向清華，覃俏俏，趙美玲，林巖

（東莞康華醫(yī)院，廣東東莞，523070）

多重連接依賴探針擴增（multiplex ligationdependent probe amplification，MLPA）技術(shù)于2002年由荷蘭科學(xué)家Schouten 等發(fā)明，該技術(shù)對流產(chǎn)絨毛染色體非整倍體檢測結(jié)果的可靠度達100%［1］，從提取DNA 至結(jié)果呈現(xiàn)僅需24～48h［2］。作為出生缺陷的二級預(yù)防手段，以其特異性、高通量、低成本、靈敏高效的特點在臨床被廣泛使用［3］。但目前絨毛染色體標本采集方法缺乏系統(tǒng)的分析及總結(jié)，規(guī)范采集標本細節(jié)欠清晰，標本采集影響因素及重要性認識模糊，尤其在新開展本實驗的單位，這一現(xiàn)象更為嚴重。不合格標本導(dǎo)致不準確的實驗結(jié)果，影響對本次妊娠的科學(xué)評估，失去對下次妊娠的前瞻性指導(dǎo)，甚至因標本不合格引起投訴。FOCUS-PDCA 程序是20世紀90年代由美國醫(yī)院組織推行的一項質(zhì)量持續(xù)改進模式，按照F-發(fā)現(xiàn)、O-組織、C-澄清、U-理解、S-選擇、P-計劃、D-實施、C-檢查、A-處理共9 個要素循環(huán)往復(fù)，順序?qū)嵤?］，使護理質(zhì)量呈螺旋形上升趨勢，是一種前瞻 性 質(zhì) 量 管 理 行 為［5］。本 科 室 于2017年6月 將FOCUS-PDCA 模式引入MLPA 技術(shù)中絨毛染色體標本采集過程的質(zhì)量控管理，降低了絨毛染色體標本不合格率，現(xiàn)將方法報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

采用不同病例前-后對照研究。將2016年6月-2017年5月送檢的絨毛染色體標本設(shè)為對照組，共計送檢標本137 份。孕婦年齡19～43 歲，平均（30.9±5.40）歲。疾病病種:自然流產(chǎn)99 例，稽留流產(chǎn)31 例，醫(yī)學(xué)指征引產(chǎn)7 例。2017年6月-2018年5月送檢的絨毛染色體標本設(shè)為觀察組，共計送檢標本92 份。孕婦年齡21～40 歲，均（31.7±4.86）歲。疾病病種:自然流產(chǎn)72 例，肌瘤流產(chǎn)16例，醫(yī)學(xué)指征引產(chǎn)4 例。兩組患者一般資料比較，均P＜0.05，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 F-發(fā)現(xiàn)問題 調(diào)查分析對照組絨毛染色體標本送檢標本不合格率主要情況有:無活性絨毛染色體成分標本18 份，絨毛染色體標本母源污染2 份，外周血采集失誤1 份。

1.2.2 O-組織 2017年6月由病區(qū)護士長牽頭，組成由2 名責(zé)任組長、2 名高級責(zé)任護士組成的絨毛染色體專項質(zhì)量改進小組，小組具體分工:護士長負責(zé)項目策劃、組織實施、數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析、理論匯總等工作；2 名責(zé)任組長負責(zé)宣傳指導(dǎo)、成員培訓(xùn)、制訂標本采集規(guī)范及流程；2 名高級責(zé)任護士負責(zé)采集標本、過程質(zhì)控、反饋采集過程中發(fā)現(xiàn)的問題。

1.2.3 C-澄清 按照絨毛染色體標本送檢標本不合格頻次進行排序:①無活性絨毛染色體成分，無法提取DNA 組織:包括取材送檢時機及范圍錯誤11 份，取材量錯誤2 份，保存液錯誤2 份，保存及運送溫度不合適2 份，識別錯誤1 份。②絨毛染色體標本母源污染2 份。③外周血采集失誤1 份。

1.2.4 U-理解

1.2.4.1 取材無活性流產(chǎn)絨毛染色體標本原因分析 ①護士對流產(chǎn)絨毛送檢時機不明確，導(dǎo)致標本滯留時間延長；護士對流產(chǎn)組織、引產(chǎn)組織標本取材范圍不熟悉，導(dǎo)致錯誤采集各階段標本；②絨毛送檢量過少，無法判斷絨毛性質(zhì)；③錯誤使用10%甲醛或95%酒精保存標本，導(dǎo)致絨毛細胞變性或死亡，達不到染色體核型分析要求或標本變質(zhì)；④標本取材后未及時存放冰箱或運送不當，導(dǎo)致保存溫度過高；或?qū)吮敬娣疟淅鋬鍪?，保存溫度過低導(dǎo)致標本變性；⑤絨毛識別及采集技巧缺乏，送檢蛻膜組織。

1.2.4.2 絨毛染色體標本母源污染原因分析 取材時未嚴格清潔絨毛標本，標本內(nèi)混入大量血液或血凝塊，導(dǎo)致保存過程細菌滋生污染標本；使用塑料袋、泡沫盒或病理標本袋等軟質(zhì)容器盛放標本，導(dǎo)致標本在轉(zhuǎn)運途中破損或裂開，保存液泄露，發(fā)生標本在保存或轉(zhuǎn)運過程中的再次污染。

1.2.4.3 外周血采集失誤原因分析 錯誤使用抗凝類型試管采集血標本導(dǎo)致檢測失敗。

1.2.5 S-選擇 研究小組成員通過查閱文獻、對實驗室檢測知識學(xué)習(xí)、咨詢專家等方式了解絨毛標本采集規(guī)范及檢測要求，對以上多種方式獲取的信息進行整理后規(guī)范標本正確的采集方法。

1.2.5.1 正確采集活性絨毛染色體成分 ①取材時機及取材范圍:絨毛染色體檢查適用于孕8～11周左右妊娠［6］，包括人流組織（計劃外懷孕）及流產(chǎn)組織（胚胎停止發(fā)育、早期自然流產(chǎn)、不全流產(chǎn)、反復(fù)流產(chǎn)、稽留流產(chǎn)、難免流產(chǎn)、完全流產(chǎn)等），此階段絨毛發(fā)育旺盛，取絨毛進行染色體檢測具有較高的價值。妊娠11 周后絨毛退變增多，此期取絨毛檢測，其染色體形態(tài)不佳或核分裂相減少，通過絨毛進行染色體核型分析難度增加。但妊娠11 周后胎兒生長發(fā)育迅速，此階段適合采集胎兒部分進行染色體檢查［7］。引產(chǎn)組織（胎兒畸形、發(fā)育異常）、死胎、胎兒發(fā)育異常等晚期流產(chǎn)或引產(chǎn)的胎兒適合此種檢查方法。此階段可選擇胎兒前胸、腹部、后背及大腿部位取材，剪取相應(yīng)部位皮膚組織2.5cm×2.5cm，深度達脂肪層，或取指、趾任1 根。注意各期之間的取材并無絕對的界限，可根據(jù)各實驗室實驗方法及條件確定取材范圍。②絨毛染色體取材量:判斷明確的絨毛組織取花生米大小即可。部分特殊情況下絨毛取材量:對于無法識別的絨毛及蛻膜標本，可收集所有完整標本，包括全部妊娠囊等妊娠組織物，送實驗室進行分離取材；對于流產(chǎn)物同時有絨毛和胚胎組織或懷疑絨毛及胚胎組織滯留時間較長，可將兩者存放在同一標本容器內(nèi)同時送檢；發(fā)臭、稽留時間超過4 周、清宮時間較晚等情況下采集的標本，絨毛細胞發(fā)生變性或壞死機會大，標本組織DNA 降解，檢驗時多數(shù)無活性絨毛染色體成分，無法提取組織DNA 檢測，可與家屬溝通后選擇放棄檢測。③正確使用絨毛染色體標本保存液:采用0.9%無菌氯化鈉溶液清潔、保存標本，液量以能完全淹沒標本為準；后期可能應(yīng)用其他檢測方法復(fù)檢的標本，切勿使用甲醛、福爾馬林或乙醇等化學(xué)藥劑浸泡標本。④絨毛染色體標本保存溫度:MLPA 檢測方法是利用有活力的細胞，離體時間越長則組織細胞新鮮程度越低，甚至導(dǎo)致細胞死亡，影響結(jié)果的準確性［8］。采集標本后應(yīng)立即送檢，未及時送檢的絨毛染色體標本與夫婦雙方血液標本一起存放于4～8 度冰箱內(nèi)，不具備冰箱保存條件者可放入冷藏箱或冰盒內(nèi)，保持標本與冰塊不直接接觸。⑤取材技巧:患者排胎后及時將排出在清潔容器內(nèi)的妊娠組織物取出，浸泡于0.9%無菌氯化鈉溶液中反復(fù)多次漂洗，除去肉眼可見血塊［9］；選擇組織中呈白色或乳白色絮狀漂浮、成團狀密集生長、新鮮短胖且末端粗鈍，似仙人掌或鹿角狀的絨毛，盡量避免挑選細長、分枝少的絨毛染色體，甚至錯誤選擇蛻膜送檢。

1.2.5.2 避免絨毛標本污染 ①標本采用15mL無菌離心管留放，也可以選擇絨毛專用瓶、氯化鈉溶液玻瓶等固體、硬質(zhì)無菌或清潔容器；②標本運輸途中盡量保持標本瓶身直立、平穩(wěn)，避免搖晃，顛簸致保存液傾倒、泄漏；③不使用物流系統(tǒng)進行染色體標本傳輸，避免標本在傳輸桶內(nèi)顛倒、震蕩使盒蓋與瓶身分離。

1.2.5.3 規(guī)范父母雙方血樣采集 ①排胎后盡快采集父母雙方外周血標本各2～3mL［10］，使用乙二胺四乙酸（ethylenedia-minetetraacetic acid，EDTA）抗凝管收集血液標本；②服用大麻、冰毒者，停藥2周后方可進行血標本采集；③使用化療藥物者，停藥3 個月后方可進行血標本采集。

1.2.6 P-階段 制訂計劃，針對以上3 類問題制訂改進措施，規(guī)范絨毛標本采集規(guī)范；實施教育培訓(xùn)，提升護士對絨毛染色體標本采集的重視程度；不定期考核護士標本采集目的、意義及方法，確保護士熟練掌握絨毛染色體標本采集知識及技巧；加強監(jiān)督質(zhì)控護士采集標本流程，及時發(fā)現(xiàn)采集過程中存在的問題；制訂絨毛染色體退單零失誤目標。

1.2.7 D-實施 對全科護士進行相關(guān)知識培訓(xùn)，尤其是新入職及低年資護士做好培訓(xùn)計劃；實施過程質(zhì)控，由專項小組人員負責(zé)指導(dǎo)和參與采集過程的質(zhì)控；完善絨毛染色體標本采集制度及流程。

1.2.8 C-檢查 定期考核護士絨毛染色體標本采集知識；護士長及組長督查護士標本采集程序；每月對科室送檢標本進行分析，對存在問題組織討論和總結(jié)，制訂改進方案；對目標達成情況進行評價和分析，重點關(guān)注流程執(zhí)行效果，及時修訂完善標本采集方法；實施FOCUS-PDCA 程序前后對比護士絨毛染色體標本采集合格率情況。

1.2.9 A-執(zhí)行階段 將絨毛染色體標本采集規(guī)范和流程整理成折頁供護士隨時翻閱學(xué)習(xí)，將絨毛染色體標本項目納入科室定期培訓(xùn)計劃，對現(xiàn)存問題進行討論分析，采用微信或PPT 進行全科室護士分享；對于本階段送檢標本仍存在的無活性絨毛成分問題進入下一個FOCUS-PDCA 循環(huán)。

1.3 評價指標

送檢標本標準參照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》［11］、《臨床檢驗質(zhì)量控制技術(shù)》［12］規(guī)定。標本采集、標本轉(zhuǎn)運、標本接收、不合格標本的處理、室內(nèi)的存放、穩(wěn)定性及前處理等［11］滿足以上要求的標本為合格；沒有滿足某個規(guī)定要求（包括1 個或多個質(zhì)量特性或質(zhì)量體系要素偏離了規(guī)定要求）的標本為不合格［12］。標本不合格率=不合格標本（送檢標本無絨毛成分+標本污染+使用錯誤的采血管）總例數(shù)/送檢標本總例數(shù)×100.00%。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS20.0 統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學(xué)分析。定性資料描述采用頻數(shù)、百分比描述，組間比較采用χ2檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

實施FOCUS-PDCA 程序前后兩組絨毛染色體標本不合格率比較見表1。由表1可見，實施FOCUSPDCA 程序前后標本不合格率比較，P＜0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，觀察組不合格率明顯低于對照組。

表1 實施FOCUS-PDCA 程序前后兩組絨毛染色體標本不合格率比較 n/%

3 討論

3.1 絨毛染色體標本采集的意義

早期自然流產(chǎn)胚胎約95%為染色體數(shù)目異常，以非整倍體染色體異常為主要形式，MLPA 技術(shù)是針對該異常的主要檢測手段，其具有重要的臨床意義。①風(fēng)險評估:絨毛染色體檢查結(jié)果提示數(shù)目異常者，再次妊娠時胎兒染色體異常風(fēng)險度增高，可指導(dǎo)這部分婦女再次懷孕前應(yīng)做好產(chǎn)前咨詢；指導(dǎo)人工輔助生殖技術(shù)受孕染色體異常孕婦進行植入前胚胎染色體檢查，避免再次植入異常受精卵。②發(fā)現(xiàn)高危因素:絨毛染色體檢查核型正常的自然流產(chǎn)患者，流產(chǎn)原因多為環(huán)境中化學(xué)、物理因素及母體疾患所致［13］，可詳細了解其生活習(xí)慣及環(huán)境，發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致染色體異常的高危因素，協(xié)助其建立健康生活習(xí)慣，減少或避免出生缺陷。

3.2 FOCUS-PDCA 程序降低絨毛染色體標本采集不合格率

研究報道［14］，因細菌及真菌感染、母血污染、培養(yǎng)失敗等原因?qū)е陆q毛染色體檢測不能得出可靠結(jié)果的標本占10%～40% 。絨毛標本有明顯母血污染時可導(dǎo)致檢測結(jié)果呈假陽性或假陰性［15］，而為了再次驗證結(jié)果的準確性，對存在母血污染的標本需要在后期運用多種方法進行檢測與驗證［16］，導(dǎo)致患者費用升高，延長患者等待周期，引起患者焦慮甚至投訴。不合格的標本無法為臨床醫(yī)生提供真實、可靠的檢測結(jié)果，影響醫(yī)生對患者的診斷、治療、病情評估及預(yù)后判斷。運用質(zhì)量持續(xù)改進方法規(guī)范絨毛染色體標本采集、保存、轉(zhuǎn)運、交接各環(huán)節(jié)，落實檢驗分析前標本質(zhì)量控制，是減少不合格標本的必要手段［17］。本研究在絨毛染色體標本采集過程中引入FOCUS-PDCA 程序進行質(zhì)量管理，標本送檢不合格率由15.33%下降至5.43%。FOCUS-PDCA 程序注重過程管理及環(huán)節(jié)質(zhì)控，適用于各項管理工作及管理工作各環(huán)節(jié)［18］。該程序運用于絨毛染色體采集過程質(zhì)控，引導(dǎo)護理人員將存在的問題進行分類匯總，利于深入發(fā)現(xiàn)各類問題的根本原因，并有針對性地進行絨毛染色體采集各細節(jié)的持續(xù)改進和流程標準化。該程序由FOCUS 與PDCA 兩部分組成，F(xiàn)OCUS 側(cè)重于梳理并發(fā)現(xiàn)潛在護理問題，明確既往流程失誤節(jié)點，明確改進目標。本研究通過FOCUS 程序發(fā)現(xiàn)絨毛染色體標本不合格主要原因為取材無活性絨毛成分，絨毛染色體標本母源污染，外周血采集失誤。PDCA 環(huán)節(jié)針對失誤的流程進行護士相關(guān)知識培訓(xùn)、完善改進絨毛染色體標本采集流程及規(guī)范，取得較好的成效。PDCA 循環(huán)是一種科學(xué)化、標準化的全面質(zhì)量管理方法，是一個周而復(fù)始的質(zhì)量管理循環(huán)過程［19］。本結(jié)果顯示，實施FOCUS-PDCA程序前后標本不合格率比較，P<0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，觀察組不合格率明顯低于對照組。

4 結(jié)論

MLPA 技術(shù)為臨床提供精確的遺傳咨詢信息，在預(yù)防畸形兒出生方面具有積極意義，而規(guī)范采集絨毛標本是保證染色體檢測呈現(xiàn)正確結(jié)果的首要條件。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OCUS-PDCA 程序可以規(guī)范絨毛染色體標本采集流程，防范標本采集環(huán)節(jié)及流程失誤，前瞻性地做好標本質(zhì)量管理，降低絨毛染色體標本采集不合格率。