劉禮輝，胡 蕾,2，楊圓圓，方 偉，林 強，付小哲，梁紅茹，趙永亮,4，李寧求

(1 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 珠江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部漁用藥物創(chuàng)制重點實驗室，廣東省水產(chǎn)動物免疫技術(shù)重點實驗室，廣東 廣州 510380；2 上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306；3 廣東省水生動物疫病預(yù)防控制中心，廣東 廣州 510222；4 華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院， 湖北 武漢 430070)

舒伯特氣單胞菌(Aeromanasschubertii)屬氣單胞菌科 (Aeromonadaceae)、氣單胞菌屬(Aeromanas)，為革蘭氏陰性桿菌。該菌廣泛存在于淡水、海水、土壤、魚類和脊椎動物腸道中，可導(dǎo)致傷口感染、神經(jīng)性肌膜炎，是急性腹瀉的重要致病菌，嚴(yán)重的還會引起敗血癥，危及生命。1988年， Hickman-Brenner等[1]在美國德克薩斯州首次發(fā)現(xiàn)人感染舒伯特氣單胞菌。隨后在歐洲[2-3]、中國[4-5]也發(fā)現(xiàn)了由舒伯特氣單胞菌引起的食源性疾病的病例。而舒伯特氣單胞菌作為條件致病菌，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中較常見。2012 年，國內(nèi)學(xué)者先后報道了舒伯特氣單胞菌引起的鱧科魚類內(nèi)臟類結(jié)節(jié)病，其發(fā)病時間較短，對鱧科魚類具有較高的致病力和致死率[6-8]，但目前對其病原分布、影響因素、流行規(guī)律等各方面的研究仍不深入和系統(tǒng)，因此建立靈敏高效的病原定量檢測技術(shù)，對該病的早期診斷和防控具有重要意義。

目前，針對舒伯特氣單胞菌的快速檢測方法較少見，僅劉春等[9]根據(jù)該菌的促旋酶B 亞單位基因(gyrB)、溶血素基因(hlyA)的保守序列設(shè)計引物，建立了雙重PCR檢測方法，但該方法僅適用于鱧源舒伯特氣單胞菌，且只能進(jìn)行定性檢測，而無法定量。Nagar等[10]研究表明，應(yīng)用rpoD基因(RNA polymerase sigma-70 factor)分析能有效區(qū)分和鑒別氣單胞菌屬的種類。因此，本研究以舒伯特氣單胞菌rpoD基因為靶基因，建立基于TaqMan探針的舒伯特氣單胞菌熒光定量PCR檢測方法，并采用該方法對50份臨床樣品進(jìn)行對比檢測，旨在為舒伯特氣單胞菌的早期預(yù)警、診斷及防控提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 菌株及臨床樣品

鱧源致病性舒伯特氣單胞菌(Aeromonasschubertii)分離株 WL1483、舒伯特氣單胞菌標(biāo)準(zhǔn)株(A.schubertiiATCC43700)、 嗜水氣單胞菌標(biāo)準(zhǔn)株(A.hydrophilaATCC49140和ATCC7970)、溫和氣單胞菌標(biāo)準(zhǔn)株(A.sobriaATCC43979)、維氏氣單胞菌標(biāo)準(zhǔn)株(A.veroniiATCC35624)、簡氏氣單胞菌(A.jandaeiATCC49568)、鮰愛德華菌標(biāo)準(zhǔn)株(EdwardsiellaictaluriATCC33202)、殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種標(biāo)準(zhǔn)株(A.salmonicidasubsp.salmonicidaATCC33658)、諾卡氏菌(NocardiaseriolaeJZ-1)、遲緩愛德華菌標(biāo)準(zhǔn)株(E.tardaATCC15947)、副溶血弧菌標(biāo)準(zhǔn)株(VibrioparahaemolyticusATCC33846)、海豚鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)株(StreptococcusiniaeATCC 29177)、惡臭假單胞菌(PseudomonasputidaATCC 25571)、熒光假單胞菌(PseudomonasfluorescensBD-1)、柱狀黃桿菌(FlavobacteriumcolumnareGHS061212)和類志賀鄰單胞菌(PlesiomonasshigelloidesHP-1)共16株菌，均由珠江水產(chǎn)研究所魚病室保存。

臨床樣品來源于廣東各地鱧、加州鱸養(yǎng)殖場，包括體表有出血點、內(nèi)臟類結(jié)節(jié)等臨床癥狀的發(fā)病魚和正常魚樣品共30份，養(yǎng)殖水樣品20份。

1.2 引物與TaqMan探針的設(shè)計

從GenBank 數(shù)據(jù)庫中獲取氣單胞菌屬主要種代表性菌株的rpoD基因序列, 采用Vector NTI Suite 9.0軟件對其進(jìn)行同源性分析。針對舒伯特氣單胞菌rpoD基因特異性序列, 采用Premier 5.0生物學(xué)軟件設(shè)計特異引物和探針,上、下游引物序列分別為：rpoD-F.5′-AACATGCGCGAGATGATGGA-3′；rpoD-R.5′-CGCACTCGTTGTTGGTGAAG-3′；探針序列為:rpoD-P：5′-(FAM，熒光基團)-GCTCGACACACATCTTCAGG-(Eclipse，淬滅基團)-3′。將此引物和探針進(jìn)行BLAST同源性比較， 確保其對舒伯特氣單胞菌具有高度特異性。探針和引物委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.3 各菌株基因組DNA的實時熒光定量PCR及特異性檢測

以1.1節(jié)中各菌株基因組DNA為模板，進(jìn)行實時熒光定量PCR擴增，通過觀察擴增曲線判斷其特異性，以雙蒸水為空白對照。參照Premix Ex TaqTM說明書，將上、下游引物及探針、Premix Ex TaqTM、ROX Reference Dye Ⅱ、模板加入到反應(yīng)體系中，于 ABI QuantStudio 6 Flex 熒光定量PCR儀上進(jìn)行熒光定量PCR擴增。熒光定量PCR反應(yīng)體系為20 μL：2×Mix 10 μL，上游引物(10 μmol/L) 0.4 μL，下游引物(10 μmol/L)0.4 μL，熒光探針(5 μmol/L) 0.4 μL，Dye Ⅱ 0.4 μL，DNA 模板2 μL，去離子水6.4 μL。反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性10 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s(收集FAM熒光信號)，擴增40個循環(huán)，反應(yīng)耗時54 min。

1.4 陽性重組質(zhì)粒的制備與檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以舒伯特氣單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC43700 的DNA為模板，用rpoD基因特異性引物擴增rpoD基因保守序列，獲得片段長度為392 bp的PCR產(chǎn)物。將含有目的擴增片段的PCR產(chǎn)物切膠回收、純化，連接到PMD18-T(Takara)質(zhì)粒載體中制備重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，經(jīng)測序分析驗證。用核酸測定儀(D-Drop-1000)測定標(biāo)準(zhǔn)品的濃度，根據(jù)阿伏伽德羅常數(shù)換算出1 μL標(biāo)準(zhǔn)品中的拷貝數(shù)。用雙蒸水對標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10×倍比稀釋，采用優(yōu)化好的體系進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)(每個稀釋度3個重復(fù))，建立質(zhì)?？截悢?shù)與循環(huán)閾值(Ct)對應(yīng)關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5 舒伯特氣單胞菌熒光定量PCR的靈敏度檢測

1.5.1 含rpoD基因質(zhì)粒的最低檢出限 提取含有目的片段的質(zhì)粒DNA(4.76×108拷貝/μL)，10倍等比稀釋為4.76×106，4.76×105，4.76×104，4.76×103，4.76×102，4.76×101，4.76×100，4.76×10-1拷貝/μL，以無菌水為空白對照，并用相應(yīng)引物與探針進(jìn)行熒光定量PCR擴增，確定該方法對靶基因的最低檢出限。

1.5.2 純培養(yǎng)物的最低檢出限 利用平板計數(shù)法，對舒伯特氣單胞菌ATCC43700進(jìn)行計數(shù)，調(diào)節(jié)菌液密度達(dá)到1.5×108CFU/mL，再按10倍梯度稀釋。取1 mL各密度菌液，用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取DNA作為檢測模板(終體積50 μL)，以無菌水為模板作空白對照，用1.3節(jié)中熒光定量PCR檢測方法，確定對舒伯特氣單胞菌純培養(yǎng)物的最低檢出限。

1.6 舒伯特氣單胞菌熒光定量PCR的重復(fù)性檢測

取舒伯特氣單胞菌rpoD基因質(zhì)粒DNA進(jìn)行熒光定量PCR,在同一次試驗中重復(fù)30次，觀察其Ct值變異系數(shù)。同時觀察在30個不同試驗中此樣品的Ct值變異系數(shù)，確定該方法的重復(fù)性。

1.7 臨床樣品的檢測

對50份臨床樣品(魚樣品各取0.1 g肝臟組織，養(yǎng)殖水樣品各取1 mL混勻的養(yǎng)殖水)提取總DNA，進(jìn)行熒光定量PCR檢測；同時無菌操作取0.1 g魚肝臟組織勻漿液或100 μL水樣(10倍濃縮)，在腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基(brian heart infusion,BHI)中進(jìn)行傳統(tǒng)細(xì)菌分離培養(yǎng)，分別挑選單菌落純化培養(yǎng)后提取DNA，進(jìn)行常規(guī)PCR檢測。對熒光定量PCR檢測結(jié)果呈陽性、而傳統(tǒng)細(xì)菌分離培養(yǎng)檢測結(jié)果呈陰性的臨床樣品進(jìn)行復(fù)檢，方法如下：取0.1 g組織勻漿或1 mL水樣(10倍濃縮)置于堿性蛋白胨水中增菌6 h后，再進(jìn)行分離純化培養(yǎng)，對經(jīng)常規(guī)PCR檢測、生化鑒定(biologⅢ細(xì)菌鑒定儀)以及熒光定量PCR檢測同時認(rèn)定為舒伯特氣單胞菌者，判定為陽性。

2 結(jié)果與分析

2.1 舒伯特氣單胞菌熒光定量PCR的特異性

熒光定量PCR特異性檢測結(jié)果顯示，舒伯特氣單胞菌菌株ATCC43700、WL1483均可檢測到“S”型熒光擴增曲線，結(jié)果為陽性；而嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌、溫和氣單胞菌、諾卡氏菌等其他14株非舒伯特氣單胞菌樣品和空白對照品均無熒光擴增曲線，Ct值無法讀取，結(jié)果均為陰性。表明以rpoD為靶基因設(shè)計的熒光定量 PCR 檢測方法可特異性檢測舒伯特氣單胞菌(圖1)。

2.2 舒伯特氣單胞菌熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

用舒伯特氣單胞菌rpoD基因的陽性重組質(zhì)粒進(jìn)行熒光定量PCR擴增，以不同濃度的質(zhì)?？截悢?shù)為橫坐標(biāo)，相對應(yīng)的循環(huán)閾值Ct為縱坐標(biāo)，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，該曲線的斜率為-3.456，截距為38.089(圖2)。得出質(zhì)?？截悢?shù)(X)與Ct值之間的線性方程為：Ct=-3.456 lgX+38.089。標(biāo)準(zhǔn)曲線在4.76×102～4.76×108拷貝/μL時有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為1.000，擴增效率為94.705%。

1.舒伯特氣單胞菌ATCC43700；2.舒伯特氣單胞菌病原分離株WL14831.Aeromonas schubertii ATCC43700;2.Aeromonas schubertii WL1483圖1 舒伯特氣單胞菌熒光定量PCR檢測方法的特異性Fig.1 Specificity of the real-time PCR for Aeromonas schubertii detection

圖2 舒伯特氣單胞菌rpoD質(zhì)?？截悢?shù)(C)與循環(huán)閾值(Ct)的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of Aeromonas schubertii plasmid copies (C) and threshold cycle (Ct)

2.3 舒伯特氣單胞菌熒光定量PCR的靈敏度試驗

2.3.1 含rpoD基因質(zhì)粒的最低檢出限 用建立的熒光定量PCR方法對4.76×106，4.76×105，4.76×104，4.76×103，4.76×102，4.76×101，4.76×100，4.76×10-1拷貝/μL的舒伯特氣單胞菌重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測，結(jié)果(圖3)顯示，當(dāng)樣品中重組質(zhì)粒為4.76×100拷貝/μL以上時，熒光定量PCR擴增可生成“S”型熒光曲線(曲線1～7)；當(dāng)樣品中的重組質(zhì)粒低于4.76×10-1拷貝/μL時，無“S”型熒光曲線生成(曲線8)。

2.3.2 純培養(yǎng)物的最低檢出限 用建立的熒光定量PCR方法對1.5×107，1.5×106，1.5×105，1.5×104，1.5×103，1.5×102，1.5×101，1.5×100CFU/mL的細(xì)菌基因組DNA進(jìn)行檢測,結(jié)果見圖4。

1～8.分別為4.76×106,4.76×105,4.76×104,4.76×103,4.76×102,4.76×101,4.76×100,4.76×10-1拷貝/μL的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品；9.空白對照1-8.Recombinant plasmid concentrations were 4.76×106,4.76×105,4.76×104,4.76×103,4.76×102,4.76×101,4.76×100,and 4.76×10-1 copies/μL；9.Blank control圖3 舒伯特氣單胞菌重組質(zhì)粒熒光定量 PCR的靈敏度Fig.3 Sensitivity of the real-time PCR for Aeromonas schubertii plasmid detection

1～8.分別為1.5×107,1.5×106,1.5×105,1.5×104,1.5×103,1.5×102,1.5×101,1.5×100 CFU/mL的舒伯特氣單胞菌純培養(yǎng)物基因組；9.空白對照1-8. Genome DNA of pure cultured A.schubertii 1.5×107,1.5×106,1.5×105,1.5×104,1.5×103,1.5×102,1.5×101,and 1.5×100 CFU/mL；9.Blank control

圖4顯示，當(dāng)樣品中至少有1.5×101CFU/mL細(xì)菌基因組DNA時，熒光定量PCR擴增可生成“S”型熒光曲線(曲線1～7 )；當(dāng)樣品中的細(xì)菌菌落數(shù)低于1.5×100CFU /mL時，無“S”型熒光曲線生成(曲線8)。

2.4 舒伯特氣單胞菌熒光定量PCR的重復(fù)性

對同一樣品在同一次試驗獲得的Ct值進(jìn)行統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，同一次試驗內(nèi)30個平行樣的擴增曲線在閾值線附近基本重合(圖5)，Ct值平均讀數(shù)為18.5，標(biāo)準(zhǔn)差為0.094，變異系數(shù)為0.95%。同一樣品在30次不同試驗中所獲得的Ct值也基本相同，Ct平均值為19.3， 標(biāo)準(zhǔn)差為0.143，變異系數(shù)為1.05%。以上統(tǒng)計結(jié)果表明，本試驗所建立的舒伯特氣單胞菌熒光定量PCR快速檢測方法重復(fù)性較好。

圖5 舒伯特氣單胞菌熒光定量PCR重復(fù)30次的試驗結(jié)果Fig.5 Results of 30 Aeromonas schubertii detections by real-time PCR

2.5 熒光定量PCR檢測方法的臨床應(yīng)用

應(yīng)用熒光定量PCR方法對臨床送檢的50份樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果(表1)顯示，從中檢出陽性樣品11份，檢出率22%，與傳統(tǒng)細(xì)菌分離和常規(guī)PCR鑒定結(jié)果(陽性5份，檢出率10%)相比，檢出率明顯提高。對定量PCR檢測陽性、傳統(tǒng)檢測結(jié)果陰性的樣品進(jìn)行增菌再分離，通過常規(guī)PCR檢測和生理生化鑒定，確定檢測結(jié)果呈陽性。

表1 舒伯特氣單胞菌臨床樣品的熒光定量PCR檢測結(jié)果Table 1 Detection of samples of Aeromonas schubertii

3 討 論

由舒伯特氣單胞菌引起的鱧科魚類內(nèi)臟白點病，在臨床上與其他病原菌引起的鱧科魚類內(nèi)臟類結(jié)節(jié)病，如諾卡氏菌[11]、分枝桿菌[12]和類立克次體[13]等引起的鱧科魚類內(nèi)臟類結(jié)節(jié)病等相似，因此難以區(qū)分。由于內(nèi)臟類結(jié)節(jié)病的病理組織損傷潛伏期較長，當(dāng)出現(xiàn)嚴(yán)重的結(jié)節(jié)癥狀時體表才會出現(xiàn)相關(guān)癥狀，加之不同病原所致的類似癥狀診斷困難，因此建立特異、快速、靈敏的檢測方法對鱧舒伯特氣單胞菌早期預(yù)警和病原監(jiān)測具有重要意義。

用于細(xì)菌病診斷的方法通常有2類：一是細(xì)菌分離培養(yǎng)，為細(xì)菌病診斷金標(biāo)準(zhǔn)，但病原菌的分離純化耗時長，檢出率低，對操作技術(shù)要求較高；二是分子生物學(xué)診斷，如PCR方法等，其以快速、敏感和特異等優(yōu)點而被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌鑒定。管家基因在細(xì)菌分類鑒定中被廣泛使用，其中16S rRNA的應(yīng)用尤為廣泛[14]。但氣單胞菌屬細(xì)菌種類繁多，種間16S rRNA基因差異較小，僅通過16S rRNA基因難以對其進(jìn)行分類鑒定；而一些保守性相對較低的管家基因gyrB、rpoB[15-16]和gyrA、rpoD[17-19]等已被廣泛用于氣單胞菌屬/假單胞菌屬的分類鑒定。本研究利用rpoD基因保守序列建立的舒伯特氣單胞菌熒光定量檢測體系，在16株常見病原菌檢測中具有良好的特異性，證實rpoD基因能將嗜水氣單胞菌、殺鮭氣單胞菌、維氏氣單胞菌、溫和氣單胞菌、簡氏氣單胞菌等氣單胞菌在種的水平上進(jìn)行準(zhǔn)確區(qū)分，表明該方法適用于舒伯特氣單胞菌的特異性檢測。

熒光定量PCR快速檢測方法靈敏性高，在樣本中菌體含量很低的情況下，仍能檢測出菌體核酸，并且可對大量樣本進(jìn)行定性和定量分析，因此被廣泛應(yīng)用于動物醫(yī)學(xué)和分子生物學(xué)研究領(lǐng)域[20-21]。本研究建立的熒光定量PCR方法檢測舒伯特氣單胞菌的最低檢測限為15 CFU/mL，其靈敏度明顯高于劉春等[9]建立的舒伯特氣單胞菌多重PCR方法(3×102CFU/mL)。在臨床樣品檢測試驗中，熒光定量PCR陽性檢出率明顯高于傳統(tǒng)檢測方法，其中傳統(tǒng)檢測結(jié)果陽性的樣品，熒光定量PCR檢測結(jié)果均為陽性，熒光定量PCR檢測結(jié)果為陰性的樣品，傳統(tǒng)檢測結(jié)果無一陽性。熒光定量檢測陽性的11份樣品中，傳統(tǒng)檢測只有5份陽性，增菌復(fù)檢結(jié)果表明11份樣品均為陽性。熒光定量PCR檢測結(jié)果與傳統(tǒng)檢測結(jié)果不完全一致，可能是由于其檢測靈敏度不同所致，但復(fù)檢結(jié)果表明，熒光定量PCR檢測結(jié)果與臨床結(jié)果相符。早期潛伏感染的組織樣品或水體中舒伯特氣單胞菌載菌量較低時，采用傳統(tǒng)細(xì)菌分離檢測方法可能存在假陰性問題，雖然增菌后檢測能提高陽性檢出率，但樣品中的雜菌同樣可能干擾檢測結(jié)果，因此本研究建立的舒伯特氣單胞菌熒光定量PCR檢測方法在特異性和靈敏度方面有明顯優(yōu)勢，能較好地應(yīng)用于舒伯特氣單胞菌的檢測和診斷，可為舒伯特氣單胞菌病的早期預(yù)警和流行病學(xué)調(diào)查提供技術(shù)支撐。