伍 豪，高利軍，黃 娟，高 菊，卿冬進(jìn)，戴高興，梁海福，周維永*

(1.廣西作物遺傳改良生物技術(shù)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530007；2.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所，廣西 南寧 530007)

【研究意義】水稻是世界上最重要的糧食作物之一，全球超過(guò)一半以上的人口以稻米為主食。隨著生活水平的提高，消費(fèi)者對(duì)優(yōu)質(zhì)米的要求是不僅口味適合，還要粒形美觀。在水稻育種過(guò)程中，粒形也是必須選擇的性狀，因?yàn)榱Ｐ尾粌H影響水稻的產(chǎn)量，也影響著稻米的外觀品質(zhì)和商品價(jià)值[1]。水稻粒型已成為當(dāng)前消費(fèi)者與育種家的共同關(guān)注熱點(diǎn)之一。一般說(shuō)來(lái)，水稻粒形包括粒長(zhǎng)、粒寬、粒厚及長(zhǎng)寬比等性狀，而粒長(zhǎng)是最能反映粒形的指標(biāo)[2]。在南方地區(qū)，由于高溫“逼熟”，谷粒越寬灌漿越難，導(dǎo)致米質(zhì)下降，一般細(xì)長(zhǎng)粒稻米的堊白率較低，其外觀品質(zhì)也較好[3]。粒長(zhǎng)負(fù)調(diào)控基因GS3在第2外顯子中編碼第55位的密碼子發(fā)生了無(wú)義突變，導(dǎo)致蛋白翻譯提前終止，蛋白的C-端178個(gè)氨基酸缺失，從而使得OSR結(jié)構(gòu)域功能喪失，水稻粒形變長(zhǎng)[4]。因此，建立GS3基因的功能標(biāo)記用于分子標(biāo)記輔助選擇育種將對(duì)水稻粒長(zhǎng)及品質(zhì)的改良發(fā)揮重要作用?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】Wang等[5]利用近等基因系對(duì)GS3長(zhǎng)粒等位基因進(jìn)行聚合育種，其研究結(jié)果表明GS3基因?qū)υ黾恿ｉL(zhǎng)和粒重起到非常關(guān)鍵的作用。楊梯豐等[6]利用攜帶有GS3基因的單片段代換系進(jìn)行聚合育種，證實(shí)了該基因在不同的遺傳背景下均具有谷粒增長(zhǎng)的效應(yīng)。張劍霞等[7]利用標(biāo)記SF28將GS3的長(zhǎng)粒等位基因聚合到了珍汕97B和II-32B中，獲得各自粒長(zhǎng)得到改良的株系?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】Fan等[8]開(kāi)發(fā)的標(biāo)記SF28需要使用限制性內(nèi)切酶，操作繁瑣，成本高，不利于育種應(yīng)用。因此，開(kāi)發(fā)出不用酶切，直接利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)產(chǎn)物的功能標(biāo)記，并將該標(biāo)記運(yùn)用于改良綜合性狀優(yōu)良的水稻親本粒長(zhǎng)中，以助推利用GS3基因的分子標(biāo)記輔助選擇長(zhǎng)粒型水稻品種的育種工作?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】利用GS3基因與其等位基因的序列差異，開(kāi)發(fā)出GS3基因的功能標(biāo)記，對(duì)24個(gè)水稻親本材料進(jìn)行基因分型，并結(jié)合粒長(zhǎng)表型分析，驗(yàn)證標(biāo)記的有效性。同時(shí)，將GS3長(zhǎng)粒等位基因?qū)攵塘Ｋ居H本中，利用該標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇，以期獲得粒長(zhǎng)增加的優(yōu)良水稻親本材料。

1 材料與方法

1.1 供試材料

含有GS3長(zhǎng)粒等位基因的長(zhǎng)粒水稻品種宜香B，粒長(zhǎng)為10.1 mm，含有GS3基因的短粒水稻品種美B，粒長(zhǎng)為7.9 mm。24個(gè)在水稻育種中廣泛使用的親本(表1)及宜香B與美B雜交、回交后的BC2F7群體。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)記設(shè)計(jì) 從 NCBI 網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下載水稻粒型基因GS3序列，序列號(hào)為DQ355996，利用 Primer Premier5.0軟件對(duì)GS3序列進(jìn)行分析和設(shè)計(jì)引物。根據(jù)Fan[4]等報(bào)道的GS3基因中第 2 外顯子上的編碼區(qū)+165位置C-A單堿基替換，設(shè)計(jì)出含有3條引物的標(biāo)記M-GS3.

1.2.2 材料種植與DNA提取 供試水稻材料全部種植于廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻試驗(yàn)田，于插秧后14 d單株取葉片，按Murray[9]等的CTAB法提取水稻DNA。

1.2.3 粒型測(cè)定 利用SC-G型自動(dòng)種子拷種儀測(cè)量24個(gè)水稻品種和BC2F7群體中的入選單株。每個(gè)品種隨機(jī)取10個(gè)單株，每株隨機(jī)選取100粒飽滿籽粒測(cè)定，取平均值作為粒長(zhǎng)的表型值。

1.2.4 PCR擴(kuò)增 反應(yīng)體系為20 μl：2.0 μl的 10×Buffer、2.0 μl的 dNTPs(2.5 mmol/L)、4 μmol/L 的引物gs3F、gs3In和gs3R各1.0 μl、0.2 μlTaqDNA聚合酶(5 U/ μl)，2.0 μl模板DNA，12.8 μl ddH2O。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃ 5 min，然后94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s，循環(huán)35次；最后72 ℃延伸10min得到擴(kuò)增物，將擴(kuò)增產(chǎn)物在添加了5 μl Biotium公司生產(chǎn)的GelRed核酸染料的1.5 %瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，紫外燈下觀察拍照。

1.2.5 育種應(yīng)用 利用含有GS3長(zhǎng)粒等位基因的水稻保持系宜香B為供體親本，保持系美B為受體親本進(jìn)行雜交，在后用美B為輪回親本，后代用標(biāo)記M-GS3選擇含粒長(zhǎng)等位基因GS3存在的單株連續(xù)回交到BC2F1，然后連續(xù)自交，并結(jié)合標(biāo)記選擇與粒長(zhǎng)表型測(cè)定，最后從BC2F7群體中選擇農(nóng)藝性狀與美B一致且粒長(zhǎng)顯著超過(guò)美B的株系。

2 結(jié)果與分析

2.1 GS3基因功能標(biāo)記的建立

根據(jù)粒型基因GS3的序列中第2外顯子上的編碼區(qū)+165位置的1個(gè)由堿基C到堿基 A的單核苷酸替換，首先設(shè)計(jì)了一條能匹配長(zhǎng)粒等位基因GS3的引物gs3In：GCAGGCTGGCTTACTtTCTT，在其3′端引入了一個(gè)錯(cuò)配堿基T，并在其上游設(shè)計(jì)一條引物gS3F：ATTGGCTTGATTTCCTGTGC，下游設(shè)計(jì)一條引物gs3R：TTGCTCTTACGGGAGGACAC。3條引物同時(shí)在PCR體系中進(jìn)行擴(kuò)增，GS3長(zhǎng)?；虻男蛄信cgs3In只有一個(gè)堿基錯(cuò)配，可以擴(kuò)增出720和308 bp的兩條帶；而GS3短粒等位基因與引物gs3In有2個(gè)堿基錯(cuò)配，不能擴(kuò)增出308 bp的條帶來(lái)，只有1條720 bp的條帶。這樣擴(kuò)增產(chǎn)物不需要進(jìn)行酶切，直接電泳檢測(cè)是否含有兩條帶，就能檢測(cè)出樣品中是否含GS3長(zhǎng)粒等位基因。

2.2 GS3的功能標(biāo)記在育種親本中的驗(yàn)證

利用引物M-GS3對(duì)24份不同粒長(zhǎng)的水稻親本材料進(jìn)行檢測(cè)(圖1)。檢測(cè)結(jié)果顯示，在泰豐B，內(nèi)香B，協(xié)青早B等11份材料中含有長(zhǎng)粒等位基因GS3，而其他材料中不含有該基因(表1)。對(duì)24份材料的粒長(zhǎng)測(cè)定顯示，含有GS3長(zhǎng)粒等位基因的品種粒長(zhǎng)為8.7～13.1 mm，明顯大于粒長(zhǎng)位于6.7～8.5 mm的含有短粒等位基因GS3的品種。這一結(jié)果表明，引物M-GS3可以準(zhǔn)確的檢測(cè)出不同水稻材料中是否含有GS3長(zhǎng)粒等位基因，這將有助于發(fā)掘含有GS3長(zhǎng)粒等位基因的水稻材料，為水稻粒型改良的育種工作提供材料基礎(chǔ)。

表1 24個(gè)水稻品種及其粒長(zhǎng)表型和基因性Table 1 Phenotype and genotype of grain length of 24 rice varieties

2.3 GS3的功能標(biāo)記對(duì)水稻粒型的改良

利用標(biāo)記M-GS3對(duì)美B與宜香B的BC2F7群體進(jìn)行檢測(cè)(圖2)，并對(duì)其農(nóng)藝性狀進(jìn)行調(diào)查，根據(jù)基因型及粒長(zhǎng)表型，篩選到10株農(nóng)藝性狀與美B接近，粒長(zhǎng)大于9.5 mm的株系。將這些株系與其親本美B和宜香B的農(nóng)藝性狀進(jìn)行比較(表2)，發(fā)現(xiàn)改良后的美B材料82B其長(zhǎng)寬比為4.14，遠(yuǎn)超過(guò)兩親本的長(zhǎng)寬比，其千粒重，粒長(zhǎng)，粒寬，長(zhǎng)寬比，等與產(chǎn)量和品質(zhì)相關(guān)的性狀相對(duì)于親本美B來(lái)說(shuō)都得到了提高，經(jīng)t檢驗(yàn)表明，這幾個(gè)性狀與美B相比都達(dá)到了極顯著；而82B的株高、穗長(zhǎng)、有效穗和結(jié)實(shí)率等性狀與美B接近，t檢驗(yàn)表明這些性狀與美B無(wú)顯著差異(圖3)。這充分說(shuō)明了利用宜香B為GS3長(zhǎng)粒等位基因的供體親本，并利用M-GS3為標(biāo)記的分子標(biāo)記輔助選擇對(duì)美B粒長(zhǎng)和產(chǎn)量的提高的有效性。

M：Marker200；1： II-32B；2： BX-16；3：崗46B；4：特B；5：良豐B；6：112B；7：西菲B；8：龍豐B；9：博IIB；10：158B；11：地谷B；12：福伊B；13：谷梅4號(hào)；14：02428；15：南粳46；16：BL122；17：博IIIB；18：協(xié)青早B；19-B5；20：IRBB7；21：L427；22：金23B；23：內(nèi)香B；24：泰豐BM:Marker200；1:II-32B；2:BX-16；3:Gang 46B；4:Te B；5:Liangfeng B；6:112B；7:XifeiB；8:Longfeng B；9:Bo IIB；10:158B；11:Digu B；12:Fuyi B；13:Gumei 4；14:02428；15:Nanjing 46；16:BL122；17:Bo IIIB；18:Xieqing:zao B；19:B5；20:IRBB7；21:L427；22:jin 23B；23:Neixiang B；24:Taifeng B圖1 24個(gè)水稻品種分子標(biāo)記的電泳圖Fig.1 Detection of 24 rice varieties by marker M-GS3

M:Marker200；1～5、7～24：含有GS3長(zhǎng)粒等位基因的材料；6：含有GS3短粒等位基因的材料M:Marker200;1-5,7-24:Materials containing GS3 long grain allele；6:Materials containing GS3 short grain allele圖2 標(biāo)記M-GS3對(duì)BC2F7群體進(jìn)行檢測(cè)Fig.2 Detection of BC2F7 population by marker M-GS3

表2 親本和入選單株的農(nóng)藝性狀比較Table 2 Comparison of agronomic characters between parents and selected individuals

注：*代表與美B相比的t檢驗(yàn)值達(dá)到極顯著性差異(P<0.05)。
Notes：* indicate significant difference with t-test by comparing with MeiB(P<0.05).

3 討 論

谷粒長(zhǎng)度不僅影響水稻的產(chǎn)量性狀——千粒重，也影響稻米的外觀品質(zhì)和商品價(jià)值[10]。因此，廣大育種工作者都十分關(guān)注對(duì)水稻粒長(zhǎng)的改良。在水稻粒型改良的育種工作中，GS3是少數(shù)在常規(guī)品種中已經(jīng)廣泛受到人工正向選擇，并在生產(chǎn)中發(fā)揮作用的粒長(zhǎng)基因[11]。在對(duì)GS3長(zhǎng)粒等位基因的利用中，前人多采用CAPS標(biāo)記及連鎖標(biāo)記進(jìn)行選擇。Fan等[8]基于GS3基因第2外顯子的C-A突變，開(kāi)發(fā)了一個(gè)酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列(CAPS)標(biāo)記SF28，并用與育種實(shí)踐。李揚(yáng)等[12]用含有GS3長(zhǎng)粒等位基因的長(zhǎng)粒品種三粒寸、IAC1246、JAPPENI、TUNGKUNGO和MIGA作為供體親本，SAGC4為受體親本，采用標(biāo)記SF28，對(duì)GS3長(zhǎng)粒等位基因進(jìn)行選擇，從BC2F2代分離群體中直接篩選出長(zhǎng)粒且綜合農(nóng)藝性狀好的優(yōu)良單株，證實(shí)了不同供體親本對(duì)受體親本SAGC4粒長(zhǎng)增加的貢獻(xiàn)基本相同，都可以達(dá)到快速改良SAGC4粒長(zhǎng)和長(zhǎng)寬比性狀的目的。方珊茹等[13]將GS3長(zhǎng)粒等位基因及其他外觀品質(zhì)性狀基因?qū)胨静牧螴I-32B中，在利用連鎖標(biāo)記MR5881和GS09對(duì)GS3長(zhǎng)粒等位基因進(jìn)行選擇，獲得了粒長(zhǎng)、谷粒長(zhǎng)寬比和粒重均得到改良的株系。本研究利用GS3基因與其等位基因的序列差異，設(shè)計(jì)出了標(biāo)記M-GS3，該標(biāo)記是位于基因內(nèi)的功能標(biāo)記，產(chǎn)物不用酶切，相較于連鎖標(biāo)記及CAPS標(biāo)記有著準(zhǔn)確度高，操作簡(jiǎn)便，成本低等特點(diǎn)。利用標(biāo)記M-GS3對(duì)含有不同粒型基因的24份水稻親本材料及育種群體材料進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)該標(biāo)記能夠在不同遺傳背景的水稻材料中準(zhǔn)確的鑒定出GS3基因及其等位基因，說(shuō)明了該標(biāo)記可以用于對(duì)GS3基因的分子標(biāo)記輔助育種及對(duì)水稻種質(zhì)資源中的GS3基因進(jìn)行鑒定。這將有利于推進(jìn)GS3基因在水稻粒型改良中的更廣泛使用，并為培育出長(zhǎng)粒型優(yōu)質(zhì)水稻提供材料基礎(chǔ)。

本研究利用美B和宜香B進(jìn)行雜交，將宜香B中的GS3長(zhǎng)粒等位基因?qū)朊繠中，在以美B為輪回親本，經(jīng)連續(xù)回交和自交，并結(jié)合M-GS3標(biāo)記的檢測(cè)及粒長(zhǎng)表型鑒定，選育出了粒長(zhǎng)改良后的美B材料82B，其平均粒長(zhǎng)為9.87 mm。通過(guò)t檢驗(yàn)表明，82B的粒長(zhǎng)，千粒重，長(zhǎng)寬比等與產(chǎn)量和米質(zhì)相關(guān)的性狀都得極顯著提高，而株高，穗長(zhǎng)，有效穗數(shù)和結(jié)實(shí)率等性狀與美B接近，變化不顯著。這一結(jié)果與Wang等[5]的研究結(jié)果GS3基因?qū)υ黾恿ｉL(zhǎng)和粒重起到非常關(guān)鍵的作用一致，也進(jìn)一步驗(yàn)證了標(biāo)記M-GS3對(duì)GS3基因選擇的有效性及GS3基因?qū)λ玖ｉL(zhǎng)和粒重影響的主效性。

圖3 親本與改良后代的粒長(zhǎng)表型Fig.3 Grain length phenotype of parents and improved progenies

4 結(jié) 論

通過(guò)對(duì)GS3基因的序列進(jìn)行分析，開(kāi)發(fā)出了GS3基因的功能標(biāo)記M-GS3。通過(guò)對(duì)不同水稻親本材料及育種改良群體材料的檢查并結(jié)合粒長(zhǎng)測(cè)量，發(fā)現(xiàn)該標(biāo)記可有效的對(duì)水稻中的GS3基因進(jìn)行選擇。利用該標(biāo)記對(duì)導(dǎo)入了GS3長(zhǎng)粒等位基因的美B材料進(jìn)行輔助選擇，獲得了粒長(zhǎng)，千粒重和長(zhǎng)寬比都顯著高于美B，而其他農(nóng)藝性狀與美B接近的材料，這些材料可進(jìn)一步運(yùn)用到優(yōu)質(zhì)稻育種中。