黃曉靜，李 睿，馬紅芳，馮麗麗，喬松林，鄧瑞廣，張改平,3

(1 河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002；2 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動物免疫學(xué)重點實驗室，河南 鄭州 450002；3揚州大學(xué) 江蘇高校動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚州225009)

Fc受體(Fc receptor，F(xiàn)cR)是一類特異親和免疫球蛋白(Immunoglobulin，Ig)Fc片段的細(xì)胞表面分子[1-2]。FcR廣泛表達(dá)于免疫細(xì)胞表面，介導(dǎo)免疫細(xì)胞與抗原-抗體復(fù)合物的相互作用，從而發(fā)揮對異己物質(zhì)的識別與清除、抗原處理與呈遞等免疫學(xué)功能，是聯(lián)系體液免疫與細(xì)胞免疫的重要橋梁[3-5]。

根據(jù)FcR結(jié)合配體Ig種類(IgG、IgA、IgM、IgD、IgE)的不同，可將FcR分為5大類，即FcγR、FcαR、FcμR、FcδR和FcεR，其中FcγR是最重要的一類FcR[6-8]。根據(jù)FcγR親和力及功能的不同，可將其分為FcγRⅠ、FcγRⅡ、FcγRⅢ，分別結(jié)合不同的IgG亞類[9-10]。1995年，本研究團(tuán)隊首次利用牛巨噬細(xì)胞cDNA文庫克隆出一種新的FcγR，其與所有已發(fā)表的人和小鼠FcγR差異較大，但與人Ⅰ型FcαR(huFcαRⅠ)相似度較高[11-12],其只特異性親和牛IgG2而不親和人和牛IgA，為一種新型哺乳動物FcR，將其命名為牛IgG2 FcR(boFcγ2R)[11]。此后，本團(tuán)隊進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，綿羊也存在Fcγ2R基因，該受體能結(jié)合牛和綿羊IgG2，但不能結(jié)合綿羊IgG1，表明Fcγ2R可能是反芻動物特有的一類FcγR[13]。

boFcγ2R是一種跨膜糖蛋白，由2個胞外Ig-like區(qū)域EC1(Extracellular 1)和EC2(Extracellular 2)及包含19個氨基酸的跨膜區(qū)和一段短的胞質(zhì)尾區(qū)組成。2001年，Morton等[14-15]利用定點突變的方法研究證明，boFcγ2R與IgG2特異親和的區(qū)域位于EC1的F-G loop區(qū)，并指出第82-85位氨基酸是其特異性結(jié)合位點。2006年，本研究團(tuán)隊利用合成多肽技術(shù)進(jìn)一步證明，boFcγ2R第82位的苯丙氨酸(F82)、83位異亮氨酸(I83)及87位的色氨酸(W87)在特異性親和過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[16]。

FcR及其與配體復(fù)合物的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究，不僅可為闡明二者相互作用的分子機(jī)制提供技術(shù)支持[17-18]，同時也可為FcR靶標(biāo)藥物的研發(fā)奠定重要基礎(chǔ)[19]。boFcγ2R作為一種新型FcR，對其三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，不僅能夠為揭示boFcγ2R的功能提供分子基礎(chǔ)，也能為深入研究人類FcR與Ig的相互作用提供借鑒。本研究利用果蠅胚胎DrosophilaSchneider 2(S2)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)獲得了boFcγ2R胞外區(qū)重組蛋白，經(jīng)過純化得到了純度高、具有活性的目的蛋白，并獲得初篩晶體，旨在為后續(xù)boFcγ2R的結(jié)構(gòu)與免疫學(xué)功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

果蠅胚胎S2細(xì)胞、pMT/BiP/V5-HisA、pCoBlast載體、牛IgG2、豬源CD163重組蛋白，均為本實驗室保存[20]；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、DL2000 DNA Marker，均購自大連寶生物有限公司；Q5?High-Fidelity DNA 聚合酶、限制性核酸內(nèi)切酶BglⅡ、MluⅠ及T4 DNA連接酶，均購自美國New England Biolabs公司；DNA回收試劑盒，購自北京天根生化有限公司；E.Z.N.A.?Plasmid Midi Kit 質(zhì)粒提取試劑盒，購自美國OMEGA公司；Cellfectin?II Reagent陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑、果蠅胚胎S2細(xì)胞無血清培養(yǎng)基Sf-900 II(serum-free medium，SFM)、篩選抗生素blasticidin S HCl，均購自美國Invitrogen公司；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)，購自美國Gibco公司；純化用鎳填料、Superdex 200 Increase 10/300 GL預(yù)裝柱，均購自美國GE公司；His標(biāo)簽抗體(anti-6×His tag monoclonal antibody)，購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；山羊抗小鼠酶標(biāo)二抗(goat-anti-mouse IgG-HRP)，購自美國Abbkine公司；偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)、硝酸纖維素膜(nitrocellulose filter membrane，NC)、超濾管，均購自美國Millipore公司；化學(xué)發(fā)光HRP底物顯色液、彩虹180蛋白Marker、245 plus蛋白Marker、BCA蛋白濃度測定試劑盒，均購自北京索萊寶科技有限公司；果蠅胚胎S2細(xì)胞培養(yǎng)基(Schneider’s insect medium)、去糖基化酶Endo Hf和PNGase F，均購自美國Sigma公司；48孔晶體板及結(jié)晶試劑盒，購自美國Hampton Research公司。

1.2 pMT/BiP-boFcγ2R-His重組表達(dá)載體的構(gòu)建

從GenBank下載boFcγ2R全長基因序列(GenBank登錄號：NM-001001138)，交由上海生工生物工程有限公司合成boFcγ2R全長基因，根據(jù)其全長氨基酸序列，采用TMHMM Server v. 2.0軟件預(yù)測boFcγ2R胞外區(qū)片段。根據(jù)預(yù)測的boFcγ2R胞外區(qū)片段序列，利用Prime5軟件設(shè)計1對PCR擴(kuò)增引物。其中上游引物F:5′-GAAGATCTCAGGTGCAGGCCGGCACCTTC-3′(下劃線標(biāo)識BglⅡ酶切位點),下游引物R:5′-CGACGCGTATTCTGCATGGTGTAATCGGCCAC-3′(下劃線標(biāo)識MluⅠ酶切位點)。以boFcγ2R全長基因為模板，使用Q5高保真DNA聚合酶對boFcγ2R胞外區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系按照Q5高保真DNA聚合酶使用說明書配制，同時設(shè)置以水代替模板的體系作為陰性對照。PCR反應(yīng)體系(50 μL)為：2×Master Mix 25 μL，上游引物boFcγ2R-F(10 μmol/L)2 μL，下游引物boFcγ2R-R(10 μmol/L)2 μL，模板2 μL，ddH2O 19 μL。反應(yīng)條件為：98 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共30個循環(huán)；最后72 ℃二次延伸 10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測后回收。

回收的boFcγ2R胞外區(qū)片段經(jīng)BglⅡ和MluⅠ雙酶切處理后，與經(jīng)同樣雙酶切處理的pMT/BiP/V5-HisA通過T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，構(gòu)建pMT/BiP-boFcγ2R-His重組表達(dá)載體，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，通過氨芐青霉素抗性(氨芐青霉素的質(zhì)量濃度為100 μg/mL)篩選獲得單克隆菌落；挑選5個單克隆菌落進(jìn)行PCR鑒定，將陽性克隆送至上海生工生物工程有限公司測序。

1.3 pMT/BiP-boFcγ2R-His果蠅胚胎S2細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的篩選

將pMT/BiP-boFcγ2R-His與pCoblast混合，通過Cellfectin?II Reagent脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染果蠅胚胎S2細(xì)胞[20]；3 d后，更換含體積分?jǐn)?shù)10%熱滅活FBS的果蠅胚胎S2細(xì)胞培養(yǎng)基，同時添加終質(zhì)量濃度為25 μg/mL的blasticidin S HCl抗生素進(jìn)行篩選，每隔3 d左右更換1次培養(yǎng)液，觀察細(xì)胞狀態(tài)，最終得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系。

1.4 boFcγ2R胞外區(qū)重組蛋白的表達(dá)

使用果蠅胚胎S2細(xì)胞SFM培養(yǎng)基對篩選出的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)到(3～6)×106個/mL時，加終濃度為0.75 mmol/L的硫酸銅，28 ℃誘導(dǎo)表達(dá)120 h后，4 ℃下200g離心10 min，收集上清液，調(diào)節(jié)其pH至8.0后，4 ℃下12 000g離心30 min，收集上清液。上清液樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳后，在15 V、40 min條件下轉(zhuǎn)PVDF膜，采用His標(biāo)簽抗體對目的蛋白進(jìn)行Western-blot鑒定。

1.5 boFcγ2R胞外區(qū)目的蛋白的純化

量取一定體積浸泡在體積分?jǐn)?shù)20%乙醇中的鎳填料進(jìn)行裝柱，用10倍柱體積的超純水沖洗后，以10倍柱體積的緩沖體系(20 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，150 mmol/L NaCl)對鎳柱進(jìn)行平衡處理。將離心后的S2細(xì)胞表達(dá)上清液加至平衡后的鎳柱中，讓其自然緩慢地流過鎳柱，流穿結(jié)束后再次用10倍柱體積的上述緩沖體系平衡，然后依次使用10，30，50，100 mmol/L的咪唑溶液進(jìn)行洗脫處理，并分別收集洗脫液樣品。對純化前S2細(xì)胞表達(dá)上清液、過鎳柱后流穿液及不同濃度咪唑洗脫液樣品進(jìn)行SDS-PAGE檢測。使用凝膠過濾層析柱Superdex 200 Increase 10/300 GL對經(jīng)過鎳柱純化后的蛋白進(jìn)一步純化，并將收集的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定，最后利用超濾管對收集的目的蛋白進(jìn)行濃縮，并使用BCA試劑盒測定蛋白的質(zhì)量濃度。

1.6 boFcγ2R胞外區(qū)蛋白的Dot-blot檢測

根據(jù)boFcγ2R可與牛IgG2特異性結(jié)合的特點，利用His單抗對結(jié)合牛IgG2后的boFcγ2R胞外區(qū)重組蛋白進(jìn)行檢測。將牛IgG2(質(zhì)量濃度為1 mg/mL)以10 μL的量點樣于NC膜，自然干燥后浸入50 g/L脫脂奶中，于4 ℃封閉過夜，分別用0.5，1.0和2.0 μL的boFcγ2R胞外區(qū)重組蛋白液(質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL)對其進(jìn)行孵育，同時設(shè)置空白對照(不含任何蛋白)及陰性對照(加2 μL質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的帶His標(biāo)簽的豬源CD163重組蛋白)；以His標(biāo)簽抗體作為一抗(1∶5 000)，37 ℃作用1 h，PBST洗滌3次；加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠作為二抗(1∶1 000)，37 ℃作用1 h，PBST洗滌3次；最后使用化學(xué)發(fā)光HRP底物顯色液對NC膜進(jìn)行顯色，對目的蛋白功能進(jìn)行Dot-blot檢測。

1.7 boFcγ2R胞外區(qū)蛋白結(jié)晶條件的篩選

將純化后的boFcγ2R胞外區(qū)蛋白經(jīng)超濾管濃縮至12.6 mg/mL，備用。采用蛋白結(jié)晶篩選試劑盒HR2-144(其中包括96個結(jié)晶條件)，用蒸汽擴(kuò)散坐滴法在不同結(jié)晶條件下對目的蛋白進(jìn)行結(jié)晶，篩選蛋白結(jié)晶條件。具體做法為:將濃縮后的蛋白液與不同結(jié)晶條件溶液按照1∶1的體積比加至晶體板，置于20 ℃晶體培養(yǎng)箱中，每天數(shù)次觀察晶體板中有無晶體生長。

1.8 boFcγ2R胞外區(qū)蛋白的去糖基化處理

挑取初篩晶體送至上海同步輻射光源BL17U1線站收集數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示本研究得到的初篩晶體無衍射。因之前有報道稱，boFcγ2R屬于糖基化修飾的蛋白，所以推測boFcγ2R胞外區(qū)蛋白初篩晶體無衍射可能是其糖基化造成的。因糖基化最常見的形式是N-糖基化，所以同時利用2種去N-糖基化酶Endo Hf 和PNGase F，分別在變性與非變性條件下對目的蛋白進(jìn)行去糖基化處理。取適量純化后的目的蛋白，在變性及非變性條件下分別與去糖基化酶Endo Hf、PNGase F混合，37 ℃孵育1 h，然后利用SDS-PAGE電泳檢測boFcγ2R胞外區(qū)蛋白的去糖基化效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 pMT/BiP-boFcγ2R-His載體的構(gòu)建及鑒定

利用合成的boFcγ2R全長基因為模板擴(kuò)增出其胞外區(qū)cDNA片段，結(jié)果得到了約633 bp的片段(圖1)，與預(yù)期結(jié)果一致。pMT/BiP-boFcγ2R-His載體PCR鑒定獲得了約633 bp的目的片段(圖2)，測序鑒定結(jié)果也顯示獲得了633 bp的片段，表明pMT/BiP-boFcγ2R-His載體構(gòu)建成功。

M.DL 2000 DNA標(biāo)準(zhǔn)品; 1.陰性對照；2.boFcγ2R基因胞外區(qū)片段擴(kuò)增產(chǎn)物
M.DL 2000 DNA Marker; 1.Negtive control；2.PCR amplification product ofboFcγ2Rgene segment of extracellular region
圖1boFcγ2R基因胞外區(qū)片段的PCR擴(kuò)增
Fig.1 PCR amplification ofboFcγ2Rgene segment of extracellular region

M.DL 2000 DNA標(biāo)準(zhǔn)品;
1-8.單克隆菌落的pMT/BiP-boFcγ2R-His基因胞外區(qū)片段PCR擴(kuò)增結(jié)果
M.DL 2000 DNA Marker; 1-8.Colony PCR products of pMT/BiP-boFcγ2R-His gene segments of extracellular region
圖2 pMT/BiP-boFcγ2R-His載體的PCR鑒定
Fig.2 Colony PCR identification of pMT/BiP-boFcγ2R gene segments of extracellular region

2.2 boFcγ2R胞外區(qū)重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化

收集誘導(dǎo)后的S2重組細(xì)胞表達(dá)上清液，利用His標(biāo)簽抗體進(jìn)行Western-blot分析，結(jié)果在26 ku左右出現(xiàn)目標(biāo)蛋白條帶(圖3)，表明boFcγ2R胞外區(qū)重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)成功。

對鎳柱親和層析法純化前S2細(xì)胞表達(dá)上清液、過鎳柱后流穿液及不同濃度咪唑洗脫液樣品進(jìn)行SDS-PAGE檢測，結(jié)果表明50 mmol/L咪唑洗脫液中含有目的蛋白(圖4)。

M.蛋白Marker；1.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的S2細(xì)胞表達(dá)上清液 M.Protein Marker；1.Supernatant of stably-transfected S2 cells 圖3 boFcγ2R胞外區(qū)重組蛋白的Western-blot檢測Fig.3 Western-blot analysis of recombinant boFcγ2R ectodomain

M.蛋白Marker；1.純化前細(xì)胞表達(dá)上清液；2.過鎳柱后流穿液；3～5.分別為10，50 和100 mmol/L 咪唑洗脫液M.Protein Marker；1.Cell supernatant before purification；2.Flowthrough after purification;3-5.Eluent with 10,50,100 mmol/L imidazole respectively圖4 鎳柱純化boFcγ2R胞外區(qū)重組蛋白的SDS-PAGE檢測Fig.4 SDS-PAGE analysis of recombinant boFcγ2R ectodomain purified by Ni-affinity chromatography

采用鎳柱親和層析初步純化后的目的蛋白中仍有部分雜蛋白沒有除去，因此采用凝膠過濾層析對其進(jìn)一步純化，SDS-PAGE檢測結(jié)果表明，凝膠過濾層析純化后的蛋白純度較鎳柱純化明顯提高(圖5)；進(jìn)一步經(jīng)超濾管濃縮后，蛋白質(zhì)量濃度高達(dá)12.6 mg/mL。

M.蛋白Marker；1.凝膠過濾層析純化后的目的蛋白；2.超濾管濃縮后的目的蛋白M.Protein Marker;1.Recombinant target protein purified by gel filtration chromatography; 2.Concentrated target protein by ultrafiltration tube 圖5 凝膠過濾層析純化boFcγ2R胞外區(qū)重組蛋白的SDS-PAGE檢測Fig.5 SDS-PAGE analysis of recombinant boFcγ2R ectodomain purified by gel filtration chromatography

2.3 boFcγ2R胞外區(qū)重組蛋白活性的Dot-blot檢測

試驗結(jié)果(圖6)顯示，純化后的boFcγ2R胞外區(qū)重組蛋白可與牛IgG2結(jié)合，表明目的蛋白具有生物學(xué)活性。

1.空白對照；2.陰性對照；3～5.分別為0.5，1.0，2.0 μL boFcγ2R胞外區(qū)重組蛋白的孵育結(jié)果1.Blank control；2.Negative control；3-5.Results of incubated 0.5,1.0,2.0 μL recombinant boFcγ2R ectodomaint respectively圖6 boFcγ2R胞外區(qū)重組蛋白功能的Dot-blot鑒定Fig.6 Dot-blot analysis of recombinant boFcγ2R ectodomain

2.4 boFcγ2R胞外區(qū)重組蛋白結(jié)晶條件的確定

純化后目的蛋白的純度、質(zhì)量濃度、活性均滿足結(jié)晶要求，因此本研究利用蛋白結(jié)晶篩選試劑盒HR2-144對蛋白結(jié)晶條件進(jìn)行篩選，最終蛋白結(jié)晶的2個條件是體積分?jǐn)?shù)15%TacsimateTM(pH 7.0)、0.1 mol/L HEPES (pH 7.0)、20 g/L PEG 3350和0.1 mol/L HEPES (pH 7.5)、250 g/L PEG 3350(圖7)。

A.15% TacsimateTM (pH 7.0)、0.1 mol/L HEPES (pH 7.0)、20 g/L PEG 3350條件下24 h生長的晶體；B.0.1 mol/L HEPES (pH 7.5)、250 g/L PEG 3350條件下24 h生長的晶體A.Crystals grown in the condition of 15% TacsimateTM (pH 7.0),0.1 mol/L HEPES (pH 7.0),20 g/L PEG 3350 for 24 h;B.Crystals grown in the condition of 0.1 mol/L HEPES (pH 7.5),250 g/L PEG 3350 for 24 h圖7 boFcγ2R胞外區(qū)重組蛋白初篩晶體Fig.7 Primary screening crystals of recombinant boFcγ2R ectodomain

2.5 boFcγ2R胞外區(qū)重組蛋白的去糖基化分析

試驗結(jié)果顯示，在變性條件下，boFcγ2R胞外區(qū)重組蛋白經(jīng)去糖基化酶Endo Hf和PNGase F處理后，得到較純的單一目的蛋白條帶(圖8)，從而驗證了boFcγ2R胞外區(qū)重組蛋白初篩晶體無衍射可能與其糖基化有關(guān)。

M.蛋白Marker；1，3.分別為非變性條件下去糖基化酶Endo Hf和PNGase F處理后的目的蛋白；2，4.分別為變性條件下去糖基化酶Endo Hf和PNGase F處理后的目的蛋白M.Protein Marker;1,3.The target protein treated with Endo Hf and PNGase F under non-denatured condition;2,4.The target protein treated with Endo Hf and PNGase F under denatured condition圖8 經(jīng)去糖基化酶處理后boFcγ2R胞外區(qū)目的蛋白的SDS-PAGE檢測Fig.8 SDS-PAGE analysis of recombinant boFcγ2R ectodomain after de-glycosylation

3 討 論

FcR不僅使免疫細(xì)胞具備殺傷病毒和細(xì)菌、清除免疫復(fù)合物、溶解癌變細(xì)胞的能力，而且還參與免疫反應(yīng)的啟動與調(diào)節(jié)，在機(jī)體免疫防御方面起著極為關(guān)鍵的作用[1]。相對人FcR而言，牛FcR研究比較滯后。boFcγ2R作為一種新型哺乳動物FcR[21]，對其結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行研究具有非常重要的意義。2008年，本研究團(tuán)隊曾經(jīng)利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了boFcγ2R胞外區(qū)，驗證了其可與IgG2特異結(jié)合[22]。但是，由于原核系統(tǒng)表達(dá)的蛋白不能進(jìn)行翻譯后加工，如糖基化修飾及二硫鍵形成等，可能導(dǎo)致重組表達(dá)蛋白的結(jié)構(gòu)與天然結(jié)構(gòu)不符。在真核系統(tǒng)表達(dá)方面，本研究團(tuán)隊在克隆boFcγ2R時，采用瞬時轉(zhuǎn)染的方法通過COS-7細(xì)胞成功表達(dá)了boFcγ2R，并對其功能進(jìn)行了鑒定[23]。然而，瞬時轉(zhuǎn)染受很多因素影響，有可能出現(xiàn)轉(zhuǎn)染效率低的問題；同時，瞬時轉(zhuǎn)染表達(dá)無法保證不同批次試驗的均一性及穩(wěn)定性。此后，本研究團(tuán)隊通過抗性篩選和玫瑰花環(huán)檢測方法建立了穩(wěn)定表達(dá)boFcγ2R的COS-7轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，雖然為研究boFcγ2R功能提供了很好的技術(shù)平臺[21]，但是通過此方法獲得的蛋白量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足后續(xù)對其結(jié)構(gòu)與功能研究的需求。

本研究構(gòu)建pMT/BiP-boFcγ2R-His表達(dá)載體，通過果蠅胚胎S2細(xì)胞真核表達(dá)系統(tǒng)對目的蛋白進(jìn)行了表達(dá)。利用該真核表達(dá)系統(tǒng)，目的蛋白可在翻譯后進(jìn)行加工修飾使其更接近蛋白天然構(gòu)象，同時該系統(tǒng)還具有蛋白表達(dá)量高等特點[20,24-25]。采用鎳柱親和層析及凝膠過濾層析純化后，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測蛋白純度高達(dá)99%。經(jīng)Dot-blot檢測純化后的boFcγ2R胞外區(qū)重組蛋白具有特異結(jié)合牛IgG2的生物學(xué)活性。本研究最終獲得了目的蛋白初篩晶體，但是這些晶體無衍射。經(jīng)分析，boFcγ2R屬于糖基化修飾蛋白，推測可能是糖基化不均一所致。為了驗證這個推測，本研究采用2種去糖基化酶對目的蛋白進(jìn)行去糖基化處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)處理后可獲得純度較高而且均一的目的蛋白，為進(jìn)一步利用結(jié)構(gòu)生物學(xué)方法研究該受體的免疫學(xué)功能打下了堅實基礎(chǔ)。