謝文泵　莊文捷　黃璇葉

【摘要】 目的：探討微波輻照對(duì)人牙周膜細(xì)胞增殖的影響。方法：運(yùn)用微波理療儀（輸出功率調(diào)節(jié)為14 W）以連續(xù)波、垂直極化照射方式對(duì)人牙周膜細(xì)胞行微波輻射（頻率2 450 MHz），24、48 h后MTS法檢測(cè)人牙周膜細(xì)胞（hPDLCs）增殖效應(yīng)。結(jié)果：微波輻照對(duì)健康hPDLCs增殖效應(yīng)影響，微波照射24、48 h后，照射40 s組，實(shí)驗(yàn)組中吸光度值（OD值）低于對(duì)照組（P<0.01）;微波輻照對(duì)炎癥hPDLCs增殖效應(yīng)影響，微波照射24、48 h后，照射10、20、40 s組，實(shí)驗(yàn)組中吸光度值（OD值）都低于對(duì)照組（P<0.01）。結(jié)論：長(zhǎng)時(shí)間（40 s）低功率微波輻照健康人牙周膜細(xì)胞能明顯抑制正常牙周膜增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。低功率微波照射10、20、40 s對(duì)炎性的人牙周膜細(xì)胞的增殖均具有明顯抑制作用，隨著微波輻射強(qiáng)度的增高對(duì)其增殖抑制率也愈大，呈現(xiàn)明顯的劑量依賴(lài)性。低功率微波照射時(shí)間為10～20 s時(shí)能抑制炎癥人牙周膜細(xì)胞過(guò)度增殖，又不影響人健康牙周膜細(xì)胞的增殖。

【關(guān)鍵詞】 低功率微波; 牙周膜細(xì)胞; 內(nèi)毒素脂多糖; 細(xì)胞活力測(cè)定; 增殖效應(yīng)

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2019.08.080 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 B 文章編號(hào) 1674-6805（2019）08-0-03

Effects of Low Power Microwave on Proliferation of Human Normal and Lipopolysaccharide Induced Periodontal Ligament Cells/XIE Wenbeng，ZHUANG Wenjie，HUANG Xuanye.//Chinese and Foreign Medical Research，2019，17（8）：-167

【Abstract】 Objective：To investigate the effect of microwave irradiation on the proliferation of human periodontal ligament cells.Method：Human periodontal ligament cells were exposed to microwave radiation（frequency 2 450 MHz） with microwave physiotherapeutic apparatus（output power adjusted to 14 W） under continuous wave and vertical polarization.The proliferation of （hPDLCs） in human periodontal ligament cells was detected by MTS method after 24 h or 48 h.

Result：The effects of microwave irradiation on the proliferation of healthy hPDLCs were observed.The absorbance（OD） value of the experimental group for 40 s was lower than that of the control group（P<0.01） after 24 h and 48 h of microwave irradiation.The effects of microwave irradiation on the proliferation of inflammatory hPDLCs were observed.The value of absorbance（OD） in experimental group for 10 s，20 s，40 s were lower than those in the control group（P<0.01）.

Conclusion：Human periodontal ligament cells irradiated by low power microwave for a long time（40 s） can significantly inhibit the proliferation of normal periodontal ligament and promote the apoptosis of human periodontal ligament.Low power microwave irradiation for 10 s，20 s，40 s can significantly inhibit the proliferation of inflammatory human periodontal ligament cells.With the increase of microwave radiation intensity，the inhibition rate of the proliferation of periodontal ligament cells is increased in a dose-dependent manner.Low power microwave irradiation for 10-20 s can inhibit the excessive proliferation of inflammatory human periodontal ligament cells without affecting the proliferation of healthy human periodontal ligament cells.

【Key words】 Low-power microwave; Periodontal ligament cells; Lipoplysaccharide; Cell viability assay; Proliferation effect

First-authors address：Peoples Hospital Affiliated to Quanzhou Medical College，Quanzhou 362000，China

牙周病是由多種致病微生物所致的慢性、間歇性非特異性感染性疾病，臨床上對(duì)牙周病尚無(wú)完善的、特效的治療方案。人牙周膜細(xì)胞（human periodontal ligament cells，hPDLCs）是牙周組織中的主要細(xì)胞成分，不僅合成、分泌牙周膜基質(zhì)中膠原纖維和蛋白多糖，還有降解膠原的能力。它是一類(lèi)具有異質(zhì)性及分化潛能的細(xì)胞，主要細(xì)胞成分包括成纖維細(xì)胞、未分化的間充質(zhì)細(xì)胞及前體細(xì)胞。許多研究都證實(shí)在病理狀態(tài)或受到外界刺激下，細(xì)胞可被激活，增殖分化，可分化為成骨細(xì)胞和成牙骨質(zhì)細(xì)胞，促進(jìn)牙周組織的再生和修復(fù)[1-2]。研究表明細(xì)胞內(nèi)毒素脂多糖（1ipopolysacchaddes，IJPS）可抑制hPDLCs的增殖，促使牙周膜細(xì)胞大量分泌TNF-α、IL-6、IL-8等炎癥因子，是導(dǎo)致牙周炎發(fā)病的主要致病因素[3-4]。目前，利用人牙周膜細(xì)胞建立體外模型[5-6]，已成為研究牙周膜組織疾病的重要手段。

近年來(lái)，微波技術(shù)在醫(yī)學(xué)臨床上應(yīng)用日趨廣泛，有學(xué)者利用微波局部治療牙周炎和邊緣性齦炎，取得一定療效[7-8]。低功率微波能改善局部血液循環(huán)，增強(qiáng)代謝過(guò)程，加強(qiáng)局部組織營(yíng)養(yǎng)，并且它具有較強(qiáng)的抑菌作用，滲入深度大，能抑制或殺滅患部的細(xì)菌。將微波能量集中照射病變部位，被人體組織吸收后，產(chǎn)生微波熱效應(yīng)、生物效應(yīng)等，使局部組織溫度升高，動(dòng)靜脈顯著擴(kuò)張，血流速度和血循環(huán)量明顯增加，活血化瘀，促進(jìn)血液循環(huán)，增加細(xì)胞膜通透性，使局部代謝及營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)得以良好改善，提高組織再生能力，促進(jìn)局部炎癥消退[9]。本研究通過(guò)檢測(cè)hPDLCs受到低功率微波刺激后MTS法檢測(cè)hPDLCs增殖效應(yīng)表達(dá)，探索低功率微波對(duì)人正常及脂多糖誘導(dǎo)的牙周膜細(xì)胞增殖的影響，為微波治療牙周炎提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要器材和試劑

低糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）胰蛋白酶（GIBCO，USA），青-鏈霉素混合液（Hyclone，美國(guó)），MTS（Promega，美國(guó)），二甲基亞砜（DMSO）、脂多糖（sigma，USA），微波治療儀（新技術(shù)研究所，南京），酶聯(lián)免疫檢測(cè)（Biotek POWERWAVE，美國(guó)），倒置相差顯微鏡及攝像系統(tǒng)（NikonTS-100，日本）。

1.2 標(biāo)本取材及原代培養(yǎng)

征求患者及家長(zhǎng)同意，取12～17歲因正畸治療而拔除的健康前磨牙10例。術(shù)前患者用3%過(guò)氧化氫漱口，75%的酒精消毒口內(nèi)及口周，拔牙過(guò)程中避免損傷牙周組織，拔牙后立即置于含雙抗（青霉素100 U/ml，鏈霉素100 μg/ml）的無(wú)菌PBS液中，在超凈臺(tái)內(nèi)，用含雙抗的PBS液反復(fù)沖洗牙根面，除去血污，用手術(shù)刀片刮取根中1/3牙門(mén)周膜組織，在DMEM培養(yǎng)液浸潤(rùn)條件下用眼科剪將牙周組織剪成1 mm3大小的組織塊。取6孔板，在每孔中央滴加少量含200 ml/L的胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，用牙科鑷子將組織塊放入6孔板中的培養(yǎng)液中，每孔含5～6小組織塊。將高壓滅菌蓋玻片緩緩覆蓋于組織塊上，輕輕加壓，使培養(yǎng)液充盈于蓋玻片與組織塊之間，避免產(chǎn)生氣泡，加體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液3 ml，置5%CO2，100%濕度的37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每3天換液1次。第2天鏡下觀察組織塊有無(wú)細(xì)菌污染，細(xì)胞培養(yǎng)板要輕拿輕放，前3天盡量避免過(guò)多晃動(dòng)培養(yǎng)板，此后在倒置顯微鏡下逐日觀察細(xì)胞游出情況、形態(tài)特征及生長(zhǎng)狀況。

待組織塊周?chē)?xì)胞生長(zhǎng)密集后，需要進(jìn)行原孔消化。棄舊培養(yǎng)液用PBS緩沖液輕輕漂洗2遍，無(wú)菌鑷子小心取出蓋玻片，滴加少量2.5 g/L的胰蛋白酶，使其剛好鋪滿板底。鏡下觀察細(xì)胞消化情況，當(dāng)細(xì)胞質(zhì)回縮變圓，細(xì)胞間隙變大時(shí)，棄胰酶，加體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液3 min，終止消化。輕輕吹打，使細(xì)胞均勻分布于孔板內(nèi)，換培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞傳代培養(yǎng)

原孔消化后，待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)孔板底部表面積80%～90%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.4 微波照射方法及分組

將第4代hPDLCs分為兩大組，其中健康牙周膜細(xì)胞組正常接種，而炎癥牙周膜細(xì)胞組加入含10 μg/ml的LPS的培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)。分別按2×104個(gè)/ml的細(xì)胞密度接種于96孔板，每板分空白組、對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，空白組為不含細(xì)胞的DMEM培養(yǎng)液，其余兩組接種細(xì)胞，每組重復(fù)3孔，每孔接種100 μl，微波治療儀輸出模式為治療模式，輸出功率調(diào)節(jié)為14 W，實(shí)驗(yàn)組照射時(shí)間分別為10、20、40 s。對(duì)照組不進(jìn)行激光照射，其余條件同實(shí)驗(yàn)組，微波照射通過(guò)96孔板板蓋照射，室溫為24 ℃。

照射后放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.5 MTS法檢測(cè)hPDLCs增殖效應(yīng)

MTS是一種用比色法來(lái)檢測(cè)細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)中的活細(xì)胞數(shù)量的檢測(cè)試劑。微波照射24、48 h后，分別取出相應(yīng)孔板，每孔加MTS 20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)，在酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔細(xì)胞吸光度值（OD值）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以（x±s）表示，組間比較用單因素方差分析，兩組間差異用成組t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)=0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 微波輻照對(duì)健康hPDLCs增殖效應(yīng)影響

微波照射24 h后，實(shí)驗(yàn)組中輻照10 s和20 s同對(duì)照組相比，OD值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），而照射40 s組，其OD值明顯低于對(duì)照組;照射48 h后，實(shí)驗(yàn)組中40 s的OD值亦低于對(duì)照組，二者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見(jiàn)表1。

2.2 微波輻照對(duì)炎癥hPDLCs增殖效應(yīng)影響

微波照射24 h后，實(shí)驗(yàn)組同對(duì)照組相比，OD值顯著低于對(duì)照組（P<0.05），呈劑量依賴(lài)性;照射48 h后，實(shí)驗(yàn)組OD值低于對(duì)照組，二者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;但不同時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組兩者間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)表2。

3 討論

微波治療是將微波能量集中照射作用部位，被人體組織吸收后產(chǎn)生熱效應(yīng)、生物效應(yīng)等。微波的熱效應(yīng)能夠達(dá)到殺菌作用且隨著功率的增大而殺菌作用增強(qiáng)，但對(duì)靶器官和鄰近組織、細(xì)胞損傷的可能性也隨之增大。選擇適宜功率的微波照射使其熱效應(yīng)不足以破壞正常的細(xì)胞，又能通過(guò)其生物效應(yīng)作用于靶組織使其達(dá)到調(diào)節(jié)功能，促進(jìn)組織功能恢復(fù)的作用是研究的最終目的。本研究選擇低功率14 W的微波輻照健康人牙周膜細(xì)胞10、20 s，對(duì)正常牙周膜細(xì)胞增殖沒(méi)有影響，而輻照時(shí)間延長(zhǎng)為40 s時(shí)就能明顯抑制正常牙周膜增殖，這種抑制作用一直延續(xù)到48 h仍然存在，提示臨床使用微波必須選擇好功率和時(shí)間，以免過(guò)強(qiáng)的熱效應(yīng)損傷正常組織細(xì)胞;細(xì)菌產(chǎn)生的脂多糖LPS是牙周炎的誘發(fā)因素之一[10-12]。本研究根據(jù)Jung等[13-14]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇10 μg/ml LPS誘導(dǎo)人正常牙周膜細(xì)胞模擬炎癥狀態(tài)下的牙周膜細(xì)胞，結(jié)果顯示14 W微波照射10、20、40 s對(duì)炎性的人牙周膜細(xì)胞的增殖均具有明顯抑制作用，隨著微波輻射強(qiáng)度的增高對(duì)其增殖抑制率也愈大，呈現(xiàn)明顯的劑量依賴(lài)性。早在20世紀(jì)70年代web等[15]對(duì)人正常細(xì)胞和癌細(xì)胞的微波頻譜進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，正常細(xì)胞和癌細(xì)胞的吸收頻譜有差異，微波能通過(guò)熱效應(yīng)和非熱效應(yīng)選擇性地殺傷腫瘤細(xì)胞，引起細(xì)胞形態(tài)學(xué)和功能學(xué)改變，導(dǎo)致細(xì)胞壞死或者誘導(dǎo)凋亡。因此筆者設(shè)想健康的牙周膜細(xì)胞和炎癥狀態(tài)的牙周膜細(xì)胞對(duì)微波的吸收頻譜也是有差異的。

總之，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出臨床上選擇14 W低功率微波照射時(shí)間為10～20 s時(shí)能抑制炎癥人牙周膜細(xì)胞過(guò)度增殖，又不影響人健康牙周膜細(xì)胞的增殖。

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