李玥彤,隋 怡,郝曉偉,李小強(qiáng),劉文娟,曹 蔚,3

(1 西北農(nóng)林科技大學(xué) 化學(xué)與藥學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2 第四軍醫(yī)大學(xué) 藥學(xué)系，陜西 西安 710032；3 國家中醫(yī)藥管理局 中藥胃腸藥理重點研究室，陜西 西安 710032)

中藥山茱萸是山茱萸科落葉小喬木山茱萸(Fructuscorni)的干燥成熟果肉，俗名山萸肉、藥棗、肉棗等。山茱萸藥用記載首見于《神農(nóng)本草經(jīng)》，是我國常用的傳統(tǒng)藥材，應(yīng)用十分廣泛。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，其味酸澀，性微溫，歸肝腎兩經(jīng)，具有補(bǔ)益肝腎、澀精固脫之功效[1]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，山茱萸具有降血糖、抗氧化、抗菌和抗炎等多種藥理作用[2]。近年來，對山茱萸化學(xué)成分及其藥理作用已有不少報道，其中對環(huán)烯醚萜類和有機(jī)酸類的研究較為深入[3]，但對其多糖類化學(xué)成分的研究報道較少，特別是對山茱萸葉多糖更是少有關(guān)注。隨著糖生物化學(xué)的發(fā)展，多糖獨特的生物活性和較低毒副作用使其具有較大的藥物開發(fā)潛力，人們逐漸認(rèn)識到多糖及其復(fù)合物在生命活動中的重要作用。

本研究以山茱萸干燥葉為原料，通過水提醇沉法、過氧化氫除色素等步驟，得到山茱萸葉多糖(PFC)；采用比色法對其多糖、糖醛酸等含量進(jìn)行分析，并用由Honda等[4-5]建立的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)柱前衍生化高效液相色譜法(HPLC)分析其單糖組成；測定PFC對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(DPPH·)、羥自由基(·OH)的清除能力以及亞鐵離子絡(luò)合能力；并以H2O2誘導(dǎo)的人肝癌HepG2細(xì)胞為氧化損傷模型，測定不同質(zhì)量濃度PFC對細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用和對細(xì)胞內(nèi)丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)的影響，以期為山茱萸資源的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 植物材料 山茱萸葉于2016年10月采自陜西省周至縣境內(nèi)，經(jīng)西北農(nóng)林科技大學(xué)化學(xué)與藥學(xué)院段琦梅副教授鑒定為山茱萸(Fructuscorni)的葉。

1.1.2 儀 器 DZTW型調(diào)溫電熱套(上?？坪銓崢I(yè)發(fā)展有限公司)，RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)，SHZ-D-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(河南省豫華儀器有限公司)，Dionex UltiMate 3000液相色譜儀(美國戴安公司)，TDZ5-WS型離心機(jī)(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)，AX224ZH/E電子分析天平(奧豪斯儀器有限公司)，F(xiàn)D5-series凍干機(jī)(金西盟儀器有限公司)，UV-2600紫外分光光度計(天美科學(xué)儀器有限公司)，F(xiàn)E28-Standard酸度計(瑞士梅特勒-托利多集團(tuán))，Bio-Tek多功能酶標(biāo)儀(美國伯騰儀器有限公司)，超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)。

1.1.3 試 劑 人肝癌細(xì)胞株HepG2為西北農(nóng)林科技大學(xué)化學(xué)與藥學(xué)院陜西省天然產(chǎn)物化學(xué)生物學(xué)重點實驗室傳代保存株。葡萄糖、甘露糖、葡萄糖醛酸、咔唑(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，鼠李糖、半乳糖、半乳糖醛酸、阿拉伯糖、巖藻糖、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2′,7′-二氫二氯熒光黃雙乙酸鈉(DCFH-DA)、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)(Sigma-aldrich公司)，甲醇、乙腈(色譜純，Sigma-aldrich公司)，四氫呋喃(色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)，丙二醛(MDA)檢測試劑盒、蛋白質(zhì)檢測(考馬斯亮藍(lán)法)測試盒購自碧云天生物技術(shù)研究所。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 山茱萸葉多糖(PFC)的制備

取山茱萸干燥葉500 g，用3 L體積分?jǐn)?shù)90%乙醇回流脫脂3次，每次2 h；脫脂后的藥材揮干乙醇，用3倍體積的水回流提取3次，每次2 h[6-7]。用紗布過濾，合并上清液，減壓濃縮后于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。取所得濃縮上清液，攪拌過程中緩慢加入上清液2倍體積的無水乙醇，4 ℃放置過夜，3 000 r/min離心10 min，收集沉淀。加入適量的蒸餾水溶解沉淀，反復(fù)凍融8次，離心收集上清液，再用Sevag法[8]除蛋白，將上清液濃縮至浸膏。按樣品質(zhì)量體積比1∶1.5加入體積分?jǐn)?shù)30% H2O2去除色素(80 ℃，3 h)[9]。濃縮至小體積后用蒸餾水透析48 h，透析液減壓濃縮、冷凍干燥后得PFC 6.797 g，置于干燥器中保存。

1.3 PFC理化性質(zhì)的測定

總糖含量采用苯酚-硫酸法[10]測定，糖醛酸含量采用硫酸-咔唑法[11]測定，可溶性蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)G250染色法[12]測定，硫酸根含量采用氯化鋇-明膠比濁法[13]測定。分別以半乳糖、半乳糖醛酸、牛血清白蛋白和硫酸根的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)X，吸光度為縱坐標(biāo)Y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程。以上測定重復(fù)3次。

1.4 PFC單糖組成的測定

1.4.1 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)衍生物的制備 稱取甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和巖藻糖各5 mg，置于8個試管中，加入去離子水0.5 mL溶解。然后分別取400 μL置于8個具塞離心管中，先后加入0.3 mol/L NaOH 200 μL和0.5 mol/L PMP甲醇溶液400 μL，充分振蕩，于70 ℃水浴30 min。取出冷卻至室溫，加入0.3 mol/L HCl中和。再依次加入2 mL去離子水和4 mL氯仿，渦旋萃取，離心分層，用注射器吸棄下層有機(jī)層，上層水相重復(fù)萃取2次[14]，得標(biāo)準(zhǔn)單糖PMP衍生物。根據(jù)參考文獻(xiàn)[15]的方法制備PFC全水解產(chǎn)物，吸取400 μL，再用上述方法制備PFC全水解產(chǎn)物的PMP衍生物。

1.4.2 色譜條件 色譜柱：AccliamTM120 C18分析柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：100 mmol/L 乙酸銨水溶液(pH=5.0)/四氫呋喃/乙腈，三者體積比為79∶2∶19[16-17]；流速：1.0 mL/min；檢測波長：250 nm；進(jìn)樣體積:10 μL；柱溫：25 ℃。

1.5 PFC的體外抗氧化活性評價

1.5.1 樣品制備 取1.2節(jié)中所得PFC 0.4 g溶于10 mL去離子水中，充分溶解，用去離子水稀釋至質(zhì)量濃度分別為0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mg/mL；同時配制相同質(zhì)量濃度的維生素C(VC)或乙二胺四乙酸(EDTA)水溶液作為陽性對照。

1.5.2 PFC對自由基的清除活性 (1)清除DPPH·活性。參考Li等[18]和Ren等[19]的方法，分別取4.5 mL不同質(zhì)量濃度PFC溶液和VC陽性對照溶液加入試管，再取1.5 mL DPPH乙醇溶液(1.0×10-4mol/L)加入試管，混勻，室溫避光靜置30 min。用無水乙醇做參比，在517 nm處測定吸光度(OD1)；取1.5 mL DPPH乙醇溶液和4.5 mL去離子水加入試管，混勻，在517 nm處測定吸光度(OD0)；計算DPPH·清除率。采用Origin 8.5計算清除50% DPPH·時化合物的濃度(IC50)，重復(fù)3次。

(2)清除·OH活性。分別取0.2 mL不同質(zhì)量濃度PFC溶液和VC陽性對照溶液加入試管，加入1.2 mL含2.67 mmol/L 2-脫氧核糖和0.13 mmol/L EDTA的PBS(10 mmol/L，pH 7.4)溶液，根據(jù)Lai等[20]的方法，在532 nm處測量吸光度(OD1)；以去離子水為空白，測定吸光度(OD0)；計算·OH清除率，重復(fù)3次。

清除率(絡(luò)合率)=[(OD0-OD1)/OD0]×100%。

式中：OD0為空白組值，OD1為試驗組值。

1.5.3 亞鐵離子絡(luò)合活性 參考文獻(xiàn)[21]的方法，分別取1.0 mL不同質(zhì)量濃度PFC溶液和EDTA陽性對照溶液加入試管，依次加入0.1 mL FeCl2(2 mmol/L)溶液和0.2 mL菲洛嗪(5 mmol/L)溶液，混勻后于25 ℃反應(yīng)10 min，在562 nm處測定吸光度(OD1)；另取去離子水做空白，在562 nm處測定吸光度(OD0)；計算亞鐵離子絡(luò)合活性，重復(fù)3次。

1.6 PFC對H2O2誘導(dǎo)氧化損傷細(xì)胞的影響

1.6.1 細(xì)胞培養(yǎng) HepG2細(xì)胞在含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、1×105U/L青霉素與鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞生長至80%時融合傳代。

1.6.2 PFC對HepG2細(xì)胞活力的影響 采用MTT法[22]對HepG2細(xì)胞的活力進(jìn)行測定，選對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞，以每孔100 μL(5×103個細(xì)胞)接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后，再加入用DMEM培養(yǎng)液溶解的PFC溶液(終質(zhì)量濃度為0.025，0.05，0.1，0.2，0.4，0.8 mg/mL)，每處理設(shè)6個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。對照組以培養(yǎng)液代替PFC溶液。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入10 μL 0.5 mg/mL MTT培養(yǎng)4 h，吸棄培養(yǎng)液，再加入150 μL DMSO充分溶解，用酶標(biāo)儀在490 nm處測定吸光度，計算細(xì)胞相對存活率。

細(xì)胞相對存活率=[OD1/OD]×100%。

式中：OD0為對照組值；OD1為試驗組值。

1.6.3 PFC對H2O2誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞活力的影響 選擇對數(shù)生長期HepG2細(xì)胞，接種于96孔板中。培養(yǎng)24 h后，對照組不加PFC和H2O2溶液；模型組不加PFC溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，加入終濃度為400 μmol/L H2O2后再培養(yǎng)4 h[23]；試驗組加入1.6.2節(jié)所制不同質(zhì)量濃度PFC溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，400 μmol/L H2O2處理后再培養(yǎng)4 h。每處理設(shè)6個復(fù)孔，培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入MTT再培養(yǎng)4 h，吸棄培養(yǎng)液后加入DMSO溶解，490 nm處測定吸光度，計算細(xì)胞相對存活率。

1.6.4 PFC對細(xì)胞內(nèi)氧化水平的影響 取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞，以每孔2 mL(2×106個細(xì)胞)接種于6孔板內(nèi)。培養(yǎng)24 h后，對照組不加PFC和H2O2溶液；模型組不加PFC溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，加入終濃度為400 μmol/L的H2O2后再培養(yǎng)4 h[23]；試驗組加入用培養(yǎng)液溶解的PFC溶液(終質(zhì)量濃度為0.2，0.4，0.8 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，400 μmol/L H2O2處理后再培養(yǎng)4 h。每處理設(shè)4個復(fù)孔。

(1)丙二醛(MDA)水平檢測。用PBS清洗HepG2細(xì)胞后，冰浴、超聲破碎，1 600 r/min離心10 min，取上清液按照MDA檢測試劑盒說明書操作。

(2)活性氧(ROS)水平檢測。加入DCFH-DA(終濃度為50 μmol/L)，30 min后用PBS清洗HepG2細(xì)胞，在激發(fā)波長為485 nm、發(fā)射波長為530 nm的熒光酶標(biāo)儀中檢測熒光強(qiáng)度值。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。先行正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗，若符合正態(tài)分布則組間采用t檢驗分析，若不符合正態(tài)分布則采用非參數(shù)檢驗，P<0.05代表統(tǒng)計學(xué)上有顯著差異，P<0.01代表統(tǒng)計學(xué)上有極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 PFC的理化性質(zhì)

比色法測定結(jié)果(表1)顯示，PFC含總糖(612.76±1.72) mg/g，糖醛酸(228.03±0.54) mg/g，可溶性蛋白質(zhì)(9.53±0.38) mg/g和硫酸根(25.21±0.19) mg/g。

表1 山茱萸葉多糖(PFC)的理化性質(zhì)Table 1 The physicochemical properties of the polysacharide from the leaves of Fructus corni

注：X分別為半乳糖、半乳糖醛酸、牛血清白蛋白和硫酸根的質(zhì)量濃度，Y為吸光度。

Notes:Xrepresentsthemassconcentrationofgalactose,galacturonicacid,bovineserumalbuminandsulfateradical,respectively;Yrepresentsabsorbance.

2.2 PFC單糖組成

甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、巖藻糖等8種標(biāo)準(zhǔn)單糖的HPLC色譜圖及PFC的單糖組成色譜圖見圖1。

A.8種標(biāo)準(zhǔn)單糖；B.山茱萸葉多糖全水解產(chǎn)物1.甘露糖；2.鼠李糖；3.葡萄糖醛酸；4.半乳糖醛酸；5.葡萄糖；6.半乳糖；7.阿拉伯糖；8.巖藻糖A.8 standard monosaccharides;B.Total hydrolyzate of PFC；1.Man;2.Rah;3.GlcA;4.GalA;5.Glc;6.Gal;7.Ara;8.Fuc圖1 山茱萸葉多糖單糖組成的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of polysaccharide from Fructus corni leaves

由圖1-A可見，8個標(biāo)準(zhǔn)單糖均達(dá)到基線分離。由圖1-B可見，水解后的PFC分離效果良好，PMP峰未掩蓋單糖峰。以保留時間對PFC的單糖組成進(jìn)行定位，其單糖組成為甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和巖藻糖。采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行定量，計算出甘露糖/鼠李糖/半乳糖醛酸/葡萄糖/半乳糖/阿拉伯糖/巖藻糖的物質(zhì)的量比為1.6∶3.2∶6.2∶5.0∶13.0∶14.1∶1.0。

2.3 PFC的體外抗氧化活性

2.3.1 對自由基的清除活性 (1)DPPH·的清除活性。DPPH·是一種穩(wěn)定的自由基，對它的猝滅能力可以有效地反映抗氧化劑的活性[24]。試驗結(jié)果(圖2)表明，PFC對DPPH·的清除作用顯著，并呈現(xiàn)劑量依賴性，隨著PFC溶液質(zhì)量濃度的增加，清除率逐漸增大，IC50為0.13mg/mL；VC對DPPH·的清除能力亦呈劑量依賴性，IC50為0.15mg/mL?？梢奝FC對DPPH·的清除能力與VC相當(dāng)，PFC質(zhì)量濃度為0.2mg/mL時，對DPPH·的清除率達(dá)到60%以上，可見PFC清除DPPH·的能力顯著。

(2)·OH的清除活性?！H是一種活性氧自由基，可在細(xì)胞內(nèi)與蛋白質(zhì)、脂類、DNA等各種生物大分子發(fā)生反應(yīng)，過量的自由基會誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生氧化損傷[24]。試驗結(jié)果(圖2)表明，PFC具有顯著地清除·OH的作用，隨著PFC溶液質(zhì)量濃度的增加，清除率呈現(xiàn)逐漸增大趨勢，IC50為0.56mg/mL，低于VC(IC50為0.76mg/mL)，說明PFC清除·OH的能力強(qiáng)于VC。

圖2 山茱萸葉多糖對自由基的清除活性Fig.2 Free radical scavenging activities of PFC

2.3.2 亞鐵離子的絡(luò)合活性EDTA作為小分子物質(zhì)與金屬離子有很強(qiáng)的絡(luò)合能力，而多糖上的羥基可作為配體與金屬離子(如Fe2+、Cu2+等)絡(luò)合。山茱萸葉多糖的Fe2+絡(luò)合活性見圖3。

圖3 山茱萸葉多糖的Fe2+絡(luò)合活性Fig.3 Fe2+ chelating activities of PFC

由圖3可見，隨著PFC質(zhì)量濃度的增大，其絡(luò)合亞鐵離子的能力增強(qiáng)，且有明顯的量效關(guān)系，IC50為0.22mg/mL；但與EDTA(IC50為0.15mg/mL)相比，PFC對亞鐵離子的絡(luò)合活性較弱。

2.4 PFC對H2O2誘導(dǎo)氧化損傷HepG2細(xì)胞的影響

2.4.1 對HepG2細(xì)胞損傷的保護(hù)作用 通過MTT試驗檢測PFC對正常人肝癌細(xì)胞株HepG2的作用，結(jié)果(圖4-A)顯示，用不同質(zhì)量濃度PFC溶液培養(yǎng)HepG2細(xì)胞24h后，細(xì)胞相對存活率均大于95%，證明PFC對正常培養(yǎng)狀態(tài)下HepG2細(xì)胞不造成細(xì)胞毒性作用；且隨著PFC質(zhì)量濃度增大，細(xì)胞存活率逐漸上升；當(dāng)PFC為0.8mg/mL時，與對照組相比，對細(xì)胞生長有顯著的促進(jìn)作用(P<0.05)。因此，0.025～0.8mg/mL的PFC溶液可以用于后續(xù)試驗。

PFC對H2O2誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞損傷保護(hù)作用如圖4-B所示，HepG2細(xì)胞經(jīng)H2O2(400μmol/L)直接處理4h后，其細(xì)胞存活率下降至62.22%。但PFC可有效減緩H2O2對HepG2細(xì)胞的損傷， 0.2，0.4，0.8mg/mLPFC溶液均能極顯著提高HepG2細(xì)胞相對存活率(P<0.01)；當(dāng)PFC質(zhì)量濃度為0.4mg/mL時，細(xì)胞活力達(dá)最大值，相對存活率達(dá)92.75%以上。

與對照組(CK)比較，*P<0.05，**P<0.01Compared with control group (CK)，*P<0.05，**P<0.01圖4 山茱萸葉多糖對正常HepG2細(xì)胞(A)和H2O2誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞(B)的作用Fig.4 Effect of PFC on normal(A)and H2O2 induced oxidative stress (B) HepG2 cells

2.4.2 對H2O2誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞內(nèi)MDA和ROS水平的影響 脂質(zhì)過氧化過程中發(fā)生的氧自由基氧化生物膜的過程，使細(xì)胞膜的流動性和通透性改變，導(dǎo)致細(xì)胞和細(xì)胞器結(jié)構(gòu)損傷和功能障礙。MDA是脂質(zhì)過氧化終端產(chǎn)物之一，可反映脂質(zhì)過氧化水平，被廣泛用于評價細(xì)胞氧化應(yīng)激[25]。由圖5-A可見，與對照組相比，HepG2細(xì)胞經(jīng)H2O2(400μmol/L)直接處理4h后，532nm下細(xì)胞內(nèi)的吸光度極顯著增大(P<0.01)，說明H2O2能引起HepG2細(xì)胞內(nèi)MDA水平的升高。經(jīng)不同質(zhì)量濃度PFC溶液處理后，與模型組相比，HepG2細(xì)胞內(nèi)MDA水平明顯降低，且呈現(xiàn)劑量依賴性，說明PFC可以有效抑制氧化損傷細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的生成。

細(xì)胞內(nèi)過多的活性氧自由基會對細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用，損傷生物膜、蛋白質(zhì)、核酸等，導(dǎo)致疾病和衰老的發(fā)生，因此活性氧水平是衡量細(xì)胞氧化損傷的重要指標(biāo)[25]。由圖5-B可見，未用PFC的氧化損傷HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS含量比對照組高70%以上，不同質(zhì)量濃度PFC溶液培養(yǎng)均可降低HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS含量，且呈現(xiàn)劑量依賴性。與模型組比較，當(dāng)PFC溶液為0.4mg/mL時，胞內(nèi)ROS含量顯著降低(P<0.05)；當(dāng)用0.8mg/mLPFC溶液處理細(xì)胞時，胞內(nèi)ROS含量極顯著降低(P<0.01)，胞內(nèi)ROS含量與對照組無顯著性差異(P>0.05)。

與對照組比較，*表示P<0.05，**表示P<0.01；與模型組比較，#表示P<0.05，##表示P<0.01Compared with control group，*P<0.05，**P<0.01；compared with model group，#P<0.05，##P<0.01

3 討 論

多糖亦稱多聚糖，是指由10個及以上單糖殘基通過糖苷鍵連接而成的天然高分子化合物[26]。多糖在抗腫瘤、抗炎、抗病毒、降血糖、防衰老、抗凝血和免疫調(diào)節(jié)等方面具有重要的生物活性[27]。以多糖結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，研究其在免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化等方面的生物活性功能是該領(lǐng)域進(jìn)一步發(fā)展和應(yīng)用的重點。

本研究評價了PFC對DPPH·和·OH清除能力、亞鐵離子絡(luò)合活性以及其對H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞活力的影響，發(fā)現(xiàn)PFC對DPPH·的IC50為0.13mg/mL，對·OH的IC50為0.56mg/mL，其抗氧化能力與VC相當(dāng)；經(jīng)H2O2處理的HepG2細(xì)胞，細(xì)胞存活率下降至62.22%，胞內(nèi)MDA和ROS水平上升；而不同質(zhì)量濃度PFC溶液均可提高細(xì)胞相對存活率，當(dāng)PFC為0.4mg/mL時，胞內(nèi)MDA和ROS含量均顯著降低，且細(xì)胞活力達(dá)最大值，相對存活率達(dá)92.75%以上。本研究結(jié)果可為PFC在生物藥品資源、功能性食品領(lǐng)域的開發(fā)和應(yīng)用提供參考。