小鼠血清及幼蟲(chóng)抗原均可抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞活力，誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡。羅婧梅等[8-9]研究發(fā)現(xiàn)旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)排泄分泌蛋白(ESPs)存在抑制腫瘤的成分，并且能夠發(fā)揮抑制小細(xì)胞肺癌H446增殖和誘導(dǎo)H446細(xì)胞凋亡的作用。

腫瘤熱療，即應(yīng)用熱能治療腫瘤的一種方法，是繼手術(shù)、放療、化療、生物等療法之外的又一種重要的腫瘤治療方法。熱療抗腫瘤的機(jī)制主要包括對(duì)腫瘤細(xì)胞膜和腫瘤細(xì)胞骨架的影響、對(duì)腫瘤血管的影響、引起腫瘤細(xì)胞的凋亡、提高自身免疫力等[10]。Kalamida等[11]研究發(fā)現(xiàn)，不同溫度進(jìn)行順鉑治療肺腺癌H1299細(xì)胞的過(guò)程中，40℃熱療聯(lián)合化療治療組與常溫化療組相比，H1299細(xì)胞存活率、增殖指數(shù)均明顯下降，其中細(xì)胞存活率可減少2/3，同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)熱療化療聯(lián)合治療組的細(xì)胞內(nèi)半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9含量上升，熱休克蛋白90含量下降。Wang等[12]的一項(xiàng)針對(duì)82例晚期非小細(xì)胞肺癌患者的隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，采用射頻熱療聯(lián)合GP方案(吉西他濱聯(lián)合順鉑)治療4周期的熱療化療聯(lián)合治療組患者的臨床獲益率達(dá)90.70%，較單純GP方案(71.79%)明顯提高，同時(shí)兩組患者化療相關(guān)不良反應(yīng)發(fā)生率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

本研究發(fā)現(xiàn)42℃加熱2h聯(lián)合旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)ESPs可以抑制H446細(xì)胞增殖，與對(duì)照組比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)。熱療聯(lián)合ESPs處理組對(duì)H446細(xì)胞的抑制作用最強(qiáng)，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)。H446細(xì)胞在ESPs單獨(dú)作用下，隨著藥物濃度的增大，抑制率也在逐漸增大，濃度為0.15mg/ml、0.30mg/ml、0.60mg/ml的排泄分泌蛋白于48h抑制率分別達(dá)16.25%、20.25%、28.09%，單獨(dú)熱處理組，抑制率達(dá)49.50%。42℃加熱2h聯(lián)合旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)ESPs，濃度為0.15mg/ml、0.30mg/ml、0.60mg/ml分別達(dá)49.98%、55.52%、57.46%，與同濃度單獨(dú)使用比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)，說(shuō)明42℃加熱可增加細(xì)胞對(duì)ESPs的敏感性，為進(jìn)一步研究提供了一定依據(jù)。