朱強(qiáng) 葉樹鳴 楊震 梁志欣 李春筍 陳良安

1解放軍總醫(yī)院呼吸科，北京100853；2武漢市第一醫(yī)院呼吸科430022

ARDS是臨床常見且難治的急性危重癥，病死率高達(dá)50%左右[1]，嚴(yán)重感染是ARDS最常見的原因之一，約有40%～50%的ARDS患者與感染或膿毒癥有關(guān)[2]。脂多糖 (lipopolysaccharide，LPS)是臨床感染中占大多數(shù)的革蘭陰性桿菌外膜上的主要成分。當(dāng)LPS入侵肺部時(shí)，它能結(jié)合細(xì)胞表面的CD14受體，與宿主細(xì)胞相互作用后使細(xì)胞產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子與炎性介質(zhì)直接損傷肺泡細(xì)胞，引起肺泡上皮屏障的破壞，導(dǎo)致肺水腫，從而促進(jìn)ARDS的發(fā)生、發(fā)展。

全氟化碳 (perfluorocarbon，PFC)是碳?xì)浠衔镏械臍湓颖环尤〈笮纬傻囊活惢衔?，常溫下為無(wú)色、無(wú)味、無(wú)毒的透明液體，黏度低于血液而稍高于水，不溶于血液、水、脂類及其他介質(zhì)，密度高，表面張力低，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，在體內(nèi)不發(fā)生代謝。由于PFC分子間吸引力小，分子不易聚集，分子間的疏松堆積使它有較大空間供氣體分子自由進(jìn)出，因此它具有良好的呼吸氣體運(yùn)載能力。對(duì)氧的溶解和釋放可在10 ms內(nèi)完成，并且這個(gè)過(guò)程是可逆的，比人血紅蛋白所需要的30 ms要快得多；其對(duì)二氧化碳的溶解和釋放的時(shí)間更短，為4 ms，并且也是可逆過(guò)程。PFC溶氧能力是水的20～25倍，血液的2倍，其溶解二氧化碳的能力是水的3倍多。目前，有研究表明PFC通過(guò)液體通氣、霧化吸入及氣化通氣可顯著改善ARDS的氧合，減輕炎癥反應(yīng)，降低死亡率[3-4]，然而其具體機(jī)制尚不明確。本研究應(yīng)用LPS作用于人肺上皮樣A549細(xì)胞模仿ARDS體外細(xì)胞模型，觀察PFC對(duì)LPS致A549細(xì)胞損傷的生物學(xué)影響，以期為ARDS的防治提供更多的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 (1)細(xì)胞系：傳代培養(yǎng)人肺上皮樣A549細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室收藏。 (2)主要試劑：DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、LPS(E.coli 026：B6)、DMSO、PFC、PBS、無(wú)水乙醇、RNAiso Plus(總 RNA提取試劑盒)、PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser、SYBR?Premix Ex TaqTMII、RNA free dd H2O、三氯甲烷、異丙醇、DEPC。 (3)實(shí)驗(yàn)儀器：CO2恒溫培養(yǎng)箱、IX-81顯微鏡、超凈工作臺(tái)、低速離心機(jī) (TDZ4-WS)、流式細(xì)胞儀FACS Callibur、-20℃低溫冰箱、-80℃超低溫冰箱、6孔細(xì)胞培養(yǎng)板、12孔細(xì)胞培養(yǎng)板、24孔細(xì)胞培養(yǎng)板、XSZ-D2型倒置顯微鏡、JY92-2D型超聲細(xì)胞粉碎儀、電熱恒溫水浴鍋、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板 (XB-K-25型)、液氮罐、移液器、高壓滅菌鍋、微型離心機(jī)、高速低溫離心機(jī)、PCR儀 (MJ Mini)、熒光定量RCR儀 (BIORAD iQ5)、核酸蛋白定量分析儀。

1.2 主要溶液配制 (1)0.25%胰蛋白酶的配制：稱取胰蛋白酶干粉2.5 g加入1 000 ml D-Han's液中，將其置于37℃水浴下使其完全溶解，在無(wú)菌條件下，使用0.45μm和0.22μm雙層濾膜過(guò)濾除菌，將配置好的胰蛋白酶分裝于100 ml無(wú)菌瓶中，-20℃保存?zhèn)溆谩?2)PBS的配制：稱取粉劑6 g置于500 ml滅菌水中，配制成0.01 mol/L的溶液，高壓滅菌，4℃保存?zhèn)溆谩?(3)LPS溶液：將LPS 10 mg加10 ml無(wú)血清培養(yǎng)液溶解，使其濃度為1 g/L，-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 方法

1.3.1 A549細(xì)胞系的培養(yǎng)

1.3.1.1 凍存細(xì)胞的復(fù)蘇 從液氮罐中取出裝有A549細(xì)胞的凍存管，將其迅速置于37℃的水浴中，使凍存細(xì)胞快速融化，無(wú)菌條件下將2 ml凍存管中的細(xì)胞懸液移入10 ml無(wú)菌離心管中，向離心管中加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液4 ml，離心半徑15 cm，1 000 r/min離心5 min(其目的為洗去凍存液中的DMSO)，棄去上清液，重復(fù)洗滌離心1次，細(xì)胞沉淀用4 ml含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸后，無(wú)菌條件下轉(zhuǎn)移入培養(yǎng)皿中，置于37℃含5%CO2的飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。12 h和24 h后分別于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞是否貼壁生長(zhǎng)。

1.3.1.2 細(xì)胞培養(yǎng) A549細(xì)胞置于37℃含5%CO2的飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，每次細(xì)胞換液時(shí)直接棄去培養(yǎng)液，再加入新的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液。

1.3.1.3 細(xì)胞傳代 倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，待細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿底后進(jìn)行傳代。棄去DMEM培養(yǎng)液，向培養(yǎng)皿中加入約1 ml 0.25%含EDTA的胰蛋白酶溶液，將細(xì)胞放入培養(yǎng)箱，約2～5 min后于倒置顯微鏡下觀察到貼壁胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隙變大。細(xì)胞變?yōu)閳A形后，棄去培養(yǎng)瓶中的胰蛋白酶，迅速加入約2～3 ml含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，終止胰蛋白酶消化作用。用吸管反復(fù)吹打瓶底使貼壁細(xì)胞懸浮，盡量將細(xì)胞吹打?yàn)閱渭?xì)胞懸液，將懸浮的單細(xì)胞懸液等量移入2～3個(gè)培養(yǎng)皿中，向每個(gè)培養(yǎng)皿中加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基約7～8 ml，置于37℃含5%CO2的飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3.1.4 細(xì)胞凍存 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，0.25%的胰蛋白酶消化后，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，吸管反復(fù)吹打貼壁細(xì)胞使細(xì)胞懸浮，將細(xì)胞懸液移入10 ml離心管中，離心半徑15 cm，1 000 r/min離心5 min，加入配制好的含10%DMSO的凍存培養(yǎng)液，使凍存液中細(xì)胞的最終濃度為5×106～1×107/ml，用吸管移入凍存管中，標(biāo)記后，-20℃放置1 h，-70℃放置5 h后，移入液氮罐中保存。

1.3.1.5 細(xì)胞計(jì)數(shù) 將蓋玻片蓋在血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，取10μl細(xì)胞懸液加入90μl PBS中稀釋后，滴加少量稀釋液于蓋玻片邊緣，靜置1 min。于倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)4大格的細(xì)胞總數(shù)。細(xì)胞數(shù)(個(gè)/ml)=4大格細(xì)胞總數(shù)/4×10×104。

1.3.2 LPS致A549細(xì)胞損傷模型的建立

1.3.2.1 細(xì)胞分組及培養(yǎng) 將A549細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中，待其生長(zhǎng)達(dá)80%融合度時(shí)，對(duì)照組加入完全培養(yǎng)基，LPS組加入LPS及完全培養(yǎng)基，使LPS終濃度為100 mg/L。分別于加入LPS后0、1、2、4、6、8、10、12、24 h檢測(cè)A549細(xì)胞相關(guān)損傷指標(biāo)。

1.3.2.2 提取細(xì)胞總RNA 采用TAKARA公司的RNAiso Plus試劑盒提取A549細(xì)胞總RNA。具體步驟：(1)去除培養(yǎng)基，PBS清洗1次。按每10 cm2生長(zhǎng)細(xì)胞中加入1 ml RNAiso Plus，輕輕搖晃，使裂解液均勻分布于細(xì)胞表面。(2)將含有細(xì)胞的裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中，移液槍反復(fù)吹打至裂解液中無(wú)明顯沉淀，室溫靜置5 min。(3)向裂解液中按1∶5體積比加入氯仿，用力混合至溶液乳化呈乳白色，室溫靜置5 min。(4)4℃，離心半徑15 cm，12 000 r/min離心15 min。取出離心管，此時(shí)勻漿液分為3層：無(wú)色上清液 (含RNA)、居于中間的白色蛋白層及下層的紅色有機(jī)相。(5)轉(zhuǎn)移上清液至另一離心管中，同時(shí)計(jì)算產(chǎn)量。(6)上清液中加入等體積異丙醇，上下輕輕顛倒離心管，充分混勻后，室溫靜置10 min。 (7)4℃，離心半徑15 cm，12 000 r/min離心10 min。(8)小心棄去上清。加入75%乙醇1 ml，輕輕震蕩洗滌離心管管壁，4℃，離心半徑15 cm，7 500 r/min離心5 min，小心棄去上清。(9)打開離心管蓋，室溫干燥沉淀。待沉淀干燥后，加入適量的RNase-free dd H2O溶解沉淀。(10)RNA溶解后置于冰上繼續(xù)下一步實(shí)驗(yàn)。

1.3.2.3 RNA純度測(cè)定 RNase-free dd H2O稀釋RNA，其后應(yīng)用核酸蛋白質(zhì)定量分析儀測(cè)定吸光度以及RNA濃度，OD260/OD280比值應(yīng)介于1.7～2.1之間。

1.3.2.4 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 采用TAKARA公司PrimeScript?RT reagent Kit進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。(1)祛除基因組DNA。反應(yīng)體系：總RNA 1.0μg，5×gDNA Eraser Buffer 2.0μl，gDNA Eraser 1.0μl，RNase-free dd H2O 6μl。反應(yīng)條件：42℃2 min。(2)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)體系：第一步反應(yīng)液10μl，5×PrimeScript?Buffer2 4μl，PrimeScript?RT Enzyme Mix I 1μl，RNase-free dd H2O 4μl，RT Primer Mix4 1μl。反應(yīng)條件：37℃15 min，85℃5 s。反應(yīng)合成的c DNA直接進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.3.2.5 引物設(shè)計(jì) 搜索Genebank，對(duì)IL-6(ACCESSION： NM_000600.3) 及 β-actin(ACCESSION：NM 001101.3)的基因序列應(yīng)用Primer BLAST進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。IL-6上游引物：5'-CCAGAGCTGTGCAGATGAGT-3'，下 游 引物：5'-AGTTGTCATGTCCTGCAGCC-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為155 bp。β-actin(內(nèi)參)上游引物：5'-CAAAGACCTGTACGCCAACACAGT-3'，下游引物：5'-ACTCCTGCTTGCTGATCCACATCT-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為215 bp。

1.3.2.6 熒光實(shí)時(shí)定量PCR 采用TAKARA公司SYBR?Premix Ex TaqTMII進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系：DNA模板1.5μmol/L，dd H2O 6.9μl，SYBR?Premix Ex TaqTMII 10μl，上游引物 (10μmol/L)0.8μl，下游引物 (10μmol/L)0.8μl。

反應(yīng)條件：兩步法PCR擴(kuò)增程序。Stage 1(預(yù)變性)：95℃30 s，20℃/s，1 Cycle。Stage 2(PCR反應(yīng))：95℃5 s，20℃/s；60℃20 s，20℃/s，40 Cycles。Stage 3(融解曲線分析)：95℃30 s，20℃/s；65℃15 s，20℃/s；95℃30 s，0.1℃/s。

1.3.3 觀察指標(biāo)

1.3.3.1 細(xì)胞分組 實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞均處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。細(xì)胞分為4組。(1)對(duì)照組：不作任何干預(yù)；(2)PFC組：按10%體積比 (PFC∶培養(yǎng)液)加入全氟辛烷，使用超聲波將PFC與培養(yǎng)液混勻，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中；(3)LPS組：干預(yù)時(shí)以100 mg/L的終濃度加入相應(yīng)劑量的LPS； (4)LPS+PFC組：以LPS的終濃度為100 mg/L、PFC的體積比為10%加入DMEM培養(yǎng)基，通過(guò)超聲波混勻，加入培養(yǎng)皿 (表1)。

表1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分組及處理方法(加入相應(yīng)試劑劑量，μl)

1.3.3.2 顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，消化后將細(xì)胞懸液平均接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，24 h后按以上分組給予相應(yīng)處理。繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h，在倒置顯微鏡下觀察形態(tài)改變并拍照記錄。

1.3.3.3 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的繪制 細(xì)胞分組同形態(tài)學(xué)觀察實(shí)驗(yàn)。采用細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)各組A549細(xì)胞的增殖能力：(1)胰蛋白酶消化A549細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液；(2)細(xì)胞計(jì)數(shù)后以每孔4×104接種于12孔板中； (3)37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)；(4)24 h后按不同分組給予相應(yīng)處理； (5)從加藥后第1天開始，每組每天計(jì)數(shù)細(xì)胞3個(gè)復(fù)孔，連續(xù)6 d；(6)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 熒光實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果使用2-ΔΔCt方法計(jì)算。其余統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 17.0軟件包，所有數(shù)據(jù)均經(jīng)正態(tài)分布性檢驗(yàn) (Klmogorov-Smirnov test)，以確定數(shù)據(jù)是否呈正態(tài)分布；并進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn) (Bartle法)以確定總體方差是否相等。將所得數(shù)據(jù)分別進(jìn)行方差分析 (正態(tài)方差齊者用Bonferroni法，正態(tài)方差不齊者用Tamhane法)，數(shù)據(jù)以±s表示，P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IL-6 m RNA表達(dá)水平 LPS刺激A549細(xì)胞后，各時(shí)間點(diǎn)LPS組與對(duì)照組 (0 h)IL-6 m RNA表達(dá)的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)，見表2、圖1。

表2 脂多糖刺激A549細(xì)胞后各時(shí)間點(diǎn)IL-6 m RNA相對(duì)表達(dá)量的變化 (±s，n=3)

表2 脂多糖刺激A549細(xì)胞后各時(shí)間點(diǎn)IL-6 m RNA相對(duì)表達(dá)量的變化 (±s，n=3)

時(shí)間 (h) IL-6 mRNA相對(duì)表達(dá)量0 1.00 2.03±0.75 2 4.06±1.25 4 16.00±2.21 6 6.41±1.24 8 5.24±1.15 10 3.55±1.33 12 2.30±0.77 24 2.10±0.19 1

圖1 脂多糖刺激A549細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn)IL-6 m RNA相對(duì)表達(dá)水平的變化

2.2 各組A549細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 各組A549細(xì)胞均呈上皮樣細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。對(duì)照組、PFC組及LPS+PFC組細(xì)胞形態(tài)飽滿，排列緊密，生長(zhǎng)狀態(tài)良好。LPS組細(xì)胞明顯稀疏，細(xì)胞形態(tài)皺縮，體積變小，部分細(xì)胞呈圓形，生長(zhǎng)狀態(tài)變差。見圖2～4。

2.3 各組A549細(xì)胞增殖能力的變化 從加藥后第4天起，LPS組與其他組細(xì)胞數(shù)目的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)，即LPS明顯抑制了A549細(xì)胞的增殖能力，而PFC明顯減弱了LPS的抑制效應(yīng)。PFC組與對(duì)照組的細(xì)胞數(shù)目差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此PFC本身對(duì)A549細(xì)胞的增殖無(wú)影響。見表3、圖5。

3 討論

ARDS是臨床上常見的危重癥，目前臨床治療尚未取得突破性進(jìn)展，機(jī)械通氣仍是其最主要的治

圖2 加入LPS或PFC后24 h各組A549細(xì)胞形態(tài) ×100 A：對(duì)照組；B：LPS組；C：PFC組；D：LPS+PFC組

圖3 加入LPS或PFC后48 h各組A549細(xì)胞形態(tài) ×100 A：對(duì)照組；B：LPS組；C：PFC組；D：LPS+PFC組

圖4 加入LPS或PFC后72 h各組A549細(xì)胞形態(tài) ×100 A：對(duì)照組；B：LPS組；C：PFC組；D：LPS+PFC組

表3 各組A549細(xì)胞的數(shù)目 (±s)

表3 各組A549細(xì)胞的數(shù)目 (±s)

注：LPS為脂多糖；PFC為全氟化碳；與對(duì)照組比較，a P＜0.01；與PFC組比較，b P＜0.05，c P＜0.01；與LPS+PFC組比較，d P＜0.05

組別 樣本數(shù)細(xì)胞數(shù)目 (×104/ml)1 d 2 d 3 d 4 d 5 d 6 d對(duì)照組 3 5.8±1.02 11.0±1.54 15.5±2.12 25.1±2.96 27.7±3.37 30.3±3.51 LPS組 3 6.4±1.13 9.1±1.25 12.9±1.58b 16.5±1.92acd 18.8±2.18acd 22.1±2.52abd PFC組 3 5.2±0.98 10.4±1.32 17.6±2.17 24.8±2.78 26.9±3.05 28.9±3.18 LPS+PFC組 3 5.4±0.96 10.6±1.09 14.4±1.78 22.4±2.62 24.3±2.81 26.8±2.97

療措施。在藥物治療方面，大部分治療措施著重于控制炎癥反應(yīng)[5]。盡管肺損傷的發(fā)展取決于炎癥介質(zhì)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷[6]，其嚴(yán)重程度及恢復(fù)卻依賴于上皮細(xì)胞的功能[7]。事實(shí)上，肺損傷最為顯著的病理學(xué)改變是彌漫性肺泡上皮損傷[8-9]；生理學(xué)上亦發(fā)現(xiàn)肺泡上皮結(jié)構(gòu)與功能的完整性是肺損傷嚴(yán)重程度的重要決定因素[10]；此外，肺泡上皮也是肺泡水腫液再吸收的位點(diǎn)，其在與ARDS相關(guān)的肺纖維變性中扮演重要角色[11-13]，當(dāng)肺泡上皮細(xì)胞未能有效修復(fù)時(shí)，缺損部位便被纖維細(xì)胞替代，從而導(dǎo)致肺纖維化。因此，以改善肺泡上皮細(xì)胞功能為目標(biāo)的治療措施可能是加速肺損傷的修復(fù)及降低ARDS病死率的關(guān)鍵因素。

圖5 各組A549細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

目前，由于PFC的理化和生物學(xué)特性，它已經(jīng)廣泛應(yīng)用于完全液體通氣及部分液體通氣治療ARDS，并取得良好效果[14-15]。國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)研究報(bào)道[16-18]PFC治療ARDS可能有以下機(jī)制：(1)具有較高的攜氧及二氧化碳能力，在肺內(nèi)起著氣體轉(zhuǎn)運(yùn)的作用；(2)在肺泡內(nèi)形成PFC薄層，通過(guò)其低表面張力的特性發(fā)揮表面活性物質(zhì)樣作用，從而復(fù)張萎陷的肺泡，提高肺順應(yīng)性；(3)由于PFC的重力作用，其主要進(jìn)入重力依賴區(qū)，壓迫肺血管，使肺下垂部位的血流相對(duì)減少，從而改善肺內(nèi)通氣/血流比；(4)促進(jìn)肺內(nèi)源性肺泡表面活性物質(zhì)產(chǎn)生；(5)有利于肺泡及小氣道分泌物的排出；(6)抑制肺組織的炎性反應(yīng)，防止或減輕肺損傷；(7)有穩(wěn)定細(xì)胞膜及抑制肺內(nèi)炎性介質(zhì)及細(xì)胞因子釋放的作用；(8)一定程度上抑制呼吸道細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖[19]。但目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)PFC治療ARDS的細(xì)胞生物學(xué)研究報(bào)道。

PFC治療ARDS的細(xì)胞生物學(xué)研究主要關(guān)注的是細(xì)胞形態(tài)、增殖、遷移及凋亡等方面的變化，而肺泡上皮細(xì)胞的以上生物學(xué)功能在肺損傷的修復(fù)中發(fā)揮重要作用。鑒于此，本研究從細(xì)胞生物學(xué)角度探討了PFC對(duì)LPS誘導(dǎo)A549細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，試圖為臨床應(yīng)用PFC治療ARDS提供細(xì)胞生物學(xué)理論依據(jù)。

細(xì)胞形態(tài)學(xué)是反映細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)最為直觀的指標(biāo)。本研究通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)LPS作用于A549細(xì)胞使其形態(tài)皺縮，生長(zhǎng)狀態(tài)變差，PFC本身對(duì)其形態(tài)無(wú)明顯影響，當(dāng)PFC與LPS共同孵育A549細(xì)胞時(shí)，能夠顯著改善LPS對(duì)其形態(tài)及生長(zhǎng)狀態(tài)的不良影響。

細(xì)胞生長(zhǎng)曲線是測(cè)定細(xì)胞絕對(duì)生長(zhǎng)數(shù)的常用方法，也是判定細(xì)胞活力的重要指標(biāo)，是細(xì)胞生物學(xué)特性的基本參數(shù)之一。本研究應(yīng)用細(xì)胞計(jì)數(shù)法繪制生長(zhǎng)曲線，發(fā)現(xiàn)LPS能夠明顯抑制A549細(xì)胞的增殖能力，而PFC本身對(duì)其增殖能力沒(méi)有影響，當(dāng)PFC與LPS共同孵育A549細(xì)胞時(shí)，能夠顯著改善LPS對(duì)其增殖的抑制作用。

綜上所述，本研究證實(shí)LPS作用于A549細(xì)胞能夠使其形態(tài)皺縮，生長(zhǎng)狀態(tài)變差，且能夠明顯抑制其增殖能力及遷移能力，并因此抑制其損傷的修復(fù)，而PFC能夠明顯減輕LPS誘導(dǎo)的以上損傷改變，進(jìn)而促進(jìn)A549細(xì)胞的損傷修復(fù)能力。PFC對(duì)LPS導(dǎo)致的A549細(xì)胞損傷產(chǎn)生的以上保護(hù)作用，可能是其在既往的臨床研究及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制之一，其分子機(jī)制尚有待進(jìn)一步的研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突