關(guān)盛宇，劉國(guó)世，張 魯

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 100193）

線粒體是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的一種重要細(xì)胞器，是合成ATP 為細(xì)胞生命活動(dòng)提供能量的主要場(chǎng)所，被稱作“能量工廠”。同時(shí)線粒體還參與各類新陳代謝活動(dòng)，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度與神經(jīng)元信號(hào)傳遞[1]，也在細(xì)胞凋亡、先天性免疫[2]、組裝鐵硫簇[3]等眾多細(xì)胞活動(dòng)中發(fā)揮作用。線粒體是半自主性細(xì)胞器，擁有自身的遺傳物質(zhì)線粒體DNA（mtDNA）[4]。mtDNA 是環(huán)狀雙鏈DNA，是哺乳動(dòng)物唯一存在于細(xì)胞核外的遺傳物質(zhì)，可以獨(dú)立進(jìn)行復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯。人類mtDNA 長(zhǎng)度約16.5 kb，包含37 個(gè)基因，能夠編碼13 種呼吸鏈的多肽亞基，其余組裝線粒體的蛋白質(zhì)由核基因組編碼合成[5]。核基因組編碼的蛋白質(zhì)與mtDNA 編碼的多肽相互作用形成5 個(gè)多亞基復(fù)合物，在線粒體膜內(nèi)組成線粒體呼吸鏈。哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)存在多拷貝的mtDNA，一些特定的細(xì)胞中還存在mtDNA拷貝數(shù)動(dòng)態(tài)變化的現(xiàn)象[6]。mtDNA 突變時(shí)常發(fā)生，細(xì)胞內(nèi)突變型mtDNA 與野生型mtDNA 混合共存的現(xiàn)象稱為mtDNA 的異質(zhì)性（Heteroplasmy）[7]。

1 線粒體DNA 遺傳“瓶頸效應(yīng)”及其理論基礎(chǔ)

1.1 線粒體DNA 的松弛復(fù)制 mtDNA 與核基因組不同，在單一細(xì)胞內(nèi)以多拷貝形式存在，不同細(xì)胞類型、細(xì)胞功能以及細(xì)胞年齡的mtDNA 拷貝數(shù)也不盡相同，一般哺乳動(dòng)物細(xì)胞中mtDNA 拷貝數(shù)在1～10 000[8]。mtDNA的復(fù)制不依賴于細(xì)胞周期，在線粒體融合（Fusion）和分裂（Fission）的過(guò)程中以松弛型復(fù)制模式持續(xù)進(jìn)行[6]。mtDNA 松弛型復(fù)制模式存在一定程度的偏好性，突變型mtDNA 分子發(fā)生復(fù)制的概率和頻率較野生型更高[9]。這種現(xiàn)象導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)mtDNA 基因頻率在分裂前就發(fā)生了變化，即mtDNA 基因頻率的變化不依賴于細(xì)胞周期，而且這種變化隨著細(xì)胞的分裂還會(huì)被放大。

1.2 線粒體DNA 遺傳“瓶頸效應(yīng)”的概念 “瓶頸效應(yīng)”又稱“種群瓶頸效應(yīng)”，是指在世代交替過(guò)程中，原本的大群體由于某些原因發(fā)生崩潰導(dǎo)致種群數(shù)量急劇減少，原種群中僅有極少數(shù)個(gè)體得以存活。這個(gè)過(guò)程類似于種群經(jīng)過(guò)一個(gè)細(xì)小的“瓶頸”，大部分個(gè)體被 “瓶頸”擋住無(wú)法通過(guò)，因此被形象的稱為“瓶頸效應(yīng)”。當(dāng)一個(gè)種群經(jīng)過(guò)了“瓶頸”的作用后，原本的群體異質(zhì)性將大幅度降低，加之遺傳漂變作用，等位基因頻率快速變化，甚至出現(xiàn)某些基因完全消失以及某些等位基因固定的現(xiàn)象。

早期對(duì)荷斯坦奶牛卵母細(xì)胞發(fā)育的研究中發(fā)現(xiàn)，mtDNA 等位基因頻率在遺傳過(guò)程中存在快速變化的現(xiàn)象，mtDNA 由突變產(chǎn)生的新基因型能在短短2～3 代內(nèi)從較低的等位基因頻率快速得到固定[10]。mtDNA 分子可以理解為一個(gè)單倍型個(gè)體，假設(shè)野生型和突變型2 種mtDNA 自由混合在大群體中，每次只選取少數(shù)的mtDNA 保留，則每次所選擇的mtDNA 中突變型與野生型的比例都是不同的。經(jīng)過(guò)遺傳瓶頸，親代mtDNA僅有萬(wàn)分之二到千分之二的拷貝能夠傳遞給子代，該部分DNA 復(fù)制、擴(kuò)增，構(gòu)成子代的mtDNA[11]。這一選擇性保留的過(guò)程存在較大的隨機(jī)性，使得母代和子代、子代個(gè)體之間mtDNA 基因頻率出現(xiàn)差異。研究者已在果蠅、斑馬魚、小鼠以及人類致病性mtDNA 突變的遺傳中發(fā)現(xiàn)了類似現(xiàn)象[12]。

1.3 線粒體DNA 遺傳經(jīng)歷2 次“瓶頸” 線粒體DNA 瓶頸效應(yīng)主要發(fā)生在卵細(xì)胞發(fā)生時(shí)期和胚胎植入前期[13]。第1 次“瓶頸”發(fā)生在原始生殖細(xì)胞（PGCs）增殖分化形成初級(jí)卵母細(xì)胞的過(guò)程中，初級(jí)卵母細(xì)胞包含的mtDNA呈現(xiàn)較低水平。Wai 等[14]發(fā)現(xiàn)小鼠原始生殖細(xì)胞中mtDNA 拷貝數(shù)平均為6 000 左右，而初級(jí)卵母細(xì)胞中mtDNA 拷貝數(shù)下降了一半以上。綿羊卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中，線粒體和mtDNA 大幅度增殖，1 枚綿羊成熟的卵母細(xì)胞中mtDNA 拷貝數(shù)可達(dá)70 萬(wàn)[15]。第2 次“瓶頸”發(fā)生在受精后早期胚胎發(fā)育時(shí)期，早期胚胎發(fā)育過(guò)程中線粒體和mtDNA 不進(jìn)行復(fù)制增殖，囊胚期前整個(gè)胚胎的mtDNA 拷貝總數(shù)保持穩(wěn)定。隨著卵裂的發(fā)生，mtDNA隨線粒體被分配到各個(gè)卵裂球中，胚胎內(nèi)細(xì)胞數(shù)量增多使得單個(gè)細(xì)胞內(nèi)mtDNA 拷貝數(shù)相應(yīng)減少（圖1）。

圖1 mtDNA 遺傳經(jīng)歷2 次“瓶頸”[13]

2 線粒體DNA 遺傳“瓶頸效應(yīng)”的機(jī)制

mtDNA 在母系遺傳過(guò)程中受到物理瓶頸的限制，導(dǎo)致子代mtDNA 保留數(shù)量減少[16]是解釋“瓶頸效應(yīng)”最簡(jiǎn)單直接的假說(shuō)。然而對(duì)于生殖細(xì)胞在不同時(shí)期異質(zhì)性水平的研究表明，mtDNA 拷貝數(shù)減少并不能完全解釋“瓶頸效應(yīng)”的機(jī)制[17]。目前尚未研究出瓶頸效應(yīng)的確鑿機(jī)制，Cao 等[18]提出瓶頸效應(yīng)除了通過(guò)mtDNA絕對(duì)拷貝數(shù)降低產(chǎn)生外，還可以通過(guò)mtDNA 局部復(fù)制或線粒體自噬，以減少mtDNA 有效分離單元的方式產(chǎn)生。有研究提出在細(xì)胞和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)對(duì)線粒體進(jìn)行選擇的機(jī)制[19]：在細(xì)胞層面上來(lái)說(shuō)，一個(gè)細(xì)胞內(nèi)部的異常線粒體達(dá)到一定數(shù)量，影響了細(xì)胞正常生存，這個(gè)細(xì)胞會(huì)發(fā)生凋亡；同時(shí)，如果一個(gè)線粒體內(nèi)部的mtDNA 拷貝異常，且異常的mtDNA 拷貝數(shù)達(dá)到閾值影響了線粒體功能，這個(gè)異常功能的線粒體會(huì)被細(xì)胞通過(guò)自噬清除；在線粒體復(fù)制時(shí)如果出現(xiàn)錯(cuò)誤，線粒體自噬機(jī)制會(huì)啟動(dòng)清除該線粒體。

3 線粒體DNA 對(duì)早期胚胎發(fā)育的影響

線粒體是卵母細(xì)胞中數(shù)量最為豐富的細(xì)胞器之一[20]，在早期胚胎發(fā)育中發(fā)揮關(guān)鍵作用。卵母細(xì)胞攜帶的線粒體與mtDNA 在卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中進(jìn)行積累直到排卵受精[8]，受精后胚胎線粒體數(shù)和mtDNA 拷貝數(shù)不增加，線粒體通過(guò)位置遷移和物理形態(tài)變化的方式提高工作效率[21]。哺乳動(dòng)物mtDNA 遵循母系遺傳，受精結(jié)束后精子所攜帶的父源線粒體和mtDNA 被迅速清除[22]，因此受精后胚胎內(nèi)線粒體和mtDNA 與受精前卵母細(xì)胞保持一致。

mtDNA 拷貝數(shù)影響成熟卵母細(xì)胞受精。Reynier 等[23]研究表明，卵母細(xì)胞發(fā)生異常以及卵胞質(zhì)成熟不完全會(huì)導(dǎo)致mtDNA 拷貝數(shù)降低，影響體外受精（IVF）正常受精比率。Santos 等[24]針對(duì)人類胚胎的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，接受IVF 或胞漿內(nèi)單精子注射（ICSI）而未受精的卵母細(xì)胞內(nèi)的mtDNA 拷貝數(shù)顯著低于受精的卵母細(xì)胞。豬IVF 實(shí)驗(yàn)也有類似的結(jié)果，卵母細(xì)胞受精前mtDNA拷貝數(shù)必須達(dá)到一個(gè)“安全閾值”胚胎才可以正常發(fā)育[25]。有研究證明，體外成熟卵母細(xì)胞線粒體DNA 較低會(huì)影響受精后減數(shù)分裂紡錘體的形成[26]。從以上研究可以看出，在囊胚期mtDNA 復(fù)制得到恢復(fù)之前，MII 期卵母細(xì)胞中較高的mtDNA 拷貝數(shù)對(duì)于支持受精和早期胚胎發(fā)育是必要的。這也提示卵母細(xì)胞成熟前mtDNA 經(jīng)過(guò)第1 次“瓶頸”的重要意義：在卵母細(xì)胞成熟mtDNA 大量復(fù)制前減少異常的突變體mtDNA 比例，降低mtDNA 異質(zhì)性，使得成熟卵母細(xì)胞內(nèi)線粒體功能異常概率盡可能下降，維持受精等生殖過(guò)程的正常進(jìn)行。Diez-Juan 等[27]發(fā)現(xiàn)，能夠附植的囊胚期胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞內(nèi)mtDNA 拷貝數(shù)低于不能附植的胚胎。Fragouli等[28]發(fā)現(xiàn)了同樣的現(xiàn)象，并且提出了以一個(gè)滋養(yǎng)層細(xì)胞內(nèi)mtDNA 拷貝數(shù)的閾值判斷胚胎是否能夠正常附植。能夠正常附植的囊胚中細(xì)胞內(nèi)mtDNA 拷貝數(shù)較低，與mtDNA 遺傳第2 次“瓶頸”相符。mtDNA 在胚胎附植前不復(fù)制，卵裂時(shí)mtDNA 隨線粒體遷移至不同卵裂球內(nèi)，胚胎細(xì)胞在不斷分裂時(shí)每個(gè)細(xì)胞的mtDNA 拷貝數(shù)較低且逐漸降低。

4 結(jié) 語(yǔ)

線粒體DNA 遺傳“瓶頸效應(yīng)”的意義在于清除突變體，保證線粒體正常功能，維持細(xì)胞生命力。mtDNA 缺乏組蛋白保護(hù)且修復(fù)機(jī)制不完善，在線粒體這樣高度活躍的生理生化環(huán)境下突變的發(fā)生在所難免。而mtDNA 相對(duì)封閉的母系遺傳方式使得突變更加容易在遺傳過(guò)程中累積，從而落入“穆勒棘輪”中走向有害突變不停累積的惡性循環(huán)。通過(guò)mtDNA 遺傳“瓶頸效應(yīng)”的手段使突變型和野生型基因快速分離，達(dá)到盡可能消滅有害突變并維持正常生理功能作用。針對(duì)mtDNA 突變?cè)趧?dòng)物配子生成和胚胎發(fā)育的研究，以及為提高 IVF、胚胎移植（ET）、體細(xì)胞核移植（SCNT）等胚胎工程技術(shù)效率的措施的探索，越來(lái)越多的證據(jù)提示線粒體和mtDNA 在動(dòng)物繁殖活動(dòng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，開展mtDNA 遺傳相關(guān)的研究有重要意義，借助快速發(fā)展的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，線粒體在動(dòng)物繁殖中的作用機(jī)制將不斷被揭示，為提高家畜繁殖效率提供支持。