曾志魯,范慧群,黃克愁,羅舜菁,葉江平,劉成梅,羅舜芬

(1.南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室,江西南昌 330047; 2.贛南師范大學圖書館,江西贛州 341000)

1992年,英國學者Englyst依據淀粉消化速度將淀粉分為快消化淀粉(RDS)、慢消化淀粉(SDS)和抗性淀粉(RS)[1];其中,將RS定義為在體外模擬消化條件下(pH5.2、37 ℃),在120 min內不能被混合酶系(胰α-淀粉酶、葡萄糖苷酶等)消化的淀粉片斷。由于不能被小腸消化吸收,RS可到達大腸作為人體腸道菌群的碳源,因此,RS對于人體腸道菌群健康具有重要的作用;此外,RS還可降低餐后胰島素分泌,提高機體對胰島素的敏感性[2-4]。

RS作為一種新型的功能性碳水化合物,引起了國內外學者的廣泛興趣。重結晶淀粉是目前制備RS的主流方式,被歸類為RS3[5]。然而,普通淀粉重結晶形成的晶體熱穩(wěn)定性較差,導致RS產量低、熱穩(wěn)定性差。大量研究證明,直鏈淀粉的重結晶能力顯著高于支鏈淀粉[6],且直鏈淀粉結晶的熱穩(wěn)定性顯著高于支鏈淀粉。因此,提高淀粉中直鏈淀粉含量可提高淀粉重結晶能力從而提高RS含量。近年來,多采用脫支酶對淀粉脫支后進行重結晶處理,從而增加RS含量[7]。例如,Demirkesenbicak等[8]采用普魯蘭酶對鷹嘴豆淀粉脫支之后再進行回生處理,與未脫支淀粉相比,其RS含量提高了41.3%。

近年來,脂質等客體分子與淀粉分子絡合形成的復合物是另一種熱門的RS類型[5]。然而脂質的添加會產生大量額外的能量。β-環(huán)糊精(β-CD)是由7個D-吡喃葡萄糖通過α-1,4糖苷鍵聚合而成的環(huán)狀低聚糖。研究發(fā)現,β-CD可與淀粉發(fā)生相互作用形成淀粉-β-CD非包合物[9],從而降低淀粉的消化率[10]。同時,在β-CD對大米淀粉回生的研究中,添加β-CD后大米淀粉的晶體熱穩(wěn)定性顯著提高[11]。據報道,脫支處理可增加淀粉分子和客體分子之間的復合物形成,如淀粉-月桂酸和淀粉-多酚[12-13]?；谏鲜鲅芯拷Y果,本文推斷脫支處理和β-環(huán)糊精可能對降低重結晶淀粉的消化率具有協(xié)同作用。因此,本研究以大米淀粉為原料,比較了重結晶大米淀粉(RRS)、β-環(huán)糊精重結晶大米淀粉(β-CD-RRS)、重結晶脫支大米淀粉(DB-RRS)、β-環(huán)糊精重結晶脫支大米淀粉(DB-β-CD-RRS)的消化性和結構的差異,以期為提高抗性淀粉含量提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大米淀粉 Sigma-Aldrich公司;β-環(huán)糊精 Aladdin Chemistry公司;普魯蘭酶(100 U/g) 諾維信公司;豬胰α-淀粉酶(16 U/mg)、淀粉葡萄糖苷酶(300 U/mL) 美國Sigma公司;GOPOD試劑盒 愛爾蘭Megazyme公司;冰醋酸、醋酸鈉 分析純,Aladdin Chemistry公司;乙醇 分析純,上海振興化工有限公司。

HH-4數顯恒溫水浴鍋 金壇市城西曉陽電子有限公司;電子分析天平 奧豪斯國際貿易有限公司;Labconco FreeZone真空冷凍干燥機 美國LABCONCO公司;PHS-3C精密pH計 上海雷磁儀器廠;T6紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司;X-衍射儀 英國Bede公司Di系統(tǒng);差示掃描量熱儀 日本日立公司;Quanta-200掃描電鏡 美國FEI公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 抗性淀粉樣品的制備

1.2.1.1 重結晶大米淀粉的制備 稱取一定質量的大米淀粉分散在水中得到濃度為10%(w/v)的淀粉懸浮液,將懸浮液在沸水中加熱30 min使淀粉完全糊化,緩慢冷卻至25 ℃并保持2 h,冷凍干燥得到重結晶的大米淀粉,得到的樣品命名為RRS。

1.2.1.2 添加β-CD重結晶大米淀粉的制備 將大米淀粉與β-CD(添加量為大米淀粉質量的4.0%)混合,混合物分散于水中得到濃度為10%(w/v)的懸浮液,將懸浮液在沸水中加熱30 min使淀粉完全糊化,緩慢冷卻至25 ℃并保持2 h,冷凍干燥得到樣品,命名為β-CD-RRS。

1.2.1.3 脫支重結晶大米淀粉的制備 稱取一定質量的大米淀粉分散在pH5.2,0.02 mol/L乙酸鈉緩沖溶液中得到濃度為10%(w/v)的淀粉懸浮液,將懸浮液在沸水中加熱30 min使淀粉完全糊化,將淀粉冷卻至55 ℃,向溶液中加入普魯蘭酶(40 U/g,基于淀粉的干重),反應24 h后,沸水浴30 min使普魯蘭酶失活,緩慢冷卻至25 ℃并保持2 h,冷凍干燥得到樣品,命名為DB-RRS。

1.2.1.4β-環(huán)糊精重結晶脫支大米淀粉的制備 稱取一定質量的大米淀粉分散在pH5.2,0.02 mol/L乙酸鈉緩沖溶液中得到濃度為10%(w/v)的淀粉懸浮液,將懸浮液在沸水中加熱30 min使淀粉完全糊化,將淀粉冷卻至55 ℃,向溶液中加入普魯蘭酶(40 U/g,基于淀粉的干重),反應24 h后,沸水浴加入β-CD(添加量為大米淀粉質量的4.0%),持續(xù)30 min(同時滅酶),然后將混合物緩慢冷卻至25 ℃并保持2 h。最后,冷凍干燥得到樣品,命名為DB-β-CD-RRS。

1.2.2 體外消化性測定 參考Miao等[14]的研究,采用體外模擬消化法測定淀粉的消化性質。將α-淀粉酶(22.5 mg,10 U/mg)溶解在7.5 mL乙酸鈉緩沖液(0.02 mol/L,pH5.5)中,加入0.75 mL淀粉葡萄糖苷酶(300 U/mL),渦旋混勻。將每個樣品(200 mg,干基)加入14 mL乙酸鈉緩沖液(0.02 mol/L,pH5.5)中(未蒸煮/沸水浴蒸煮20 min),然后在37 ℃下平衡10 min,然后再加入1 mLα-淀粉酶和淀粉葡萄糖苷酶的混酶。在消化期間以特定間隔取出溶液(0.5 mL)至無水乙醇(4.0 mL)混合,以使酶失活并以4000×g離心10 min以獲得上清液。用GOPOD在510 nm處測量吸光度,并計算葡萄糖含量,每個樣品測定3次取平均值。

通過測量G20(水解20 min時釋放的葡萄糖)、G120(水解120 min時釋放的葡萄糖)、FG(游離葡萄糖)和TG(總葡萄糖)獲得不同碳水化合物營養(yǎng)組分(快速消化淀粉,RDS;緩慢消化的淀粉,SDS;抗性淀粉,RS)的值。具體計算公式如下:

RDS(%)=(G20-FG)×0.9×100

式(1)

SDS(%)=(G120-G20)×0.9×100

式(2)

RS(%)=(TG-FG)×0.9×100-RDS(%)-SDS(%)

式(3)

式中,G20為淀粉酶水解20 min時產生的葡萄糖含量(mg);FG為淀粉酶水解處理前淀粉中游離葡萄糖含量(mg);G120為淀粉酶水解120 min時產生的葡萄糖含量(mg);TS為樣品中總淀粉含量(mg)。

1.2.3β-環(huán)糊精、脫支對重結晶大米淀粉長程和短程結構的影響 通過X-射線衍射儀器獲得淀粉樣品(未蒸煮)的長程結構,掃描的衍射區(qū)域角度變化范圍為5～40 °,電壓30 kV,電流30 mA,掃描的速度2 °/min。通過衍射圖譜觀察結晶區(qū)與非結晶區(qū)的變化。利用Origin軟件分析并計算重組米淀粉無定形區(qū)域和結晶區(qū)域的面積。根據方程計算淀粉顆粒的相對結晶度[15]:

式(4)

式中,RC,Ac和Aa分別是相對結晶度、結晶區(qū)域面積和無定形區(qū)域面積。

通過傅立葉變換紅外光譜法(ATR-FTIR)分析淀粉的短程結構。制備好樣品之后,放入紅外光譜測定儀(Nicolet 5700)中測量,參數設定如下:掃描整合頻譜32倍,掃描分辨率是4 cm-1,波段范圍4000～650 cm-1。用Omnic軟件對紅外光譜圖進行分析,記錄譜圖中1047和1022 cm-1位置上的峰高,淀粉結晶區(qū)和無定形區(qū)的比值以1047與1022 cm-1的峰高比值代表。

1.2.4 差示掃描量熱法分析(DSC) 準確稱取3 mg樣品(未蒸煮)置于鋁坩堝中,加入6 μL去離子水,密封后,靜置24 h。以空鋁坩堝為參比,將樣品坩堝置于差示掃描量熱儀的樣品池進行分析。分析條件如下:溫度范圍20～140 ℃,升溫速率5 ℃/min。計算起始溫度(To)、峰值溫度(Tp)、終止溫度(Tc)和結晶熔化焓(ΔH)。

1.2.5 掃描電鏡分析 通過電鏡掃描觀察并拍攝樣品顆粒(未蒸煮)樣貌。處理后的樣品用掃描電子顯微鏡在加速電壓為5.00 kV,距離為13.1 mm,在5000放大倍數下進行形貌觀察。

1.3 數據處理

實驗數據采用SPSS 16.0分析處理,采用Origin 8.0繪圖,所有實驗組均一式三份平行測定。

2 結果與分析

2.1 β-環(huán)糊精、脫支對重結晶大米淀粉消化性的影響

圖1為未蒸煮時不同淀粉樣品的消化性。RRS的RDS、SDS和RS含量分別為75.51%、8.04%和16.45%。β-CD-RRS的RDS、SDS和RS含量分別為73.70%、7.27%和19.03%。由此可見,添加β-CD后樣品的RDS含量由75.51%降至73.70%,但差異不顯著。DB-RRS的RDS、SDS和RS含量分別為41.15%、15.02%和43.83%。與RRS樣品相比,DB-RRS的RS含量由16.45%增加到43.83%,且差異顯著(p<0.05),這是由于脫支可增加直鏈淀粉含量,促進淀粉重結晶[16]。DB-β-CD-RRS的RDS、SDS和RS含量分別為35.44%、12.22%、52.34%。添加β-CD后,DB-RRS的RS含量由43.83%升高至52.34%(p<0.05),這表明β-CD亦可降低脫支后重結晶淀粉的消化性。通過比較RRS、β-CD-RRS、DB-RRS和DB-β-CD-RRS的RS含量,發(fā)現與RRS相比,β-CD-RRS的RS含量增加了2.58%,DB-RRS增加了27.38%,DB-β-CD-RRS增加了35.89%,DB-β-CD-RRS的增量(35.89%)大于前兩組樣品增量之和(29.96%),這說明脫支和β-CD可協(xié)同降低淀粉的消化性。

圖1 不同淀粉的RDS、SDS和RS含量(未蒸煮)Fig.1 RDS,SDS,and RS contents of starches(uncooked)注:圖中小寫字母表示同種消化淀粉不同組間 數據差異顯著(p<0.05),圖2同。

圖2為蒸煮后不同淀粉樣品的消化性。蒸煮后,RRS和β-CD-RRS的RS含量分別為1.54%和5.73%,兩者差異顯著(p<0.05)?？梢姦?CD-RRS的RS熱穩(wěn)定性高于RRS,這可能是由于β-CD增加了淀粉體系的粘度從而增加抗性淀粉的熱穩(wěn)定性[17]。此外,DB-β-CD-RRS的RS為20.35%,耐熱RS保留率為38.9%,高于DB-RRS(15.49%)的保留率35.34%(p<0.05),這可能是由于直鏈淀粉-β-CD復合物的形成增加了抗性淀粉的穩(wěn)定性[18]。上述結果表明,β-CD增加了重結晶淀粉中抗性淀粉的熱穩(wěn)定性。

圖2 不同淀粉的RDS、SDS和RS含量(蒸煮)Fig.2 RDS,SDS,and RS contents of starches(cooked)

2.2 β-環(huán)糊精、脫支對重結晶大米淀粉長程和短程結構的影響

圖3展示了各淀粉的X-衍射圖(圖3a)和相對結晶度(圖3c)。X-射線衍射法(XRD)測量的是長程序列,可以測量樣品的晶體組成及晶型。從圖3(a)可以看出,RRS和β-CD-RRS沒有明顯的衍射峰,表明RRS和β-CD-RRS沒有形成結晶,這可能是由于重結晶時間過短且溫度略高而引起的[19]。DB-RRS在2θ為14.3 °、17.0 °、19.6 °、22.0 °和24.1 °處有明顯的衍射峰,表明該樣品具有B型和V型結晶結構,其結晶度為23.6%。據報道,B型和V型結晶是抗性淀粉的典型晶體結構[20]。與DB-RRS相比,DB-β-CD-RRS具有更強的衍射峰,且在5.2 °處出現了一個新的衍射峰,這表明脫支促進了淀粉-β-CD復合物的形成[18]。綜上所述,脫支不僅可加速淀粉的重結晶,還促進淀粉與β-CD形成復合物。因此,脫支和β-CD具有協(xié)同提高抗性淀粉含量的作用。

圖3 不同淀粉的長程結構(a)、短程結構(b)和結構參數(c)Fig.3 Long-range order(a),short-range order(b) and structural parameters(c)of starches注：圖中不同字母表示同一指標間 各組數據差異顯著(p<0.05)。

圖3(b)為淀粉樣品的紅外光譜圖,主要測量分子中短程序列,它反映的是分子內的作用現象。紅外光譜圖中1047和1022 cm-1處吸光度的值表示淀粉中結晶區(qū)和無定形結構的變化,1047與1022 cm-1吸光度的比值表示淀粉中結晶區(qū)與無定形區(qū)的比例,它可以定量的反映顆粒表面淀粉鏈的有序化程度和結晶度。

從圖3(c)中可以得出,DB-β-CD-RRS、DB-RRS、β-CD-RRS、RRS的1047 cm-1/1022 cm-1比值分別為3.05、2.69、1.28、1.25。DB-β-CD-RRS 的1047 cm-1/1022 cm-1比值最大為3.05,其顯著高于DB-RRS(p<0.05),且均高于β-CD-RRS和RRS。β-CD-RRS和RRS沒有顯著性差異(p<0.05)。該結果說明DB-β-CD-RRS和DB-RRS顯示出較高的結晶度,其與XRD分析結果一致。

2.3 差示掃描量熱法分析

實驗發(fā)現,在RRS和β-CD-RRS的DSC曲線中沒有吸熱峰,表明兩者中沒有晶體的形成,這與X-衍射分析結果一致。如表1所示,DB-RRS具有一個吸熱峰,其熔融溫度在84.4～106.0 ℃范圍,這主要是淀粉脫支后重結晶晶體解體峰[21-22]。由此可見,DB-RRS結晶的熱穩(wěn)定較高,這也說明DB-RRS在蒸煮后仍具有較高含量的RS。除淀粉重結晶的吸熱峰外,DB-β-CD-RRS在115.9～125.0 ℃范圍具有吸熱峰,推測這是由于β-CD-淀粉復合物導致的[18]。上述結果表明,DB-β-CD-RRS中抗性淀粉熱穩(wěn)定性高于DB-RRS,與蒸煮實驗結果一致。

表1 淀粉的糊化溫度和熱焓值 Table 1 Gelatinization temperatures and enthalpy of starch

2.4 RRS、β-CD-RRS、DB-RRS和DB-β-CD-RRS的形貌掃描電鏡分析

如圖4所示,RRS呈片狀結構,具有該結構的淀粉表面積較大,因此與淀粉酶的接觸幾率較大,易被酶解,從而含有較低的抗性淀粉。添加β-CD沒有顯著改變重結晶大米淀粉的微觀形貌,β-CD-RRS仍呈片狀結構。然而,DB-RRS呈緊實的球形顆粒結構,為淀粉脫支后重結晶形成的聚集體。與上述片狀結構相比,顆粒聚集體的表面積更小,與淀粉酶接觸的幾率更小。因而,DB-RRS對酶的抗性遠高于RRS和β-CD-RRS。DB-β-CD-RRS具有與DB-RRS相似的結構,且DB-β-CD-RRS的顆粒大于DB-RRS,結構更緊密,這可能是由于淀粉-β-CD復合物的形成,該結果證明脫支處理和β-環(huán)糊精對于提高重結晶淀粉的抗性具有協(xié)同作用。

圖4 RRS、β-CD-RRS、DB-RRS和DB-β-CD-RRS的SEM照片Fig.4 Morphology of RRS,β-CD-RRS,DB-RRS and DB-β-CD-RRS注:a:RRS;b:β-CD-RRS;c:DB-RRS;d:DB-RRS。

3 結論

脫支處理可加速大米淀粉的重結晶,使糊化的大米淀粉在較短的時間內重結晶形成B+V型晶體,從而提高重結晶淀粉的抗性;脫支處理結合β-環(huán)糊精可促進淀粉-β-環(huán)糊精復合物的形成,從而進一步增強重結晶大米淀粉的晶體含量、提高重結晶淀粉的抗性。此外,DSC分析表明,脫支處理結合β-環(huán)糊精可使重結晶大米淀粉的晶體熱穩(wěn)定性高于單純脫支后的重結晶大米淀粉。綜上所述,脫支處理和β-環(huán)糊精可有效協(xié)同增加重結晶淀粉的抗性與抗性淀粉的熱穩(wěn)定性。