張榮躍　李文鳳　黃應(yīng)昆　王曉燕　單紅麗　李婕　倉曉燕　羅志明　尹炯

摘要：研究旨在明確2018年在云南西盟蔗區(qū)發(fā)現(xiàn)的甘蔗病害是否為植原體引起的甘蔗白葉病。使用植原體16S rRNA基因序列通用引物Pl/P7和R16F2n/R16R2對10份采自云南西盟蔗區(qū)的疑似甘蔗白葉病樣品進行巢氏PCR檢測，并將巢氏PCR產(chǎn)物進行克隆測序和序列分析。巢氏PCR結(jié)果表明：所有10份樣品均能擴增得到1240 bp左右的片段。測序結(jié)果表明所有獲得的10條16S rRNA基因序列大小均為1247 bp，序列間的核苷酸一致性為100%。BLASTN分析表明，從病株擴增到的所有核苷酸序列與先前云南臨滄甘蔗白葉病植原體分離物L(fēng)C7和LC9的16S rRNA基因序列（Genbank登陸號：KR020691和KR020692）的核苷酸序列一致性為100%。虛擬RFLP分析表明，西盟分離物的16S rRNA基因序列的酶切圖譜與16SrXI-B亞組植原體相同。本研究結(jié)果表明，云南西盟蔗區(qū)發(fā)現(xiàn)的甘蔗病害為16SrXI-B亞組植原體引起的甘蔗白葉病。

關(guān)鍵詞：云南;西盟;檢疫性病害;植原體;甘蔗白葉病;16SrXI-B亞組

中圖分類號：S435.661

文獻標(biāo)志碼：A

論文編號：cjas18120017

0引言

甘蔗白葉?。⊿ugarcane White Leaf， SCWL）是由植原體引起的甘蔗毀滅性病害，該病于1954年首次在泰國發(fā)現(xiàn)[1]，現(xiàn)己廣泛發(fā)生于越南、緬甸、菲律賓、巴基斯坦、印度、斯里蘭卡等植蔗國家，給當(dāng)?shù)馗收岷椭铺钱a(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[2-8]。中國臺灣于1962年報道了該病的發(fā)生[9]，2013年Li等[10]首次在云南保山蔗區(qū)采集的甘蔗樣品上檢測發(fā)現(xiàn)SCWL植原體。SCWL主要癥狀表現(xiàn)為葉片白化、分蘗增多和矮化[11]。SCWL植原體主要通過帶病蔗種進行遠距離傳播，且傳播性極強，此外，在田間SCWL植原體還可通過葉蟬自然傳播[4，12-13]。先前的病原多樣性研究表明16SrXI-B亞組和16SrXI-D亞組植原體均可引起SCWL[14-15]。

目前，SCWL只在云南保山蔗區(qū)和臨滄蔗區(qū)發(fā)現(xiàn)[5-17]。2018年6月，筆者在對云南西盟蔗區(qū)甘蔗病蟲害進行調(diào)查時，發(fā)現(xiàn)疑似SCWL癥狀的植株。為明確病原，筆者采集了10份疑似SCWL病樣，采用植原體16S rRNA基因序列通用引物對Pl/P7和R16F2n/R16R2對疑似病株進行了檢測鑒定。以期為科學(xué)有效防控SCWL提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1材料與方法

1.1疑似SCWL樣品

2018年6月從云南西盟蔗區(qū)采集的10份疑似SCWL樣品，品種均為‘粵糖93-159。

1.2植物總DNA的提取

每個樣品取病葉0.2 g，采用北京全式金生物技術(shù)公司的Easy Pure plant Genomic DNA Kit植物DNA提取試劑盒提取葉片總DNA，具體方法步驟按照說明書進行。

1.3巢式PCR檢測

使用植原體16S rRNA基因序列通用引物對Pl/P7[18]和Rl6F2n/Rl6R2[14]進行巢氏PCR擴增。以Pl/P7為引物進行第一次PCR擴增，25 uL反應(yīng)體系為含有l(wèi)OxPCR Buffer 2.5 uL、引物Pl/P7（20 umol/L）各l uL、MgCl2 （25 mmol/L）2 uL、dNTPs （10 mmol/L） 2.0 uL、Taq酶（5 U/uL） 0.2 uL、ddH20 15.3 uL、DNA模板1.0 uL。PCR反應(yīng)條件為：940C預(yù)變性3 min; 94℃變性30 s，55CC退火30 s，72℃延伸l min，35個循環(huán);最后72℃延伸10 min。取l uL第一次PCR擴增產(chǎn)物（稀釋30倍）作為模板，R16F2n/R16R2為引物進行第二次PCR擴增，反應(yīng)體系與第一次PCR相同，擴增程序為：940C預(yù)變性3 min; 94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸l min，35個循環(huán);最后72C延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4 PCR產(chǎn)物克隆、測序及序列分析

利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒（北京天根生化科技有限公司）回收目的片段，并將其與pEASY-T5（北京全式金生物技術(shù)有限公司）進行連接轉(zhuǎn)化，每個轉(zhuǎn)化挑選6個陽性克隆送華大基因測序。測序結(jié)果使用BLASTN進行對比。使用DNAMAN v6.0進行序列一致性分析。

1.5 16S rRNA基因序列的虛擬RFLP分析

使用在線植原體分類工具iPhyClassifier（http：//plantpathology. Ba. Ars. usda. gov/cgibin/ resource/iphyclassifier.cgi）對西盟SCWL植原體的16S rRNA基因序列進行虛擬RFLP分析和相似性系數(shù)分析[19]。

2結(jié)果與分析

2.1巢式PCR檢測及序列分析

使用植原體16S rRNA基因序列通用引物對Pl/P7和R16F2n/R16R2的巢氏PCR擴增結(jié)果表明10份疑似SCWL樣品和陽性對照均檢測到約1.2 kb左右的條帶，與預(yù)期目標(biāo)片段大小一致（圖1）。將目標(biāo)片段回收、克隆和測序，測序結(jié)果表明，所有樣品擴增出的特異性片段大小均為1247 bp，序列間的核苷酸一致性為100%。BLASTN分析結(jié)果表明，所有10條序列（Genbank登陸號：MK028610-MK028619）與先前云南臨滄SCWL植原體分離物L(fēng)C7和LC9的16S rRNA基因序列（Genbank登陸號：KR020691和KR020692）的核苷酸序列一致性為100%。

2.2 16S rRNA基因序列的虛擬RFLP分析

利用植原體分類鑒定在線工具iPhyClassifier對本研究獲得的16S rRNA基因序列進行虛擬RFLP分析，結(jié)果表明，本研究獲得的16S rRNA基因序列的虛擬RFLP酶切圖譜與16SrXI-B亞組植原體的虛擬RFLP酶切圖譜相同（圖2），圖譜的相似系數(shù)為1.00。

3結(jié)論與討論

本研究對云南西盟蔗區(qū)采集的10份疑似SCWL甘蔗樣品進行巢式PCR檢測及測序分析，BLASTN結(jié)果表明本研究擴增獲得的序列為SCWL植原體16SrRNA基因序列，虛擬RFLP分析表明本研究獲得的SCWL植原體分離物為16SrXI-B亞組植原體，因此，本次云南西盟蔗區(qū)發(fā)現(xiàn)的甘蔗病害可以確診為16SrXI-B亞組植原體引起的SCWL。西盟蔗區(qū)也成為繼云南保山蔗區(qū)和臨滄蔗區(qū)外又一個發(fā)現(xiàn)SCWL的蔗區(qū)。本研究結(jié)果可為云南今后開展SCWL的深入研究和科學(xué)有效防控奠定基礎(chǔ)和提供參考依據(jù)。

SCWL是一種及其危險的甘蔗病害，可對甘蔗造成毀滅性災(zāi)害。Li等[20]2013年在云南保山蔗區(qū)首次發(fā)現(xiàn)SCWL后，SCWL在云南蔗區(qū)擴展蔓延十分迅速，給云南蔗糖產(chǎn)業(yè)發(fā)展帶來了嚴重災(zāi)害威脅。如得不到有效防控，可能還會給廣西、廣東等蔗區(qū)帶來潛在的威脅。因此，對于SCWL必須給予高度的重視，并采取有效防控措施阻止其擴展蔓延，確保云南甘蔗安全生產(chǎn)和蔗糖產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。由于SCWL主要通過帶病蔗種進行遠距離傳播，建議加強對甘蔗良繁基地擴繁種苗和引進及外調(diào)甘蔗品種的SCWL的檢疫和監(jiān)測，嚴禁從發(fā)生SCWL的蔗區(qū)和田塊引種和留種，同時，要加強對SCWL發(fā)病區(qū)域的檢查，及時清除銷毀病株，從源頭上控制其擴散蔓延。另外，下一步需要深入研究SCWL的傳播媒介及其傳毒機理，探明甘蔗品種對SCWL的抗性，為SCWL的有效防控提供理論指導(dǎo)和科學(xué)依據(jù)。

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