趙 鑫，俸 云，沈朋雷，石德順，陸鳳花

（廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530004）

體細(xì)胞核移植技術(shù)（Somatic Cell Nuclear Transfer，SCNT）在科研、動物育種、轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)、瀕危動物保護(hù)、醫(yī)療等領(lǐng)域具有非常廣闊的應(yīng)用前景，但極低的克隆效率嚴(yán)重限制了該技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用[1]。研究表明，克隆胚胎發(fā)育過程中出現(xiàn)的表觀遺傳修飾異常，是導(dǎo)致克隆胚胎發(fā)育效率低下的最主要原因[2]，其中組蛋白修飾中的組蛋白甲基化異常是主要因素之一。組蛋白甲基化修飾會在異染色質(zhì)形成，基因表達(dá)調(diào)控以及X 染色體失活等過程中發(fā)揮作用[3-4]。一般情況下，組蛋白甲基化修飾存在于組蛋白H3/H4 位點(diǎn)N 端的Lysine 和Arginine上，不同的組蛋白甲基化形式對基因表達(dá)起到不同的調(diào)控作用[5]。其中克隆胚胎中頻繁發(fā)生的組蛋白H3K4、H3K9 甲基化異常，是導(dǎo)致克隆胚胎發(fā)育失敗的原因之一[6]。而KDM1A 也被稱為LSD1，是最早被發(fā)現(xiàn)的組蛋白去甲基化酶[7]，屬于黃素腺嘌呤二核苷酸依賴酶[8-9]，由Tower、SWIRM 和胺氧化酶3 種結(jié)構(gòu)域組成，能夠在組蛋白H3K4me/me2 和H3K9me/me2 的調(diào)控過程中發(fā)揮作用[8-10]。另外，有研究發(fā)現(xiàn)，敲除KDM1A 會導(dǎo)致卵母細(xì)胞的紡錘體發(fā)生損傷，進(jìn)而影響胚胎的早期發(fā)育；還會引起組蛋白H3K9me3 異常升高，表明KDM1A 在卵母細(xì)胞發(fā)育、受精、組蛋白甲基化調(diào)控等方面發(fā)揮了關(guān)鍵作用[11]。同時，KDM1A 還被證明對DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶Dnmt1 的穩(wěn)定性以及干細(xì)胞的多能性產(chǎn)生影響[12]。以上研究結(jié)果都強(qiáng)烈暗示了KDM1A 在表觀遺傳修飾調(diào)控過程中的重要性。

盡管KDM1A 被發(fā)現(xiàn)已多年，但關(guān)于水牛KDM1A基因的研究目前鮮有報道。故本研究擬對水牛KDM1A基因進(jìn)行克隆分析，并構(gòu)建真核表達(dá)載體，為進(jìn)一步研究KDM1A 在水牛SCNT 胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮的作用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 本實(shí)驗(yàn)所用水牛卵巢購買自南寧市某屠宰場，卵巢離體后立刻保存于液氮，用于RNA 的提取。pcDNA3.1（+）骨架載體和水牛耳部成纖維細(xì)胞（BFFs）由廣西大學(xué)亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 主要試劑 TRIzol Reagent 購買自Invitrogen 公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒HiScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit，基因克隆試劑盒2×Phanta Master Mix，載體構(gòu)建試劑盒ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit，實(shí)時熒光定量PCR（Real-Time Quantitative PCR，RT-qPCR）試 劑ChamQ Universal SYBR?qPCR Master Mix 均購買 自 諾 唯贊生物科技有限公司；去內(nèi)毒質(zhì)粒提取試劑盒Endo-Free Plasmid Mini Kit 和膠回收試劑盒E.Z.N.A Gel Extraction Kit 購買自O(shè)MEGA 公司；感受態(tài)細(xì)胞購買自全式金生物科技有限公司；限制性內(nèi)切酶Xho I 購買自日本TaKaRa公司；細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑ViaFect ? 購買自美國Promega 公司。其他試劑均參考《分子克隆與實(shí)驗(yàn)指南》進(jìn)行配制。

1.3 引物設(shè)計與合成 參考NCBI 上已公布的水牛KDM1A 序列信息（登錄號：XM_025278755.1），使用Oligo 6.0 軟件設(shè)計引物并交由上海生工生物科技有限公司進(jìn)行合成，具體信息如表1 所示。

1.4 RNA 提取和第1 鏈cDNA 的合成 使用TRIzol Reagent提取水牛卵巢和BFFs 的總RNA，使用分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 的純度和完整性，符合要求后立刻使用HiScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit 進(jìn)行第1 鏈cDNA 的體外合成，反應(yīng)體系：4×gDNA Wiper Mix 4 μL，RNA 模 板500 ng，RNase free H2O 補(bǔ) 足16 μL，吹打混勻后PCR 儀中42℃孵育2 min；加入5×HiScript II qRT SuperMix II 4 μL，50℃孵育15 min，85℃反應(yīng)5 s，獲得cDNA。產(chǎn)物保存于-20℃冰箱備用。

1.5 水牛KDM1A 片段的克隆 以水牛卵巢cDNA 為模板，使用試劑盒2×Phanta Master Mix 進(jìn)行KDM1A 片段的擴(kuò)增。參照試劑說明書，設(shè)計反應(yīng)體系：2×Phanta Master Mix 25 μL，10 nmol/L 上、下游 引 物 各2 μL，cDNA 模 板5 μL，RNase free H2O 補(bǔ) 足50 μL。PCR 擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性10 s，60.5℃，15 s，72℃延伸2 min，循環(huán)數(shù)為25；72℃延伸5 min 后保存于4℃。反應(yīng)完成后使用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的片段大小，確認(rèn)無誤后使用E.Z.N.A Gel Extraction Kit進(jìn)行目的片段的回收。回收產(chǎn)物保存于-20℃冰箱備用。

1.6 單酶切 使用單酶切的方法線性化骨架載體pcDNA3.1（+）。酶切反應(yīng)體系：pcDNA3.1（+）載體1 μg，限制性內(nèi)切酶Xho I 1 μL，反應(yīng)緩沖液10×Reaction Buffer H 2 μL，RNase free H2O 補(bǔ)足20 μL。PCR 儀中37℃孵育1 h，酶切完成后使用E.Z.N.A Gel Extraction Kit 回收目的片段?；厥债a(chǎn)物保存于-20℃冰箱備用。

1.7 連接、轉(zhuǎn)化與測序 使用ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit 進(jìn)行目的片段與載體的連接。連接反應(yīng)體系：將目的片段與線性化載體按照0.06 pmol∶0.03 pmol 的比例混合，加入4 μL 的5×CE Buffer 和2 μL 的Exnase II，RNase free H2O 補(bǔ)足20 μL。PCR 儀中37℃孵育30 min，連接完成后立刻將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞，再將菌液涂布于含氨芐青霉素（Amp+）的LB 固體平板上，置于37℃生化培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。菌落長出后挑取單個菌落并置于含Amp+的LB 肉湯中，置于37℃搖床中過夜培養(yǎng)。菌液長出后提取質(zhì)粒并電泳檢測質(zhì)粒大小，符合預(yù)期后將質(zhì)粒送至廣州華大生物科技有限公司進(jìn)行測序鑒定。

1.8 生物信息學(xué)分析 使用DNAStar 軟件中的MegAlign程序測序比對序列的同源性；使用DNAMAN 軟件比對預(yù)測編碼的氨基酸序列；使用MEGA 6.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹；使用在線程序EXPASY（https://web.expasy.org/protparam/）預(yù)測編碼蛋白的氨基酸組成、等電點(diǎn)、相對分子質(zhì)量等；使用DNA star 軟件中的Protean 程序預(yù)測水牛KDM1A 蛋白的二級結(jié)構(gòu)；最后再使用在線 程 序I-TASSER（https://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/）預(yù)測水牛KDM1A 蛋白的三級結(jié)構(gòu)。

表1 PCR 擴(kuò)增序列引物

1.9 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 參考轉(zhuǎn)染試劑ViaFect ?的說明書，將pcDNA3.1（+）-KDM1A轉(zhuǎn)染進(jìn)BFFs，并將轉(zhuǎn)染pcDNA3.1（+）空載體和未轉(zhuǎn)染組設(shè)為對照組。

1.10 實(shí)時熒光定量PCR 轉(zhuǎn)染48 h 后提取細(xì)胞RNA并將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再使用RT-qPCR 技術(shù)對BFFs中KDM1A 基因的表達(dá)水平進(jìn)行檢測。以轉(zhuǎn)染后細(xì)胞cDNA 為模板，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1（+）空載體和未轉(zhuǎn)染組為對照，β-actin 為內(nèi)參，使用ChamQ Universal SYBR?qPCR Master Mix，對KDM1A 的表達(dá)水平進(jìn)行測定。反應(yīng)體系：10 μL 的2×ChamQ Universal SYBR?qPCR Master Mix，0.4 μL 上、下 游 引 物，1 μL 的cDNA，RNase-free H2O 補(bǔ)足20 μL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性10 s，退火延伸60℃，30 s，反應(yīng)40 個循環(huán)；熔解曲線反應(yīng)程序?yàn)?5℃，15 s；60℃，30 s ；95℃，15 s；反應(yīng)40 個循環(huán)。每個樣品至少重復(fù)3 次，反應(yīng)結(jié)束后使用2-ΔΔCt法對基因的表達(dá)情況進(jìn)行計算。另外，為了研究KDM1A 在水牛GV 期和MII 期卵母細(xì)胞中的表達(dá)模式，本研究又提取了水牛GV 期和MII 期卵母細(xì)胞的cDNA，以BFFs 的cDNA 為對照，運(yùn)用相同的實(shí)驗(yàn)方法對其進(jìn)行檢測。

1.11 統(tǒng)計分析 本實(shí)驗(yàn)使用SPSS 17.0 軟件，利用其單因素方差分析中的Tukey 檢驗(yàn)對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，P＜0.05 表示差異顯著，P＞0.05 表示差異不顯著。

2 結(jié) 果

2.1 水牛KDM1A 編碼區(qū)的克隆與鑒定 如圖1 所示，所提卵巢總RNA 中5S、18S 和28S 條帶清晰，結(jié)構(gòu)完整且降解少，可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。隨后使用RT-PCR 法擴(kuò)增水牛KDM1A 基因序列，擴(kuò)增片段大小與預(yù)期一致（圖2）。

2.2 水牛pcDNA3.1（+）-KDM1A 真核表達(dá)載體的構(gòu)建利用同源重組技術(shù)將上一步中克隆得到的KDM1A 基因片段與線性化的pcDNA3.1（+）骨架載體進(jìn)行連接并使用瓊脂糖凝膠電泳檢測其片段大小。如圖3 所示，片段大小符合預(yù)期。

2.3 水牛KDM1A 基因的序列的生物信息學(xué)分析 如圖4所示，擴(kuò)增得到的水牛KDM1A 片段編碼區(qū)長2 625 bp，預(yù)測編碼874 個氨基酸。如圖5 所示，水牛KDM1A 基因與黃牛、山羊、綿羊、豬、貓、馬、犬、黑猩猩的同源性分別為98.9%、97.8%、97.7%、94.0%、93.6%、93.4%、93.3%、93.0%。如圖6 所示，水牛與黃牛序列聚為一支，并與綿羊、山羊等哺乳動物的遺傳距離相對較近，所得進(jìn)化樹與動物分類學(xué)之間存在較高的一致性。

2.4 水牛KDM1A 蛋白的生物信息學(xué)分析 如圖7 所示，水牛KDM1A 在各個物種間具有較高的保守性。使用EXPASY 服務(wù)器對水牛KDM1A 蛋白理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測顯示，該蛋白質(zhì)的化學(xué)分子式為C2375H3855N805O776S24，理論分子質(zhì)量為56 872.11，等電點(diǎn)為10.3，呈堿性。預(yù)測由874個氨基酸組成，其中丙氨酸的含量最高（17.3%），甘氨酸次之（13.3%），半胱氨酸和色氨酸的含量最低（1.6%）。如圖8 所示，蛋白二級結(jié)構(gòu)包含α 螺旋19 個，β 折疊47個，T 轉(zhuǎn)角25 個以及數(shù)個無規(guī)則卷曲。如圖9 所示，在水牛、黃牛、人3 個物種之間，水牛和牛KDM1A 蛋白具有較高的相似性。

2.5 水牛pcDNA3.1（+）-KDM1A 真核表達(dá)載體的效率驗(yàn)證 如圖10 所示，轉(zhuǎn)染48 h 后，與對照組相比，BFFs 中KDM1A 的表達(dá)水平顯著升高。

圖1 總RNA 電泳圖

圖2 水牛KDM1A 基因片段擴(kuò)增

圖3 pcDNA3.1（+）-KDM1A

圖6 水牛KDM1A 基因進(jìn)化樹分析

圖7 水牛與其他物種KDM1A 氨基酸序列比對

圖8 水牛KDM1A 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

圖9 水牛與其他物種的KDM1A 蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.6 KDM1A 基因在水牛不同時期卵母細(xì)胞中表達(dá)水平的檢測 如圖11 所示， KDM1A 在水牛GV 期和MII 期卵母細(xì)胞中的表達(dá)水平均要高于BFFs（P＜0.05）。

圖10 轉(zhuǎn)染pcDNA3.1（+）-KDM1A后KDM1A 的相對表達(dá)水平

圖11 KDM1A 在水牛GV 期/MII 期卵母細(xì)胞中的表達(dá)模式

3 討 論

KDM1A 是賴氨酸特異性去甲基化酶家族的成員之一，在催化組蛋白H3K9me/me2 去甲基化的過程中發(fā)揮了巨大作用。目前已經(jīng)證明，組蛋白H3K9 的甲基化狀態(tài)是影響克隆效率的關(guān)鍵因素之一[6]。下調(diào)克隆胚胎中組蛋白H3K9 的甲基化水平，可以提高多能基因Oct4、Sox2 和Nanog 的表達(dá)水平，從而提高克隆胚胎的發(fā)育效率[13]。為了對水牛KDM1A 基因進(jìn)行初步了解，本研究首先對水牛KDM1A 進(jìn)行了克隆分析，獲得2 625 bp 的水牛KDM1A 編碼區(qū)片段。通過進(jìn)行生物信息學(xué)分析可知，水牛KDM1A 基因在各物種間的同源性較高；再結(jié)合進(jìn)化樹結(jié)果進(jìn)行分析，表明KDM1A 符合各個物種之間的進(jìn)化規(guī)律。另外，其編碼的蛋白在各個物種間也具有較高的相似性。此外，僅從預(yù)測所得的氨基酸二級結(jié)構(gòu)并不能對KDM1A 蛋白進(jìn)行一個全面的預(yù)測。蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明，水牛、黃牛和人的KDM1A 蛋白存在一定的相似性。綜合基因和蛋白分析發(fā)現(xiàn)，KDM1A 在多個物種中具有較高的保守性，推測其可能在哺乳動物體內(nèi)發(fā)揮了關(guān)鍵的調(diào)控作用。

有研究表明，KDM1A 能夠通過調(diào)控甲基化的水平來發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄抑制作用[8,14]。通過使用敲除技術(shù)發(fā)現(xiàn)，KDM1A 蛋白可以與細(xì)胞內(nèi)的AREs 元件相結(jié)合，從而誘導(dǎo)組蛋白H3K9 的去甲基化[15]。另外，KDM1A 還能夠通過與HKMT 復(fù)合體中的HCF-1 相結(jié)合，從而下調(diào)組蛋白H3K9 的甲基化水平[16]。這些研究表明，KDM1A 是通過一套復(fù)雜的調(diào)控系統(tǒng)對組蛋白甲基化水平產(chǎn)生調(diào)控作用。此外，KDM1A 也參與了神經(jīng)細(xì)胞中自噬以及癌細(xì)胞的調(diào)控[17-18]。除了在調(diào)控組蛋白甲基化過程中發(fā)揮了重要作用外， KDM1A 基因在卵母細(xì)胞發(fā)育的整個過程中均有表達(dá)，單細(xì)胞測序結(jié)果顯示KDM1A 缺失會導(dǎo)致卵母細(xì)胞紡錘體損傷、發(fā)育阻滯、合子基因激活異常等現(xiàn)象，進(jìn)而引起早期胚胎的死亡[11]。另外，KDM1A 基因也參與了早期胚胎中的母源-合子基因轉(zhuǎn)化[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，KDM1A 基因在卵母細(xì)胞中均呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，且GV 期的表達(dá)水平要顯著高于MII 期。這不僅暗示了KDM1A 是一個關(guān)鍵的母源因子，由此還推測KDM1A 很有可能在卵母細(xì)胞成熟、發(fā)育以及早期胚胎發(fā)育的調(diào)控過程中發(fā)揮了重要作用。鑒于KDM1A 在正常生理調(diào)控中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，但其在水?？寺∨咛サ恼{(diào)控過程中的作用鮮有研究。本研究構(gòu)建了水牛KDM1A 的真核表達(dá)載體pcDNA3.1（+）-KDM1A。隨后將該載體轉(zhuǎn)染進(jìn)入BFFs 中，48 h 后對其表達(dá)調(diào)控能力進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后BFFs 中KDM1A 基因的表達(dá)水平顯著上調(diào)。這一研究結(jié)果為后續(xù)研究其在克隆胚胎中的功能提供了研究基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本研究克隆得到水牛KDM1A 基因序列全長2 625 bp，預(yù)測編碼874 個氨基酸；水牛KDM1A 與其他物種同源性較高且與生物分類學(xué)保持一致；構(gòu)建了水牛pcDNA3.1（+）-KDM1A 真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1（+）-KDM1A可以顯著提高水牛耳部BFFs 中KDM1A 的表達(dá)水平，且卵母細(xì)胞中KDM1A 的表達(dá)水平顯著高于BFFs。