王 藝,劉 帆,臧夢(mèng)璐,方詩(shī)文,李 璇,薛 峰

(南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,江蘇南京 210023)

蜂產(chǎn)品具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健功效,因此被廣泛用于人類的食品和藥品中。目前,蜂產(chǎn)品主要包括蜂蜜、蜂花粉、蜂蠟和蜂王漿[1]。蜂王漿是工蜂體內(nèi)腺體分泌的一種牛奶狀粘稠液體,是蜜蜂幼蟲(chóng)的早期蜂糧和蜂王的終身蜂糧。新鮮蜂王漿的pH在3.6～4.2之間,其中水分含量60%～70%,蛋白質(zhì)含量9%～18%,碳水化合物含量10%～16%[1]。蜂王漿中的蛋白質(zhì)被認(rèn)為是其主要的功能性成分,其主要由蜂王漿主蛋白構(gòu)成(major royal jelly proteins MRJPs)。MRJPs是一個(gè)蛋白質(zhì)家族,擁有10個(gè)家族成員(MRJPs1～MRJPs10),分子量分布在55～80 kDa[1]。國(guó)內(nèi)外關(guān)于蜂王漿的產(chǎn)品較為單一,主要以鮮蜂王漿及其凍干粉為主。開(kāi)展蜂王漿蛋白的相關(guān)研究,對(duì)于開(kāi)發(fā)新型蜂王漿產(chǎn)品具有重要意義。

國(guó)內(nèi)外關(guān)于蜂王漿蛋白(royal jelly proteins,RJPs)的研究主要集中在其制備工藝和生理活性方面。張?jiān)降冉⒘朔渫鯘{蛋白水提酸沉法的最優(yōu)工藝[2]。Ramanathan等系統(tǒng)性地總結(jié)了蜂王漿蛋白的抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等生理活性[1]。但是國(guó)內(nèi)外關(guān)于蜂王漿蛋白的功能特性(溶解性、乳化性、起泡性以及疏水性等)的研究則鮮有報(bào)道。然而,蛋白質(zhì)本身的功能特性是決定其應(yīng)用領(lǐng)域的關(guān)鍵因素。因此,開(kāi)展蜂王漿蛋白功能特性的研究,并利用蛋白質(zhì)改性技術(shù)提高蜂王漿蛋白的各項(xiàng)功能特性,對(duì)于其在食品工業(yè)中的應(yīng)用具有重大意義。

目前,蛋白質(zhì)的改性技術(shù)主要包括化學(xué)改性、物理改性和酶法修飾[3-4]。在蛋白質(zhì)改性技術(shù)中,利用等離子體、高壓電場(chǎng)、電流體、脈沖電場(chǎng)和超聲波等物理技術(shù)來(lái)改善蛋白質(zhì)的功能特性成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)[5-6]。其中超聲波(10～1000 W/cm2和20～100 kHz)技術(shù)被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)改性中。例如:高場(chǎng)強(qiáng)超聲波(20 kHz,200、400和600 W)被用于改善大豆蛋白的凝膠特性[7];超聲波(20 kHz,120～1020 W)被用于改善花生蛋白的乳化性能[8]。此外,超聲波還被用于提高美拉德反應(yīng)速率和增加蛋白質(zhì)水解度[9-10]。超聲波所產(chǎn)生的空穴效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)、熱效應(yīng)和自由基效應(yīng),被認(rèn)為是誘導(dǎo)蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的主要因素[11-12]。然而,目前關(guān)于超聲波處理對(duì)蜂王漿蛋白結(jié)構(gòu)和功能特性的影響尚不清楚。

基于上述原因,本實(shí)驗(yàn)以蜂王漿蛋白為對(duì)象,探討超聲波處理對(duì)其溶解性、乳化性、起泡性、酶解特性以及表面疏水性的影響。同時(shí),通過(guò)對(duì)蜂王漿蛋白結(jié)構(gòu)的研究,闡釋超聲波處理改善蜂王漿蛋白功能特性的機(jī)制,從而為拓展蜂王漿蛋白的應(yīng)用領(lǐng)域提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蜂王漿 南京老山藥業(yè)股份有限公司;牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品、堿性蛋白酶 上海源葉生物科技有限公司;2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽 碧云天生物技術(shù)研究所;磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉 江蘇永華化學(xué)科技有限公司;十二烷基磺酸鈉 上海研拓生物科技有限公司;疏水熒光探針 梯希愛(ài)化成工業(yè)發(fā)展有限公司;鐵氰化鉀 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

JY92-IIN型超聲波細(xì)胞破碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司;紫外分光光度計(jì) 上海儀電分析儀器有限公司;PHS-25型pH計(jì) 上海經(jīng)貿(mào)科學(xué)儀器有限公司;LD5-28型低溫高速離心機(jī) 北京雷勃爾醫(yī)療器械有限公司;LGJ-18S型凍干機(jī) 北京松源華興科技發(fā)展有限公司;FM200型高速剪切機(jī) 上海弗魯克流體機(jī)械制造有限公司;Mos-450型圓兒色譜儀 法國(guó)Biologic公司;F-7000熒光光譜儀和S3400型掃描電鏡 日本Hitachi公司;Spark10M型酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蜂王漿蛋白的制備 采用水提酸沉法[2]。將100 g蜂王漿加入到2000 mL去離子水中,在室溫下(25 ℃)機(jī)械攪拌30 min(150 r/min)。在10000×g下離心25 min,取上清液,采用1 mol/L和0.1 mol/L的HCl調(diào)節(jié)其pH為4.4。靜置40 min后,在10000×g下離心25 min,收集沉淀。將沉淀復(fù)溶于去離子水中,采用1 mol/L和0.1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)其pH為7.0。經(jīng)透析脫鹽(24 h),冷凍干燥后于4 ℃保藏。

1.2.2 蜂王漿蛋白的超聲波處理 采用去離子水配制蜂王漿蛋白溶液,濃度為5%。將100 mL上述蜂王漿蛋白溶液放置于超聲波細(xì)胞破碎儀中,采用水浴的方式保持樣品處于穩(wěn)定的環(huán)境溫度(25 ℃),超聲波處理?xiàng)l件為:探頭直徑0.636 cm,頻率20 kHz,輸出功率200、400、600 W,時(shí)間20 min。樣品處理結(jié)束后,采用冷凍干燥獲得蜂王漿蛋白粉。同時(shí),以未經(jīng)過(guò)超聲波處理的蜂王漿蛋白粉作為對(duì)照。

1.2.3 蛋白質(zhì)溶解度的測(cè)定 采用去離子水配制濃度為2 mg/mL的蛋白溶液。取蛋白溶液2 mL,在12000×g下離心30 min。取上清液,采用Lowry法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度,同時(shí)以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品,蛋白質(zhì)溶解度(Solubility,%)按照如下公式計(jì)算。

溶解度(%)=(CS/C0)×100

式中,CS和C0分別代表上清液中蛋白質(zhì)的濃度和樣品蛋白質(zhì)濃度(2 mg/mL)。蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:y=7.5171x+0.0128,R2=0.9993。

1.2.4 蛋白質(zhì)乳化性的測(cè)定 采用去離子水配制濃度為2 mg/mL的蛋白溶液。取上述蛋白溶液30 mL,加入10 mL大豆油,在高速剪切機(jī)中處理1 min形成乳液,剪切速率為24000 r/min。分別在0、10 min時(shí),取50 μL乳液,加入5 mL十二烷基磺酸鈉溶液(0.1%),混勻后在500 nm下檢測(cè)吸光值[13]。樣品乳化活性(emulsifying activity index,EAI)按照如下公式計(jì)算。

EAI(m2/g)={(4.606×A0)/[C×φ×θ×104]}×稀釋倍數(shù)

式中,A0代表0 min時(shí)樣品稀釋液所測(cè)定的吸光值,C代表乳狀液蛋白質(zhì)濃度(g/mL),φ代表乳狀液中油所占比例(v/v),θ代表光路(1 cm)。乳化穩(wěn)定性(emulsifying stability index,ESI)按照如下公式計(jì)算。

ESI(min)=[A0/(A0-A10)]×10

式中,A0和A10分別代表0、10 min時(shí)樣品稀釋液所測(cè)定的吸光值。

1.2.5 蛋白質(zhì)起泡性的測(cè)定 采用去離子水配制濃度為20 mg/mL的蛋白溶液。取上述樣品溶液20 mL,至于100 mL量筒中,在高速剪切機(jī)中處理1 min,剪切速率為24000 r/min。記錄所形成泡沫的體積,靜置30 min后再次記錄泡沫體積[14]。樣品起泡性(foaming ability,FA)、起泡穩(wěn)定性(foaming stability,FS)按照如下公式計(jì)算。

FA(%)=(V0/VS)×100

式中,VS和V0分別代表蛋白溶液的體積和所形成泡沫的體積。

FS(%)=(V30/V0)×100

式中,V0和V30分別代表0、30 min時(shí)泡沫的體積。

1.2.6 蛋白質(zhì)水解度的測(cè)定 采用去離子水配制濃度為5%的蛋白溶液。將蛋白溶液放置于60 ℃水浴中,采用1、0.1 mol/L的NaOH溶液調(diào)整pH為8.5。按照2/0.1(底物/酶)的比例添加堿性蛋白酶,酶解時(shí)間為4 h。酶解結(jié)束后,沸水水浴15 min滅酶。冷卻至室溫后,用1、0.1 mol/L的HCl調(diào)整pH至4.4,在4000 r/min下離心30 min,取上清液用NaOH溶液調(diào)整pH至7.0,之后進(jìn)行冷凍干燥。采用三硝基苯磺酸(TNBS)法對(duì)樣品的水解度進(jìn)行檢測(cè)[14]。

1.2.7 蛋白質(zhì)水解物抗氧化活性的測(cè)定 蛋白質(zhì)水解物的制備參照1.2.6。按照文獻(xiàn)[10]的方法,評(píng)價(jià)水解物對(duì)2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)自由基的清除能力以及水解物的還原力。在ABTS自由基清除體系中水解物的濃度為0.5～2.5 mg/mL,在還原力測(cè)定體系中水解物的濃度為0.1～2.0 mg/mL。

1.2.8 蛋白質(zhì)的圓二色譜分析 在室溫下采用圓二色普儀對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化進(jìn)行測(cè)定。采用0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH7.0)配制濃度為0.2 mg/mL的樣品溶液。以磷酸鹽緩沖液為空白,記錄190～250 nm下該樣品的色譜圖。每組樣品的測(cè)定重復(fù)5次。將所得到的樣品的色譜數(shù)據(jù)輸入CDPro計(jì)算機(jī)軟件中(http://lamar. colostate. Edu/sreeram/CDPro/main. Html),由此可以計(jì)算蛋白質(zhì)各二級(jí)結(jié)構(gòu)的含量。

1.2.9 蛋白質(zhì)表面疏水性的測(cè)定 利用8-苯胺基-1-萘磺酸鈉(ANS)作為熒光探針來(lái)測(cè)定表面疏水性[15]。用0.2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH7.5)分別配制不同濃度(0.05～1.00 mg/mL)的樣品溶液。然后,在4 mL樣品溶液中加入20 μL ANS(0.008 mol/L)。采用熒光光譜儀測(cè)定樣品的熒光強(qiáng)度,激發(fā)波長(zhǎng)為390 nm,發(fā)射波長(zhǎng)為470 nm。用熒光強(qiáng)度值與蛋白質(zhì)濃度繪制曲線,求得曲線的斜率值,即為表面疏水性值。

1.2.10 蛋白質(zhì)內(nèi)源熒光光譜分析 采用0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液中(pH7.0),配制蛋白質(zhì)濃度為0.15 mg/mL的樣品溶液。檢測(cè)該樣品在290 nm激發(fā)下300～400 nm之間的熒光光譜,掃描速率10 nm/s。

1.2.11 蛋白質(zhì)的掃描電鏡分析 蛋白質(zhì)粉末經(jīng)噴金處理后,采用掃描電鏡觀察其微觀結(jié)構(gòu)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)樣品平行測(cè)定3次,所獲得的數(shù)據(jù)利用SPSS 17.0軟件進(jìn)行平均值計(jì)算和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲波處理對(duì)蜂王漿蛋白溶解度的影響

圖1為超聲波處理對(duì)蜂王漿蛋白質(zhì)溶解度的影響。由圖1可知,與對(duì)照組相比較,超聲波處理可以顯著(p<0.05)提高蜂王漿蛋白的溶解度。且蜂王漿蛋白經(jīng)400 W處理后,呈現(xiàn)較高的溶解度,相比對(duì)照組增加了10.90%,而繼續(xù)增加超聲波功率(600 W),則會(huì)導(dǎo)致溶解度的下降，但仍顯著高于對(duì)照組(p<0.05)。超聲波處理可以改善蛋白質(zhì)的溶解度,主要是由于超聲波處理可以增加蛋白質(zhì)表面的可溶性基團(tuán),繼而增加了蛋白質(zhì)與水分子之間的親和力[16]。然而,較高功率(600 W)的超聲波處理所導(dǎo)致的溶解度下降,主要是因?yàn)楦吖β实某暡ㄌ幚砜梢哉T導(dǎo)蛋白質(zhì)之間發(fā)生非共價(jià)交聯(lián),產(chǎn)生大分子聚集體,繼而降低蛋白質(zhì)的溶解度[17]。

圖1 超聲波處理對(duì)蜂王漿蛋白質(zhì)溶解度的影響Fig.1 Effect of ultrasound treatment on the solubility of royal jelly proteins注:不同字母表示差異顯著(p<0.05);圖2～圖4、圖7同。

2.2 超聲波處理對(duì)蜂王漿蛋白乳化性的影響

圖2為超聲波處理對(duì)蜂王漿蛋白質(zhì)乳化活性和乳化穩(wěn)定性的影響。由圖2所示,與對(duì)照組相比較,超聲波處理可以顯著(p<0.05)提高蜂王漿蛋白的乳化活性和乳化穩(wěn)定性。這一結(jié)果與前人的研究相一致,即超聲波處理(20 kHz,34～48 W/cm2,20/40 min)可以顯著改善卵清蛋白的乳化性能[18]。此外,蜂王漿蛋白經(jīng)400 W處理后,呈現(xiàn)較高的乳化活性和乳化穩(wěn)定性,相比對(duì)照組,乳化活性增加了67.18%,乳化穩(wěn)定性增加了15.87%,而繼續(xù)增加超聲波功率(600 W)則會(huì)導(dǎo)致乳化性的下降。超聲波處理可以改善蛋白質(zhì)的乳化特性,主要是由于超聲波處理可以在蛋白質(zhì)溶液中產(chǎn)生局部的極端溫度和壓力,繼而誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,使得蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)向著更加無(wú)序化的方向發(fā)展,從而有利于蛋白質(zhì)在油水界面形成吸附層[8]。此外,超聲波處理所產(chǎn)生的機(jī)械效應(yīng)和空穴效應(yīng)可以增加蛋白質(zhì)分子的流動(dòng)性,從而有利于提高蛋白質(zhì)在油水界面形成吸附層的速率[19]。較高功率(600 W)的超聲波處理所導(dǎo)致的乳化特性的下降,可能與高功率的超聲波處理所導(dǎo)致的溶解性的下降和大分子聚集體的產(chǎn)生有關(guān)。

圖2 超聲波處理對(duì)蜂王漿蛋白質(zhì)乳化活性(A)和乳化穩(wěn)定性(B)的影響Fig.2 Effects of ultrasound treatment on the emulsifying activity index(A) and emulsion stability index(B)of royal jelly proteins

2.3 超聲波處理對(duì)蜂王漿蛋白起泡性的影響

圖3為超聲波處理對(duì)蜂王漿蛋白質(zhì)起泡性和起泡穩(wěn)定性的影響。由圖3可知,與對(duì)照組相比較,較低功率(200 W)的超聲波處理對(duì)蜂王漿蛋白起泡性的影響不顯著(p<0.05),較高功率(400、600 W)的超聲波處理可以顯著(p<0.05)提高蜂王漿蛋白的起泡性和起泡穩(wěn)定性。此外,蜂王漿蛋白經(jīng)400 W處理后,呈現(xiàn)較高的起泡性和起泡穩(wěn)定性,相比對(duì)照組,起泡性增加了60.00%,起泡穩(wěn)定性增加了118.75%,而繼續(xù)增加超聲波功率(600 W)則會(huì)導(dǎo)致起泡性能的下降。超聲波處理可以改善蛋白質(zhì)的起泡性能,主要是由于超聲波處理可以降低蛋白質(zhì)粒徑分布,繼而增強(qiáng)蛋白質(zhì)在水/空氣界面的吸附能力[20]。此外,超聲波處理還可增強(qiáng)蛋白質(zhì)所形成泡沫的內(nèi)聚力,從而表現(xiàn)出較好的起泡穩(wěn)定性[21]。較高功率(600 W)的超聲波處理所導(dǎo)致的起泡性能的下降,可能與高功率的超聲波處理所導(dǎo)致的蛋白分子聚集體的產(chǎn)生有關(guān),這一結(jié)果與超聲波處理對(duì)蜂王漿蛋白乳化性能的影響相一致。

圖3 超聲波處理對(duì)蜂王漿蛋白質(zhì)起泡性(A)和起泡穩(wěn)定性(B)的影響Fig.3 Effects of ultrasound treatment on the foaming property(A)and foaming stability(B)of royal jelly proteins

2.4 超聲波處理對(duì)蜂王漿蛋白水解度的影響

圖4為超聲波處理對(duì)蜂王漿蛋白質(zhì)水解度的影響。由圖4可知,與對(duì)照組相比較,超聲波處理可以顯著(p<0.05)提高蜂王漿蛋白的水解度。此外,蜂王漿蛋白經(jīng)400 W處理后,呈現(xiàn)較高的水解度,相比對(duì)照組增加了83.33%,而繼續(xù)增加超聲波功率(600 W)則會(huì)導(dǎo)致水解度的下降。超聲波處理可以改善蛋白質(zhì)的水解度,主要是由于在高水分活度的體系中,超聲波的機(jī)械效應(yīng)、熱效應(yīng)和化學(xué)效應(yīng)可導(dǎo)致局部出現(xiàn)極高的壓力和溫度。而蛋白質(zhì)在這種條件下容易發(fā)生去折疊化,從而暴露出更多的基團(tuán),繼而提高與酶之間的親和性[22]。較高功率(600 W)的超聲波處理所導(dǎo)致的水解度的下降,可能與高功率的超聲波處理所引起的蛋白質(zhì)溶解性下降有關(guān)。

圖4 超聲波處理對(duì)蜂王漿蛋白質(zhì)水解度的影響Fig.4 Effect of ultrasound treatment on the hydrolysis degree of royal jelly proteins

2.5 超聲波處理對(duì)蜂王漿蛋白酶解物抗氧化活性的影響

圖5為超聲波處理對(duì)蜂王漿蛋白水解物清除ABTS自由基和還原力的影響。由圖5可知,蜂王漿蛋白水解物在所測(cè)定的濃度范圍內(nèi),其自由基清除能力和還原力隨著濃度的增加而增強(qiáng)。與對(duì)照組相比較,超聲波處理可以顯著(p<0.05)改善水解物的抗氧化活性。這一結(jié)果說(shuō)明,超聲波處理有助于釋放具有抗氧化活性的多肽。此外,蜂王漿蛋白經(jīng)400 W處理后,所獲得的水解物呈現(xiàn)較高的自由基清除能力和還原力,而繼續(xù)增加超聲波功率(600 W)則會(huì)導(dǎo)致水解物抗氧化能力的下降。這一規(guī)律與超聲波處理對(duì)蜂王漿蛋白水解度的影響相一致,即蜂王漿蛋白經(jīng)過(guò)400 W處理后呈現(xiàn)較高的水解度,從而表現(xiàn)出較好的抗氧化活性。這一結(jié)論與前人的研究結(jié)果相一致,即多肽的生物活性與其水解度之間呈現(xiàn)顯著相關(guān)性[23-24]。

圖5 超聲波處理對(duì)蜂王漿蛋白水解物清除ABTS自由基(A)和還原力(B)的影響Fig.5 Effects of ultrasound treatment on the ABTS radical scavenging activity(A) and reducing power(B)of royal jelly proteins注:相同濃度下的不同字母表示差異顯著(p<0.05)。

2.6 超聲波處理對(duì)蜂王漿蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

圖6和表1為超聲波處理對(duì)蜂王漿蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)及其含量的影響。如圖6和表1所示,與對(duì)照組相比較,超聲波處理可以改變蜂王漿蛋白中α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲的含量,但是并未呈現(xiàn)特定的規(guī)律?？傮w而言,蜂王漿蛋白經(jīng)超聲處理后,α-螺旋含量降低,無(wú)規(guī)則卷曲含量增加。此外,蜂王漿蛋白經(jīng)400 W處理后,其無(wú)規(guī)則卷曲含量(31.6%)高于其他樣品。這一結(jié)果表明,蜂王漿蛋白經(jīng)400 W處理后,其蛋白質(zhì)呈現(xiàn)出較為松散的結(jié)構(gòu)。而這種松散的結(jié)構(gòu)則有助于提高蛋白質(zhì)的溶解性、乳化性、起泡性以及水解度。

圖6 超聲波處理對(duì)蜂王漿蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響Fig.6 Effects of ultrasound treatment on the secondary structure of royal jelly proteins

表1 超聲波處理對(duì)蜂王漿蛋白α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲的含量的影響Table 1 Effects of ultrasound treatment on the content of α-helix,β-sheet,β-turn and random coil in royal jelly proteins

2.7 超聲波處理對(duì)蜂王漿蛋白表面疏水性的影響

圖7為超聲波處理對(duì)蜂王漿蛋白表面疏水性的影響。由圖7可知,與對(duì)照組相比較,超聲波處理可以顯著(p<0.05)增加蜂王漿蛋白的表面疏水性。此外,蜂王漿蛋白經(jīng)400 W處理后,擁有較高的表面疏水性,相比對(duì)照組增加了18.65%,而繼續(xù)增加超聲波功率(600 W)則會(huì)導(dǎo)致表面疏水性的下降。超聲波處理可以增加蛋白質(zhì)的表面疏水性,主要是由于超聲波處理可以誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的去折疊化,從而使得內(nèi)部疏水基團(tuán)得以暴露[25]。而蛋白質(zhì)內(nèi)部疏水基團(tuán)的暴露也是其乳化性得以改善的主要原因。較高功率(600 W)的超聲波處理所導(dǎo)致的表面疏水性的下降,可能與高功率的超聲波處理所引起的蛋白質(zhì)聚集有關(guān)。

圖7 超聲波處理對(duì)蜂王漿蛋白表面疏水性的影響Fig.7 Effect of ultrasound treatment on the surface hydrophobicity of royal jelly proteins

2.8 超聲波處理對(duì)蜂王漿蛋白內(nèi)源熒光光譜的影響

圖8為超聲波處理對(duì)蜂王漿蛋白內(nèi)源熒光光譜的影響。由圖8可知,與對(duì)照組相比較,超聲波處理可以降低蛋白質(zhì)的熒光強(qiáng)度。蜂王漿蛋白經(jīng)400 W處理后,呈現(xiàn)較弱的熒光強(qiáng)度,而繼續(xù)增加超聲波功率(600 W)則會(huì)導(dǎo)致熒光強(qiáng)度的增加。超聲波處理可以降低蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光強(qiáng)度,主要是由于超聲波處理可以誘導(dǎo)蛋白質(zhì)分子內(nèi)發(fā)色團(tuán)的暴露。而內(nèi)部基團(tuán)的暴露可以進(jìn)一步證明蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化。此外,超聲波處理使得蛋白質(zhì)的λmax發(fā)生紅移。這一結(jié)果可以進(jìn)一步說(shuō)明,超聲波處理可以誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[26]。較高功率(600 W)的超聲波處理所導(dǎo)致的內(nèi)源熒光強(qiáng)度的增加,可能與高功率的超聲波處理所引起的蛋白質(zhì)聚集有關(guān)。

圖8 超聲波處理對(duì)蜂王漿蛋白內(nèi)源熒光光譜的影響Fig.8 Effects of ultrasound treatment on the intrinsic fluorescence emission spectra of royal jelly proteins

2.9 超聲波處理對(duì)蜂王漿蛋白微觀結(jié)構(gòu)的影響

圖9為不同功率超聲波處理對(duì)蜂王漿蛋白微觀結(jié)構(gòu)的影響。由圖9可知,對(duì)照組的蜂王漿蛋白結(jié)構(gòu)緊致,表面平整。經(jīng)過(guò)超聲波處理后,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)無(wú)序化,表面變得粗糙。這種無(wú)序和粗糙的結(jié)構(gòu)增加了蛋白質(zhì)的比表面積,同時(shí)暴露出更多的酶切位點(diǎn),從而有利于提高其水解度。此外,蜂王漿蛋白經(jīng)400 W處理后,其碎片化程度增加,從而有助于提高其溶解性。然而,繼續(xù)增加超聲波功率(600 W)則會(huì)導(dǎo)致聚集體的出現(xiàn)。這可能是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)分子內(nèi)部疏水基團(tuán)的過(guò)度暴露,使得分子間通過(guò)疏水相互作用力形成聚集體,從而降低了蛋白質(zhì)的溶解性和乳化性。

圖9 不同功率超聲波處理對(duì)蜂王漿蛋白微觀結(jié)構(gòu)的影響Fig.9 Effects of ultrasound treatment with different levels of power output on the microstructure of royal jelly proteins

3 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn),超聲波功率明顯影響蜂王漿蛋白的功能特性。蜂王漿蛋白經(jīng)過(guò)400 W超聲波處理后,溶解性增加了10.90%,乳化活性增加了67.18%,乳化穩(wěn)定性增加了15.87%,起泡性增加了60.00%,起泡穩(wěn)定性增加了118.75%,水解度增加了83.33%,表面疏水性增加了18.65%,表明其溶解性、乳化性、起泡性以及水解度均得到明顯改善。與對(duì)照組相比較,超聲波處理可以顯著(p<0.05)改善水解物的抗氧化活性。以上功能特性的變化可能與超聲波處理所導(dǎo)致的蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)和微觀結(jié)構(gòu)變化有關(guān),即超聲波處理可以誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)發(fā)生去折疊化。這些結(jié)果表明,超聲波處理所誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化,是其功能特性得以改善的主要原因。然而,本研究?jī)H在固定頻率下探討不同功率對(duì)蛋白質(zhì)功能及結(jié)構(gòu)的影響。未來(lái)的研究還需要考慮不同頻率下,超聲波處理對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及功能的影響規(guī)律,從而為超聲波技術(shù)在蜂王漿蛋白改性中的應(yīng)用提供技術(shù)支撐。