付悅 孔靈菲

中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，沈陽110001

特發(fā)性肺纖維化(Idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一種慢性、進(jìn)行性、不可逆的間質(zhì)性肺疾病。美國每年約有40 000例發(fā)病，診斷后的中位生存期僅為3～5年[1-2]，尚缺乏療效顯著的治療藥物。很多研究發(fā)現(xiàn)胃食管反流病(gastroesophageal reflux disease，GERD)和胃內(nèi)容物誤吸在IPF患者中很常見，西方IPF患者GERD發(fā)病率高達(dá)67%～88%，在中國為62.3%。目前，IPF病因尚不明確，但胃食管反流已經(jīng)被公認(rèn)為IPF的危險因素之一。Lee等[3]發(fā)現(xiàn)，IPF患者肺泡灌洗液的p H值下降且胃蛋白酶濃度有所升高。此外，許多動物實驗已經(jīng)證實，慢性持續(xù)胃酸吸入會導(dǎo)致肺纖維化和其他呼吸系統(tǒng)疾病[4-6]。

瞬時感受器電位香草酸受體1(transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1)最初被認(rèn)為是表達(dá)在初級神經(jīng)元上的辣椒素和相關(guān)天然刺激物的受體，后來發(fā)現(xiàn)是一種表達(dá)在多種類型細(xì)胞上的非選擇性陽離子通道，可被熱、辣椒素、內(nèi)源性H+以及反流胃液中的鹽酸激活[7-8]。TRPV1主要通過信息整合，經(jīng)由Ca2+通道對細(xì)胞的功能產(chǎn)生影響，與心肌、肝、腎等多種組織纖維化密切相關(guān)[9-10]。本研究采用氣管內(nèi)注入胃液的方式復(fù)制胃食管反流引起胃液誤吸的模型，采用TRPV1抑制劑辣椒平 (capsazepine，CPZ)進(jìn)行干預(yù)，觀察TRPV1對大鼠胃液微吸入導(dǎo)致肺纖維化的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠30只，6～7周齡，體質(zhì)量 (200±20)g，由遼寧長生生物有限公司提供，將大鼠飼養(yǎng)于溫度為20～25℃，濕度40%～70%，人工12 h晝夜循環(huán)的環(huán)境中，自由進(jìn)食水。

1.2 主要試劑 羥脯氨酸測定試劑盒 (南京建成公司)，Masson染色試劑盒 (南京建成公司)，大鼠轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒 (美國R&D公司)，CPZ(美國 MCE公司)，TRPV1一抗(美國 Abcam 公司)，α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle action，α-SMA)一 抗 (美國Abcam公司)，Ⅰ型膠原蛋白一抗 (美國Abcam公司)，免疫組織化學(xué)二抗試劑盒 (福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司)，DAB顯色試劑盒，ECL發(fā)光液(美國Bio-rad公司)。

1.3 動物分組 將30只SD大鼠隨機(jī)分為3組：對照組、模型組和CPZ干預(yù)組，每組10只。模型組經(jīng)氣管插管注入大鼠胃液0.5 ml/kg，對照組注入等量生理鹽水，CPZ干預(yù)組在氣管插管前30 min腹腔注射CPZ 10 mg/kg。所有操作每周1次，連續(xù)8周。

1.4 造模方法 將健康雄性SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，采用氣管插管注入大鼠胃液的方式模擬胃食管反流大鼠誤吸胃內(nèi)容物的模型。將大鼠用10%水合氯醛以3.5 ml/kg的劑量腹腔注射麻醉后，針刺大鼠腳掌無反射，證明麻醉充分。將大鼠仰臥位置于手術(shù)板上，頭朝向術(shù)者，固定頭部和四肢，手術(shù)板頭側(cè)抬高30～45°，用紗布包裹鼠舌，將鼠舌向左外上方拉出口腔，使其暴露聲門。調(diào)整額鏡將照射光源對準(zhǔn)聲門，即可看見聲門隨呼吸開閉，趁聲門開啟時順勢將靜脈留置針插入氣管，見管口棉球隨呼吸擺動，證明插管成功。將胃液注入氣管，隨即注入少量空氣，保證液體全部注入氣管，完畢后立即將動物直立、左右搖晃，以確保液體在肺內(nèi)均勻分布，待其清醒后，放回鼠籠。

1.5 標(biāo)本采集 首次氣管灌注9周后，稱重，以10%水合氯醛麻醉大鼠，收集大鼠肺泡灌洗液，取右肺于4%多聚甲醛內(nèi)固定，用于組織學(xué)和免疫組織化學(xué)分析，取左肺放于-80℃冰箱保存，用于蛋白質(zhì)印跡檢測。肺組織中羥脯氨酸含量和BALF中TGF-β1水平檢測具體操作分別按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6 組織學(xué)檢測 將肺組織常規(guī)固定，脫水透明，石蠟包埋，切片后進(jìn)行組織學(xué)染色。HE染色：充分烤片后脫蠟水化，蘇木精染液3 min，流水沖洗，鹽酸酒精分化3 s，自來水沖洗15 min，伊紅染液2 min，蒸餾水洗，梯度酒精脫水，透明，中性樹膠封片。Masson染色操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。采用免疫組織化學(xué)方法檢測大鼠肺組織中TRPV1表達(dá)水平。充分烤片后，脫蠟水化，抗原修復(fù)，滅活內(nèi)源性過氧化物酶，封閉，一抗孵育，二抗孵育，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，中性樹膠封片。

1.7 組織學(xué)分析 使用Szapiel法評價肺泡炎和肺纖維化程度，根據(jù)HE染色結(jié)果對肺泡炎程度進(jìn)行評分。0分：無肺泡炎；1分：輕度肺泡炎，病變范圍占全肺20%以下，肺泡間隔因炎癥細(xì)胞浸潤而增寬，病變局限；2分：中度肺泡炎，病變范圍占全肺的20%～50%，近胸膜處受累更嚴(yán)重；3分：中度肺泡炎，病變范圍超過全肺的50%，呈彌漫性分布。根據(jù)Masson染色結(jié)果對纖維化程度進(jìn)行評分。0分：無肺纖維化；1分：輕度肺纖維化，纖維化范圍占全肺20%以下，胸膜和胸膜下間質(zhì)受累，存在肺泡結(jié)構(gòu)紊亂；2分：中度肺纖維化，纖維化范圍占全肺的20%～50%；3分：重度肺纖維化，纖維化范圍超過全肺的50%，呈彌漫性分布。

1.8 蛋白質(zhì)印跡檢測 采用蛋白質(zhì)印跡檢測大鼠肺組織中α-SMA、Ⅰ型膠原蛋白和TRPV1蛋白的表達(dá)水平。提取肺組織總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)印至PVDF膜，脫脂牛奶封閉，一抗孵育過夜，二抗孵育，ECL法顯色，以GAPDH為內(nèi)參，應(yīng)用Image J軟件對條帶灰度值進(jìn)行分析。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 20.0軟件，實驗結(jié)果以±s表示，經(jīng)方差齊性檢驗和正態(tài)性檢驗后，采用單因素方差分析進(jìn)行比較，組間多重比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般狀況 首次氣管灌注后，對照組大鼠活動正常，皮毛光亮，呼吸平穩(wěn)，精神狀態(tài)尚可，飲水、進(jìn)食量略少于灌注前，1周后恢復(fù)；模型組大鼠活動減少，皮毛光澤差，呼吸急促，精神萎靡，飲水、進(jìn)食量明顯少于灌注前，2周后恢復(fù)；CPZ干預(yù)組大鼠一般狀況較對照組略差，但較模型組有所改善。首次灌注后2周內(nèi)，各組大鼠體質(zhì)量均出現(xiàn)增長緩慢，以模型組最明顯；第2周后，各組大鼠體質(zhì)量逐漸恢復(fù)增長，各組大鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

2.2 肺組織病理學(xué)變化

2.2.1 肺泡炎程度 HE染色結(jié)果顯示，對照組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)基本完整，肺泡和間質(zhì)僅有少量炎癥細(xì)胞浸潤，肺泡間隔未見增厚；模型組大鼠定期吸入胃液導(dǎo)致肺泡結(jié)構(gòu)破壞明顯，肺泡間隔增寬，大量炎癥細(xì)胞浸潤，成纖維細(xì)胞增生，可見纖維組織形成和膠原沉積；CPZ干預(yù)組大鼠雖然存在肺泡結(jié)構(gòu)破壞和炎癥細(xì)胞浸潤，但病理改變程度與模型組相比明顯改善。量化肺泡炎程度，模型組肺泡炎評分高于對照組 (t=5.79，P＜0.01)，而CPZ干預(yù)組評分比模型組明顯降低 (t=-2.17，P＜0.05)。見圖1、2。

表1 3組大鼠不同時間體質(zhì)量變化 (g，±s)

表1 3組大鼠不同時間體質(zhì)量變化 (g，±s)

組別 鼠數(shù) 0周 2周 4周 6周 8周對照組 10 208.6±12.1 216.3±8.4 249.2±8.1 267.0±15.8 302.8±17.8模型組 10 204.0±11.2 204.2±13.9 239.6±19.9 264.4±15.7 296.1±16.1辣椒平干預(yù)組 10 205.7±9.6 210.4±7.9 240.5±10.3 264.9±16.2 297.8±12.6 F值 0.450 3.367 1.485 0.075 0.495 P值 0.645 0.049 5 0.244 0.928 0.615

圖1 各組大鼠肺泡炎程度 HE ×100 A：對照組；B：模型組；C：辣椒平干預(yù)組

圖2 各組大鼠肺泡炎評分

2.2.2 肺組織纖維化程度 Masson染色結(jié)果顯示，對照組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)完整，僅有少量膠原沉積；模型組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，肺泡壁增厚，細(xì)胞外基質(zhì)增多，肺泡及氣管周圍有大量膠原沉積，肺纖維化評分顯著高于對照組 (t=6.91，P＜0.01)；與模型組比較，CPZ干預(yù)組纖維化程度顯著改善，肺纖維化評分明顯降低 (t=-2.54，P＜0.05)。見圖3、4。

圖3 各組大鼠肺纖維化評分

圖4 各組大鼠肺組織纖維化程度 Masson ×100 A：對照組；B：模型組；C：辣椒平干預(yù)組

2.3 肺組織中α-SMA及Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)蛋白質(zhì)印跡結(jié)果表明，模型組大鼠肺組織中α-SMA表達(dá)顯著高于對照組 (t=3.46，P＜0.01)，而CPZ干預(yù)組大鼠肺組織中α-SMA表達(dá)與模型組相比下降 (t=-2.11，P＜0.05)；與對照組比較，模型組大鼠肺組織中Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)升高 (t=5.61，P＜0.01)，而CPZ干預(yù)組大鼠肺組織中Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)較模型組降低 (t=-2.33，P＜0.05)。見圖5。

圖5 蛋白質(zhì)印跡檢測各組大鼠肺組織中α-平滑肌肌動蛋白及Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)水平 A：電泳圖；B：柱狀圖

2.4 肺組織中羥脯氨酸含量 與對照組比較，模型組大鼠肺組織中羥脯氨酸含量明顯增加 (t=11.75，P＜0.01)，CPZ干預(yù)組大鼠肺組織中羥脯氨酸含量較模型組降低 (t=-4.81，P＜0.01)。見表2。

表2 各組大鼠肺組織中羥脯氨酸含量 (±s)

表2 各組大鼠肺組織中羥脯氨酸含量 (±s)

注：與對照組比較，a P＜0.01；與模型組比較，b P＜0.01

組別 鼠數(shù) 羥脯氨酸 (mg/g)對照組 10 0.30±0.07模型組 10 0.74±0.06a辣椒平干預(yù)組 10 0.56±0.12b F值 69.78 P值 ＜0.0001

2.5 肺組織中TRPV1的表達(dá) 免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組TRPV1表達(dá)水平顯著增加 (t=9.31，P＜0.01)，利用CPZ抑制TRPV1后，大鼠肺纖維化明顯改善 (圖6、7)。蛋白質(zhì)印跡檢測也呈現(xiàn)相似的趨勢 (圖8)。

圖6 免疫組織化學(xué)檢測各組大鼠肺組織中TRPV1表達(dá)水平 ×200 A：對照組；B：模型組；C：辣椒平干預(yù)組

圖7 各組大鼠肺組織中TRPV1表達(dá)水平

2.6 BALF中TGF-β1水平 結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組大鼠BALF中TGF-β1明顯增加(t=15.16，P＜0.01)；與模型組比較，CPZ干預(yù)組BALF中TGF-β1水平下降 (t=-8.29，P＜0.05)。見表3。

3 討論

肺纖維化特征性病變是細(xì)胞損傷后進(jìn)一步組織重塑導(dǎo)致的肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺組織細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積所致的纖維化變性[11]。IPF是最常見的肺纖維化類型，是一種進(jìn)行性、致死性疾病，5年生存率僅為20%[12]。1982年Osler提出胃酸反流和哮喘之間的聯(lián)系后，胃酸反流被認(rèn)為是多種呼吸系統(tǒng)疾病的危險因素[13]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，IPF可能與長期誤吸胃內(nèi)容物有關(guān)，并通過食管p H值監(jiān)測證實，IPF患者GERD發(fā)病率遠(yuǎn)高于健康人[14-16]。

圖8 蛋白質(zhì)印跡檢測各組大鼠肺組織中TRPV1表達(dá)水平 A：電泳圖；B：柱狀圖

表3 各組大鼠BALF中TGF-β1水平 (±s)

表3 各組大鼠BALF中TGF-β1水平 (±s)

注：TGF-β1為轉(zhuǎn)化生長因子β1；與對照組比較，a P＜0.01；與模型組比較，b P＜0.05

組別 鼠數(shù) TGF-β1(ng/L)對照組 10 175.03±45.00模型組 10 609.10±81.75a辣椒平干預(yù)組 10 371.70±59.96b F值 115.20 P值 ＜0.000 1

本實驗通過向大鼠氣道內(nèi)注入胃液，模擬胃食管反流引起大鼠誤吸胃液的模型，發(fā)現(xiàn)連續(xù)8周灌注胃液的模型組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡壁增厚，肺泡炎評分明顯高于對照組，Masson染色發(fā)現(xiàn)模型組大鼠肺組織細(xì)胞外大量膠原沉積，通過Szapiel法量化大鼠肺組織纖維化程度，誤吸胃液的模型組大鼠肺纖維化評分顯著高于對照組。當(dāng)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞時，便可分泌α-SMA。本研究對纖維化的標(biāo)記物α-SMA及Ⅰ型膠原蛋白進(jìn)行了檢測，通過蛋白質(zhì)印跡檢測發(fā)現(xiàn)，誤吸胃液的模型組大鼠α-SMA及Ⅰ型膠原蛋白顯著高于對照組[17]。此外，羥脯氨酸是膠原蛋白的主要成分之一，反映組織膠原代謝情況。本研究通過檢測各組大鼠肺組織中羥脯氨酸含量發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠肺組織中羥脯氨酸含量明顯高于對照組。這些結(jié)果均表明，誤吸胃液導(dǎo)致大鼠發(fā)生肺纖維化。

目前認(rèn)為，胃酸反流主要通過酸性物質(zhì)的直接損傷和激活迷走神經(jīng)介導(dǎo)的反射引起呼吸系統(tǒng)疾病[13]。已有文獻(xiàn)報道[18]，TRPV1參與了胃食管反流通過神經(jīng)反射引起的氣道神經(jīng)源性炎癥，但TRPV1是否參與到誤吸反流物直接損傷肺組織引起肺纖維化的過程，尚不清楚。早在1998年，Tominaga等[19]證實，細(xì)胞外低p H值可激活TRPV1離子通道，提示誤吸到肺部的酸性胃內(nèi)容物可能通過激活TRPV1促進(jìn)肺纖維化發(fā)生。本實驗發(fā)現(xiàn)，長期誤吸酸性胃液的大鼠不但發(fā)生了肺纖維化，免疫組織化學(xué)和蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示其肺組織內(nèi)TRPV1表達(dá)水平高于對照組，利用CPZ阻斷TRPV1后，誤吸胃液的大鼠肺組織中α-SMA、Ⅰ型膠原蛋白及羥脯氨酸含量較模型組顯著降低，肺纖維化程度明顯改善，這表明TRPV1參與了誤吸胃液導(dǎo)致的肺纖維化發(fā)生過程。

TGF-β1是關(guān)鍵的促纖維化因子，TGF-β1通過磷酸化其下游的Smad2/3信號通路，觸發(fā)促纖維化基因的過度表達(dá)，參與心、肝、腎、肺等多種器官的纖維化過程[11]。有文獻(xiàn)報道IPF患者氣道上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中TGF-β增加[20]，本研究結(jié)果與既往研究一致。酶聯(lián)免疫吸附試驗方法檢測各組大鼠BALF中TGF-β1發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，氣管內(nèi)注入胃液的模型組大鼠BALF中TGF-β1水平顯著增加，而腹腔注射CPZ抑制TRPV1后，大鼠BALF中TGF-β1下降。這些結(jié)果均表明，TRPV1的激活在誤吸胃液引起大鼠肺纖維化過程中起促進(jìn)作用，而使用TRPV1抑制劑CPZ可顯著改善大鼠肺纖維化。

本研究首次提出了TRPV1在誤吸胃液所致肺纖維化過程中的重要作用，提示TRPV1可能為合并胃食管反流的IPF患者提供新的治療靶點。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突