陶婭玲，朱亮亮，鄒嘉樂，杜威，付先蕓

(1三峽大學(xué)人民醫(yī)院，湖北宜昌443000；2三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院)

子宮腺肌病(adenomyosis AM)是指子宮內(nèi)膜向肌層良性浸潤并在其中彌漫性生長。AM的主要病理特征是在子宮肌層中出現(xiàn)了異位的內(nèi)膜和腺體，伴有其周圍的肌層細胞肥大和增生。年齡>40歲的女性AM發(fā)病率高達24.4%[1]。AM患者常常伴隨有月經(jīng)過多(50%)、痛經(jīng)(30%)和子宮出血(20%)[2]，嚴重影響女性的生活質(zhì)量。AM是一種良性疾病，但它與癌癥有一些共同特點，如侵襲性和轉(zhuǎn)移性。腫瘤細胞的遷移、侵襲均需要細胞骨架的重新排列。ras同源基因家族(Rho)蛋白屬于小G蛋白超家族的亞家族成員，到目前為止已發(fā)現(xiàn)20多個Rho家族成員，在細胞骨架重組調(diào)控方面起重要作用。進一步研究[3]發(fā)現(xiàn)，Rho/與Rho相關(guān)的蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶(ROCK1)通路參與調(diào)控腫瘤細胞骨架的重組。但目前關(guān)于Rho/ROCK1信號通路在子宮內(nèi)膜異位癥及AM發(fā)生中的具體作用機制相關(guān)研究較少。2018年7～10月，我們觀察了AM小鼠子宮組織及子宮內(nèi)膜基底層(NJ)/內(nèi)膜功能層(NG)上皮細胞、間質(zhì)細胞、平滑肌細胞中ROCK1的表達變化，探討其與內(nèi)膜侵襲能力的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑及儀器 將出生日設(shè)為第1 天，出生2 d的雌性ICR小鼠38只，清潔級，飼養(yǎng)溫度18 ℃～24 ℃，明暗周期12 h，出生21日由母鼠哺乳飼養(yǎng)，22 日齡起與母鼠分籠，自由攝食飲水。ICR小鼠購買自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號SCXK(京)2016-00061.2。Rho試劑、ROCK1試劑均購于英國Abcam公司(ab40673，ab45171)；GAPDH試劑購于中國武漢Servicebio公司(GB12002)。SDS-PAGE電泳儀(廠家Bio-Red，型號Bestell-Nr 40-800),恒溫搖床(廠家LAB，型號LAB-LINE),冷凍高速離心機(廠家Sigma，型號Sigma 1-15K)。

1.2 動物分組及AM造模方法 取38只小鼠，通過隨機區(qū)組設(shè)計產(chǎn)生隨機序列分為空白組8只，模型組30只。模型組采用初生小鼠枸櫞酸他莫昔芬灌胃法制作AM模型：取第2 天小鼠 滴喂5 μL/g 花生油/卵磷脂/煉乳混合液(體積比為2∶0.2∶3)+2.7 μmol /kg 枸櫞酸他莫昔芬，1次/d,連續(xù)滴喂3 d?？瞻捉M小鼠不做任何處理，正常飼養(yǎng)。母鼠哺育小鼠期間模型組死亡3只，飼養(yǎng)過程中模型組死亡1只。最后納入統(tǒng)計模型組26只，空白組8只。

1.3 小鼠子宮組織內(nèi)膜浸潤程度觀察 飼養(yǎng)兩組小鼠至12周齡，引頸處死后取子宮組織，石蠟包埋、切片，HE染色，光鏡下觀察兩組小鼠子宮組織內(nèi)膜浸潤程度。根據(jù)浸潤情況分為4度。0度：無明顯浸潤；1度：輕度浸潤，間質(zhì)或上皮細胞浸潤至NJ界面下，未超過淺肌層內(nèi)1/2；2度：中度浸潤，間質(zhì)及上皮細胞浸潤至淺肌層外1/2；3度：重度浸潤，間質(zhì)及上皮細胞浸潤至深肌層或漿膜下。

1.4 小鼠子宮組織Rho、ROCK1蛋白檢測 采用Western blotting法。取兩組子宮組織，提取子宮總蛋白，總蛋白定量，PVDF 膜蒸餾水漂洗并封閉加入一抗，洗膜，加入二抗，洗膜，室溫孵育，所有操作均嚴格按照試劑盒說明書進行，以目的條帶的灰度值代表Rho、ROCK1蛋白的相對表達量，實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.5 小鼠子宮NJ平滑肌細胞、NJ上皮細胞、NJ間質(zhì)細胞、NG上皮細胞、NG間質(zhì)細胞ROCK1蛋白檢測 采用免疫組化法檢測兩組小鼠子宮NJ平滑肌細胞、NJ上皮細胞、NJ間質(zhì)細胞、NG上皮細胞、NG間質(zhì)細胞ROCK1蛋白。取兩組子宮組織，石蠟切片脫蠟處理，3%H2O2室溫孵育，蒸餾水沖洗，PBS 浸泡，封閉，加一抗 孵育，PBS沖洗，滴加二抗，孵育，PBS 沖洗，滴加適量的辣根酶工作液，孵育，顯色，PBS沖洗，自來水充分沖洗，復(fù)染，脫水，透明，封片。利用 BI-2000系統(tǒng)，在光鏡下( 10×20倍)選取相同部位相同視野照相分析，計算每個視野陽性染色的平均光密度OD值。重復(fù)3 次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 兩組小鼠子宮組織內(nèi)膜浸潤程度比較 空白組子宮組織無內(nèi)膜浸潤，模型組AM病灶輕度、中度、重度浸潤分別為8、12、6例。

2.2 兩組小鼠子宮組織Rho、ROCK1蛋白相對表達量比較 模型組、空白組子宮組織Rho相對表達量分別為0.442±0.094、0.109±0.073，二者比較，P<0.01；模型組、空白組子宮組織ROCK1相對表達量分別為1.554±0.079、0.079±0.006，二者比較，P<0.01。

2.3 兩組小鼠子宮NJ平滑肌細胞、NJ上皮細胞、NJ間質(zhì)細胞、NG上皮細胞、NG間質(zhì)細胞ROCK1蛋白表達比較 結(jié)果見表1。

表1 兩組小鼠子宮NJ平滑肌細胞、NJ上皮細胞、NJ間質(zhì)細胞、NG上皮細胞、NG間質(zhì)細胞ROCK1蛋白OD值比較

注：與空白組比較，＊P<0.05；與模型組NJ上皮細胞、NJ間質(zhì)細胞比較，#P<0.05；與模型組NJ上皮細胞比較，&P<0.05。

2.4 不同浸潤深度的AM小鼠NJ平滑肌細胞、NJ上皮細胞、NJ間質(zhì)細胞、NG上皮細胞、NG間質(zhì)細胞ROCK1蛋白OD值比較 結(jié)果見表2。

2.5 AM小鼠子宮NJ上皮細胞、NJ間質(zhì)細胞、NG上皮細胞、NG間質(zhì)細胞ROCK1蛋白表達相關(guān)性 AM小鼠子宮NJ上皮細胞、NG上皮細胞ROCK1蛋白表達呈正相關(guān)(r=0.913,P<0.05);AM小鼠子宮NJ上皮細胞、NJ間質(zhì)細胞ROCK1蛋白表達呈正相關(guān)(r=0.893,P<0.05);AM小鼠子宮NG上皮細胞、NG間質(zhì)細胞ROCK1蛋白表達呈正相關(guān)(r=0.866,P<0.05);AM小鼠子宮NG間質(zhì)細胞、NJ間質(zhì)細胞ROCK1蛋白表達呈正相關(guān)(r=0.897,P<0.05)。

表2 不同浸潤深度的AM小鼠NJ平滑肌細胞、NJ上皮細胞、NJ間質(zhì)細胞、NG上皮細胞、NG間質(zhì)細胞ROCK1蛋白OD值比較

注：與無浸潤比較，＊P<0.05；與重度浸潤比較，#P<0.05。

3 討論

目前常規(guī)內(nèi)分泌治療及手術(shù)治療AM不良反應(yīng)較大，尤其不適合有生育要求的女性。AM具有侵襲性、轉(zhuǎn)移性等特點?，F(xiàn)有研究已證實，腫瘤細胞的遷移和侵襲需要細胞骨架的重新排列。參與細胞骨架結(jié)構(gòu)形成的肌動蛋白絲、微管和中間絲，如應(yīng)力纖維和假足，可促進腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力的提高。Rho和ROCK1信號通路參與了細胞骨架的調(diào)控[4]。ROCK1可提升細胞骨架中肌球蛋白輕鏈(myosin light chain，MLC)的磷酸化水平，增加肌動-肌球蛋白的收縮力，為細胞遷移提供持續(xù)運動的動力，促使細胞的遷移能力提高。ROCK1通路參與了從靜態(tài)到遷移細胞行為的轉(zhuǎn)變，ROCK1信號調(diào)控細胞骨架影響腫瘤遷移細胞骨架的機制已在卵巢癌[3]、乳腺癌[5]、胰腺癌[6]、肺腺癌細胞[7]等腫瘤細胞中得以證實。本實驗結(jié)果顯示，AM小鼠子宮組織Rho與ROCK1的表達水平升高，與現(xiàn)有的研究結(jié)果一致[8]。進一步研究表明，不同部位的ROCK1表達在輕度浸潤組、中度浸潤組及重度浸潤組間存在顯著差異。研究[9]亦證實，ROCK1在中重度痛經(jīng)AM患者中顯著升高，該結(jié)果表明ROCK1的高表達可通過調(diào)節(jié)細胞骨架、增強細胞遷移能力從而顯著增強AM的浸潤能力，導(dǎo)致相關(guān)臨床癥狀發(fā)生。

子宮內(nèi)膜異位癥、AM起源于基底層的子宮內(nèi)膜，大部分研究關(guān)注基底層子宮內(nèi)膜的特性，子宮腺肌病患者功能層和基底層子宮內(nèi)膜在激素表達及其受體表達方面確證存在明顯的生物學(xué)差異[10]。但現(xiàn)有研究[11]也逐漸認識到，AM的侵襲性并不是由單一的基底層細胞遷移機制驅(qū)動的，而是由組織損傷和修復(fù)機制的介入及細胞化生造成的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變(epithelial-mesenchy mal transition, EMT)兩個過程的時間依賴組合驅(qū)動。同時，本實驗表明，不同組別ROCK1的表達變化并不局限在基底層，基底層內(nèi)膜及功能層內(nèi)膜并無無顯著差異，該結(jié)果證實，內(nèi)膜侵襲能力的形成不僅發(fā)生在基底層，功能層內(nèi)膜的功能異常也參與其中，考慮遠離基底層的功能層子宮內(nèi)膜會出現(xiàn)周期性的內(nèi)膜剝脫與修復(fù)過程。因此，ROCK1上調(diào)的發(fā)生機制部分可能與內(nèi)膜功能層組織持續(xù)損傷與修復(fù)機制的異常有關(guān)。

EMT是指上皮細胞在特定的生理和病理情況下向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)分化的現(xiàn)象。在EMT過程中,上皮細胞失去細胞極性,喪失細胞間緊密連接和粘附連接,獲得了浸潤性和游走遷移能力,變成了具有間質(zhì)細胞功能和特性的細胞。EMT在腫瘤中賦予細胞遷移、浸潤的能力。而AM的內(nèi)膜細胞的侵入過程與這一過程非常相似,EMT現(xiàn)在已經(jīng)被證實通過促進侵襲和纖維發(fā)生參與了子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)展[12]。人結(jié)直腸癌HCT116細胞中，Rho鳥嘌呤核苷酸交換因子以一種依賴EMT狀態(tài)的方式上調(diào)，并通過激活Rho/ROCK1通路促進細胞遷移[13]。本實驗結(jié)果表明無論在NJ層或內(nèi)膜功能層，ROCK1的表達上皮細胞顯著高于間質(zhì)細胞，間質(zhì)細胞與上皮細胞表達具有顯著相關(guān)性。該結(jié)果證實，上皮及間質(zhì)細胞在調(diào)節(jié)細胞骨架重排列、從而導(dǎo)致內(nèi)膜侵襲能力的異常增強中有相似的作用，推測與AM發(fā)生機制中存在EMT[14]、上皮細胞與間質(zhì)細胞具有部分同源性有關(guān)。

綜上所述，AM小鼠子宮組織Rho、ROCK1高表達，子宮NJ、NG不同細胞ROCK1蛋白均呈高表達。子宮不同部位上皮細胞ROCK1蛋白的表達與間質(zhì)表達呈正相關(guān)，ROCK1蛋白高表達與AM的侵襲能力相關(guān)。Rho/ROCK1通路與AM侵襲能力相關(guān)，AM的發(fā)生機制并不僅僅局限于內(nèi)膜基底層，同時與內(nèi)膜功能層的損傷與修復(fù)機制的異常介入有關(guān)。AM發(fā)生時，上皮細胞、間質(zhì)細胞及平滑肌細胞內(nèi)ROCK1的表達同步上調(diào)，可能與因EMT而產(chǎn)生的細胞同源性有關(guān)，尚待進一步的研究。