楊秀華，肖云峰，劉天龍，劉小玲，張勇，楊宏昕，劉小雷

(1內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，呼和浩特010110；2呼倫貝爾職業(yè)技術(shù)學(xué)院；3內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院;4內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院)

病毒性心肌炎(viral myocarditis，VMC)是最常見(jiàn)的感染性心肌炎。引起VMC的病毒主要是腸道病毒和上呼吸道感染病毒，其中以柯薩奇B組3型病毒(CVB3)最為常見(jiàn)[1]。近年來(lái)，VMC的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，尤其是兒童、青壯年發(fā)病率較高，發(fā)病初期常見(jiàn)發(fā)熱、全身酸痛、胸痛、疲倦等一般病毒感染癥狀，因此常因誤診不被患者所重視而延誤病情[2]，嚴(yán)重VMC感染可導(dǎo)致心力衰竭、心源性休克甚至猝死。乳酸脫氫酶(LDH)和肌酸磷酸激酶(CK-MB)是診斷VMC的標(biāo)志性心肌酶。目前VMC的臨床治療主要以對(duì)癥治療、提高機(jī)體的免疫力及抗病毒治療為主[3]，目前尚無(wú)統(tǒng)一安全有效的抗VMC藥物。黃芪甲苷(AsⅣ)是從蒙古黃芪根莖中提取分離的主要活性成分，具有補(bǔ)氣升陽(yáng)、益衛(wèi)固表、托毒生肌、利水消腫等功效。黃芪具有增強(qiáng)免疫、強(qiáng)心降壓、降血糖、抗炎、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤等功效，可用于冠心病、心絞痛等疾病的治療[3]。目前關(guān)于A(yíng)sⅣ治療VMC的效果相關(guān)報(bào)道較少。2017年9月～2018年6月，我們分別觀(guān)察了AsⅣ對(duì)CVB3感染的乳鼠心肌細(xì)胞及VMC乳鼠心肌細(xì)胞的保護(hù)作用，并分析其可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、藥物及儀器 SPF級(jí)新生1～3 d SD乳鼠，由內(nèi)蒙古大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證編號(hào)：SCXK(蒙)2002-0001；SPF級(jí)昆明種雄性小鼠75只，體質(zhì)量18～22 g，由內(nèi)蒙古大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(蒙)2002-0001。人宮頸癌Hela細(xì)胞株由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院楊秉呼博士惠贈(zèng)，Vero細(xì)胞株由中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒研究所惠贈(zèng)；CVB3(Nancy)毒株由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒所惠贈(zèng)；AsⅣ(110781，中國(guó)藥品生物制品檢定所)；LDH測(cè)定試劑盒(142715003，南京建成生物工程研究所)；CK-MB試劑盒(14271500，南京建成生物工程研究所)。

1.2 AsⅣ對(duì)CVB3感染的乳鼠心肌細(xì)胞的保護(hù)作用觀(guān)察

1.2.1 CVB3病毒擴(kuò)增及病毒滴度(TCID50)檢測(cè) ①CVB3病毒擴(kuò)增[4]取Hela細(xì)胞株培養(yǎng)于25 cm2培養(yǎng)瓶中，當(dāng)長(zhǎng)成單層細(xì)胞時(shí)加入1 mL CVB3病毒液，吸附1 h后棄上清，加5 mL全DMEM培養(yǎng)基，在孵箱中培養(yǎng)。于倒置顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)，當(dāng)細(xì)胞變?yōu)閱蝹€(gè)細(xì)胞并發(fā)生部分破裂時(shí)，終止培養(yǎng)。反復(fù)凍融3次，最終完全釋放病毒顆粒時(shí)移入離心管，1 500 rpm離心15 min，收集上清液，-20 ℃保存?zhèn)溆谩＂赥CID50[5]檢測(cè) 取Vero細(xì)胞用全DMEM培養(yǎng)基將病毒液稀釋?zhuān)瑵舛确秶鸀?0-1～10-8稀釋度。將已長(zhǎng)成單層細(xì)胞的培養(yǎng)液棄去，接種不同濃度的病毒液，記錄細(xì)胞病變(CPE)的孔數(shù)，以CPE達(dá)“++”以上為陽(yáng)性，以最高稀釋度不再出現(xiàn)CPE為終點(diǎn)；用 Reed-Muench 法計(jì)算 TCID50，得CVB3病毒的TCID50為6.76，即能夠使50%細(xì)胞發(fā)生CPE的病毒濃度為10～76 /mL，最終選擇1 000 TCID50作為正式實(shí)驗(yàn)的接種濃度。

1.2.2 原代乳鼠心肌細(xì)胞分離與培養(yǎng)[6]取新生1～3d SD乳鼠，75%乙醇消毒，迅速剪取心臟心尖處，將心臟均勻剪成約1 mm3的組織塊，棄上清。加入6 mL 0.1% 胰酶輕輕吹打，37 ℃消化6 min。加入5 mL 0.08%胰酶及0.05% Ⅱ型膠原酶的混合液，37 ℃消化5 min，吸取上清液轉(zhuǎn)移至另一預(yù)冷玻璃瓶中，5 mL的10% DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化，重復(fù)上述步驟，共消化10次。200目篩網(wǎng)去除大量組織，1000 rpm離心8 min，20% DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)，差速貼壁60 min，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至另一培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞達(dá)到融合狀態(tài)時(shí)開(kāi)始后續(xù)實(shí)驗(yàn)。倒置顯微鏡下可見(jiàn)培養(yǎng)48 h時(shí)細(xì)胞基本全部貼壁，細(xì)胞呈圓形、梭形及多角形，大多數(shù)都已伸出偽足，邊界清晰可見(jiàn)，并且有自發(fā)性節(jié)律性搏動(dòng)；培養(yǎng)72 h細(xì)胞伸出偽足并相互觸及交織成網(wǎng)，逐漸形成細(xì)胞簇，并且同步搏動(dòng)，搏動(dòng)頻率60～90次/min；培養(yǎng)5～7日細(xì)胞搏動(dòng)頻率逐漸達(dá)到高峰(110次/min)。α-actin免疫組化染色后乳鼠心肌細(xì)胞染色為陽(yáng)性，胞質(zhì)內(nèi)存有棕黃色絲狀物質(zhì)，細(xì)胞純度達(dá)95%以上。

1.2.3 AsⅣ對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞的最大無(wú)毒濃度(TC0)測(cè)算 取乳鼠心肌細(xì)胞分為正常對(duì)照、AsⅣ(濃度分別為320、160、80、40、20 mg/L),每組每個(gè)濃度3個(gè)復(fù)孔。分別將不同濃度藥物加入到已長(zhǎng)成單層細(xì)胞的96孔板中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，高濃度AsⅣ對(duì)細(xì)胞的毒性較大，表現(xiàn)為細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，出現(xiàn)脫落、死亡；隨著AsⅣ濃度的降低，對(duì)心肌細(xì)胞的毒性反應(yīng)也逐漸減弱。當(dāng)AsⅣ達(dá)到無(wú)毒濃度時(shí)，給藥的細(xì)胞和正常對(duì)照細(xì)胞的CPE沒(méi)有明顯的區(qū)別。顯微鏡下記數(shù)CPE的孔數(shù)，當(dāng)不再變化時(shí)，用 Reed-Muench 法測(cè)算AsⅣ的TD50為40 mg/L，TC0為20 mg/L。

1.2.4 加入AsⅣ的CVB3感染心肌細(xì)胞存活情況觀(guān)察及細(xì)胞上清液中LDH、CK-MB檢測(cè) 取乳鼠心肌細(xì)胞分為正常對(duì)照組、病毒對(duì)照組、AsⅣ組。將密度為5×105/mL的心肌細(xì)胞接種于96孔板中，37 ℃，5% CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，病毒對(duì)照組和AsⅣ組分別用1 000 TCID50的病毒感染心肌細(xì)胞，共培養(yǎng)1 h棄去含有病毒的培養(yǎng)液。AsⅣ組分為五個(gè)亞組，分別加入20、10、5、2.5、1.25 mg/L的AsⅣ，顯微鏡下每日觀(guān)察CPE。當(dāng)病毒對(duì)照組中75%以上的細(xì)胞出現(xiàn)病變時(shí)結(jié)束培養(yǎng)。每孔加入MTT液(0.5 mg/mL)20 μL，培養(yǎng)4 h，吸棄原培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 100 μL,振搖5 min，于酶標(biāo)儀490 nm處讀取光密度值(OD值)，根據(jù)每組細(xì)胞的OD值計(jì)算細(xì)胞存活率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值；收集各組細(xì)胞上清液，采用全自動(dòng)生化分析儀對(duì)處理樣本進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)指標(biāo)為L(zhǎng)DH、CK-MB，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.3 AsⅣ對(duì)VMC小鼠心臟的保護(hù)作用觀(guān)察

1.3.1 小鼠分組及AsⅣ給藥方法 采用隨機(jī)數(shù)字表法將75只小鼠分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、AsⅣ高劑量組、AsⅣ中劑量組、AsⅣ低劑量組，每組15只。除正常對(duì)照組外，其余各組小鼠均腹腔注射1 000 TCID50 CVB3病毒液0.1 mL/只，建立VMC動(dòng)物模型。小鼠接種病毒24 h時(shí)，AsⅣ高、中、低劑量組分別給予4、2、1 g/kg的AsⅣ灌胃，正常對(duì)照組、模型對(duì)照組每日予0.5%羧甲基纖維素鈉20 mL/kg灌胃，各組均灌胃7 d。灌胃第8 d脫頸椎處死各組小鼠。

1.3.2 各組小鼠心肌組織病理形態(tài)觀(guān)察 處死各組小鼠后留取心肌組織，沿左心室長(zhǎng)軸切開(kāi)，用10%甲醛固定后石蠟包埋切片，HE染色，觀(guān)察各組心肌細(xì)胞、心肌組織病理學(xué)改變。

1.3.3 各組小鼠血清中LDH、CK-MB測(cè)定 將麻醉小鼠眼眶取血，靜置30 min，用3 000 /min,10 min離心取血清。采用全自動(dòng)生化分析儀對(duì)處理好的樣本進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)指標(biāo)為L(zhǎng)DH、CK-MB，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 加入AsⅣ的CVB3感染的心肌細(xì)胞OD值比較 空白對(duì)照組、病毒對(duì)照組細(xì)胞OD值分別為0.702 8±0.021 1、0.461 8±0.045 0，20、10、5、2.5、1.25 mg/L的AsⅣ組細(xì)胞OD值分別為0.621 0±0.097 8、0.618 9±0.089 0、0.612 3±0.098 7、0.603 4±0.879 3、0.576 4±0.108 9。與空白對(duì)照組比較，病毒對(duì)照組及AsⅣ組各亞組細(xì)胞OD值降低(P均<0.05)；與病毒對(duì)照組比較，及AsⅣ組各亞組細(xì)胞OD值升高(P均<0.05)。

2.2 加入AsⅣ的CVB3感染的心肌細(xì)胞細(xì)胞上清液LDH、CK-MB含量比較 空白對(duì)照組CVB3感染的心肌細(xì)胞LDH、CK-MB含量分別為(49.21±1.98)、(83.6±12.72)U/L，病毒對(duì)照組CVB3感染的心肌細(xì)胞LDH、CK-MB含量分別為(82.17±2.31)、(122.36±15.48)U/L，1.25、2.5、5、10、20 mg/L的AsⅣ組心肌細(xì)胞LDH含量分別為(78.24±1.56)、(73.56±2.32)、(72.21±3.21)、(67.83±2.14)、(64.56±3.12)U/L，CK-MB含量分別為(120.66±3.27)、(108.37±2.12)、(97.48±3.67)、(95.65±2.16)、(86.75±3.15)U/L。與正常對(duì)照組比較，病毒對(duì)照組心肌細(xì)胞LDH、CK-MB含量升高(P均<0.05)；與病毒對(duì)照組比較，10、20 mg/L的AsⅣ組心肌細(xì)胞LDH、CK-MB含量降低(P均<0.05)。

2.3 加入AsⅣ的VMC小鼠心肌組織病理形態(tài) 模型對(duì)照組及AsⅣ低、中劑量組分別死亡4、1、2只。與空白對(duì)照組比較，病毒對(duì)照組心肌組織排列紊亂，淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞出現(xiàn)介導(dǎo)的炎性浸潤(rùn)、心肌細(xì)胞出現(xiàn)明顯出血水腫甚至壞死。AsⅣ組不同劑量心肌組織排列紊亂情況輕，淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞出現(xiàn)介導(dǎo)的炎性浸潤(rùn)、心肌細(xì)胞輕微出血水腫，心肌組織壞死以點(diǎn)狀炎癥和壞死灶為主。

2.4 加入AsⅣ的VMC小鼠血清LDH、CK-MB含量測(cè)定結(jié)果比較 見(jiàn)表1。與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組心肌細(xì)胞LDH、CK-MB含量升高(P均<0.05)；與模型對(duì)照組比較，AsⅣ高、中、低劑量組心肌細(xì)胞LDH、CK-MB含量降低(P均<0.05)。

表1 各組乳鼠心肌細(xì)胞LDH、CK-MB含量

3 討論

中藥黃芪是來(lái)源于豆科黃芪屬植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根，史載于《神農(nóng)本草經(jīng)》中，具有顯著的補(bǔ)氣升陽(yáng)、益衛(wèi)固表、托毒生肌、利水消腫等功效，根據(jù)現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，黃芪具有增強(qiáng)免疫、強(qiáng)心降壓、降血糖、抗炎、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤的功效，臨床上可用于冠心病、心絞痛、病毒性心肌炎等疾病的治療中。目前，黃芪己被列入我國(guó)衛(wèi)生行政部門(mén)制定的有關(guān)病毒性心肌炎常規(guī)治療方案中。本研究中所用的AsⅣ是從蒙古黃芪中分離純化的主要活性成分，在藥典中被作為黃芪質(zhì)量檢測(cè)標(biāo)志物[17]?，F(xiàn)代研究表明，AsⅣ具有抗炎[8]、抗氧化[9,10]、抗病毒[11]、增強(qiáng)免疫力[12]等藥理作用。

原代乳鼠心肌細(xì)胞的體外培養(yǎng)，是將出生1～3天乳鼠心臟組織剪碎，用特定濃度的消化酶進(jìn)行消化，使心肌組織變成單個(gè)的心肌細(xì)胞，在適宜的體外環(huán)境下，貼壁生長(zhǎng)的一種細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。原代乳鼠心肌細(xì)胞在感染CVB3病毒后3～5天就可以發(fā)生較明顯的細(xì)胞病變，早期便可以直接損害心肌細(xì)胞。臨床上一般采用檢測(cè)心肌酶的表達(dá)水平來(lái)間接檢測(cè)心肌細(xì)胞的損傷程度，LDH、CK-MB是診斷病毒性心肌炎的標(biāo)志性心肌酶。在CVB3感染的心肌細(xì)胞模型中，由于心肌細(xì)胞受損，細(xì)胞膜通透性升高，胞內(nèi)酶大量釋放進(jìn)入血液中，導(dǎo)致LDH、CK-MB的活性升高[18]。AsⅣ治療組(20、10、5 mg/L)CPE明顯減輕，細(xì)胞搏動(dòng)有力。MTT染色結(jié)果顯示，給藥各濃度組與病毒對(duì)照組比較，給藥組的細(xì)胞存活率明顯增高，細(xì)胞搏動(dòng)較好，形態(tài)正常，兩組間平均OD值有顯著性差異。故AsⅣ作用于CVB3感染的心肌細(xì)胞后，細(xì)胞病變明顯減輕，上清液中的心肌酶的活性明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明AsⅣ可以減輕CVB3感染所造成的心肌細(xì)胞損傷，能維持心肌細(xì)胞正常功能，對(duì)心肌細(xì)胞具有較好的保護(hù)作用。在CVB3感染的小鼠模型中，通過(guò)HE染色法可觀(guān)察到感染病毒的小鼠的心肌組織形態(tài)，病毒對(duì)照組心肌組織排列紊亂，淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞出現(xiàn)介導(dǎo)的炎性浸潤(rùn)、心肌細(xì)胞出現(xiàn)明顯出血水腫甚至壞死。AsⅣ給藥組尚可觀(guān)察到病灶出現(xiàn)，以點(diǎn)狀炎癥和壞死灶為主，病變程度相對(duì)于病毒對(duì)照組較輕，能明顯減輕CVB3感染的心肌組織病變程度。

綜上所述，加入AsⅣ可促進(jìn)CVB3感染心肌細(xì)胞的存活，加入AsⅣ的VMC乳鼠心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)輕，AsⅣ對(duì)CVB3感染的心肌細(xì)胞和VMC乳鼠心肌細(xì)胞均具有明顯的保護(hù)作用，AsⅣ可明顯抑制CVB3感染，減輕了CVB3感染造成的心肌損傷，其機(jī)制可能為AsⅣ通過(guò)減少LDH和CK-MB的釋放、抑制病毒增殖以及對(duì)心肌細(xì)胞及心肌組織的保護(hù)作用，但其具體治療機(jī)制尚有待于進(jìn)一步研究。