羅燕軍，黃娟，許慧

(湖北省婦幼保健院，武漢430070)

圍生期缺氧缺血性腦損傷(hypoxic -ischemic brain damage，HIBD)是導(dǎo)致圍生期小兒死亡、神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥的主要原因之一。HIBD相關(guān)腦性癱瘓(cerebral palsy，CP)的發(fā)病率可達(dá)0.2%～0.3%[1,2]。CP患兒除運動障礙和姿勢異常外，多伴有喂養(yǎng)困難、營養(yǎng)不良、胃食管反流、慢性便秘或與反復(fù)腹瀉交替等胃腸道問題[3]；若積極改善胃腸功能和營養(yǎng)狀態(tài)，患兒粗大運動功能等可隨之改善[4，5]。D-乳酸(D-LA)是大腸桿菌等腸道菌群的代謝產(chǎn)物，血漿D-LA水平可部分反映胃腸道通透性和腸黏膜屏障功能的改變。腸脂肪酸結(jié)合蛋白(iFABP)可參與對長鏈脂肪酸等的攝取和運輸；正常情況下，周圍血中無法檢測到iFABP。絨毛高度、隱窩深度是衡量小腸消化吸收的重要指標(biāo)。機(jī)械屏障是腸黏膜屏障的主要組成成分[6，7]，由完整的腸黏膜上皮細(xì)胞及黏膜上皮細(xì)胞間的緊密連接構(gòu)成。緊密連接主要是由跨膜蛋白 Occludin、緊密連接蛋白 ZO-1等組成，僅容許離子和小分子可溶性物質(zhì)通過，避免大分子物質(zhì)與微生物通過。腸屏障功能損傷可導(dǎo)致腸道低程度炎癥持續(xù)存在，腸內(nèi)毒素、致病微生物、過敏原等易于通過受損腸黏膜進(jìn)入體內(nèi)。目前，緊密連接蛋白在CP患兒腸屏障功能障礙中的作用機(jī)制尚未見報道。2018年3～5月，我們觀察了HIBD模型大鼠小腸黏膜屏障功能的變化，并探討其可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑與儀器 7日齡SD大鼠共90只，體質(zhì)量9～16 g。由武漢大學(xué)實驗動物中心提供[生產(chǎn)許可證號為SCXK(鄂)2008-0004]。所有大鼠均分籠飼養(yǎng)于武漢大學(xué)實驗動物中心，保持適宜環(huán)境溫度為20～22 ℃；相對濕度為50%～70%，清潔安靜。濃縮型正常山羊血清(封閉)(武漢博士德生物工程有限公司)；Occludin, ZO-1(一抗，美國 Invitrogen 公司)；熒光(Cy3)標(biāo)記羊抗兔IgG(武漢博士德生物工程有限公司)；D-乳酸、腸脂肪酸結(jié)合蛋白ELISA 試劑盒(Biovision公司)。

1.2 SD大鼠分組及HIBD模型制備 取90只大鼠，按隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分成正常組、假手術(shù)組和模型組，每組30只。模型組大鼠采用Rice等[8]方法制備HIBD模型：給予大鼠6%水合氯醛5 mL/kg腹腔注射麻醉；頸正中切口，分離左側(cè)頸總動脈后行雙重結(jié)扎；從雙重結(jié)扎線中間剪斷頸總動脈；縫合頸正中切口；術(shù)后2～3 h，將模型大鼠置于39 ℃恒溫密閉缺氧箱中，向缺氧箱中持續(xù)通入8% O2+92% N2的混合氣體，氣流量 1 L/min，維持2.5 h。假手術(shù)組大鼠予頸總動脈分離后并不結(jié)扎，直接縫合切口且不做缺氧處理。正常組大鼠不予手術(shù)、缺氧處理。實驗期間不限制飲水量，以普通干飼料喂養(yǎng)。造模第1天取模型組大鼠3只，處死后分別取大腦皮層及海馬、紋狀體、丘腦組織，HE染色后，鏡下觀察大腦皮層及海馬、紋狀體、丘腦神經(jīng)細(xì)胞損傷/梗死情況，進(jìn)一步確定HIBD造模成功。所有實驗操作都符合湖北省動物倫理管理委員會的操作規(guī)則。

1.3 各組大鼠眼球血清D-LA、iFABP檢測 采用ELISA 法。分別于造模第1、7、21天取三組大鼠各10只，摘除眼球取血，以EDTA 抗凝，4 ℃，500 × g 離心 5 min，取血清，ELISA 法[11]檢測各組大鼠眼球血清D-LA、iFABP，所有操作均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。重復(fù)3次，取平均值。

1.4 各組大鼠小腸黏膜小腸絨毛高度和隱窩深度觀察 取血后處死大鼠，取回腸末端腸段，10%中性甲醛溶液固定，脫水、透明，包埋，切片，H-E染色后顯微鏡下觀察并記錄小腸絨毛高度和隱窩深度。重復(fù)3次，取平均值。

1.5 各組大鼠回腸末端緊密連接蛋白Occludin、ZO-1檢測 采用免疫熒光染色[12]法。取大鼠回腸末端腸段8～10 cm，按免疫熒光染色試劑盒說明書進(jìn)行操作。在激光共聚焦顯微鏡下(× 400倍)觀察并采集圖像，測定積分光密度值(integrated optical density, IOD值),以IOD值代表Occludin、ZO-1的相對表達(dá)量。重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

實驗期間，正常組和假手術(shù)組大鼠均毛色白潤，食欲好，反應(yīng)靈敏，體質(zhì)量增加良好，大小便正常，未出現(xiàn)死亡。HIBD組存活大鼠皮毛松弛，毛色無光澤，精神萎靡，反應(yīng)遲鈍，活動量少，進(jìn)食量較少，腹瀉和便秘多交替出現(xiàn)，體質(zhì)量增長速度較緩慢。

造模第1天，采用斜坡實驗、懸吊實驗[9，10]評價三組大鼠神經(jīng)行為各組大鼠神經(jīng)行為觀察，與正常組、空白組比較，HIBD 組大鼠斜坡實驗時間短、懸吊實驗評分高(P均<0.05，表明HIBD大鼠的肌力和協(xié)調(diào)能力明顯下降，提示HIBD造模成功。

2.1 三組大鼠眼球血清D-LA、iFABP水平比較 造模第1、7、21天三組大鼠眼球血清D-LA、iFABP水平比較見表1。 與正常組、假手術(shù)組比較，造模第1、7、21天HIBD 組眼球血清D-LA、iFABP水平均升高(P均<0.05).HIBD組造模各時點眼球血清D-LA、iFABP水平間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。

表1 造模第1、7、21天三組大鼠眼球血清D-LA、iFABP水平比較

注：與正常組、假手術(shù)組比較，aP<0.05。

2.2 三組大鼠小腸黏膜小腸絨毛高度和隱窩深度比較 各時間點處死大鼠，正常組和假手術(shù)組大鼠腸管呈粉紅色，蠕動正常，無黏連、水腫及擴(kuò)張；HIBD組大鼠腸管多呈鮮紅色，蠕動慢，部分腸段明顯擴(kuò)張，腸黏膜組織質(zhì)地脆，漿膜充血、水腫，部分大鼠腹腔內(nèi)有少量腹水。

HE染色光鏡下觀察，正常組和假手術(shù)組大鼠小腸細(xì)胞形態(tài)正常，絨毛結(jié)構(gòu)完整、排列整齊；HIBD組大鼠腸組織有不同程度損傷表現(xiàn)，部分絨毛脫落、變粗，甚至倒伏、斷裂,間質(zhì)和固有層水腫，絨毛頂端上皮細(xì)胞變性壞死。三組大鼠小腸絨毛高度和隱窩深度比較見表2。

表2 造模第1、7、21天三組大鼠小腸絨毛高度和隱窩深度比較

注：與正常組、假手術(shù)組比較，aP<0.05。

2.3 三組大鼠回腸末端Occludin、ZO-1的IOD值比較 造模第1、7、21天各組腸黏膜組織切片免疫熒光均可見Occludin、ZO-1陽性細(xì)胞(熒光呈紅色)，位于腸絨毛表面。正常組和假手術(shù)組大鼠小腸絨毛表面Occludin、ZO-1線性分布，連續(xù)表達(dá)。HIBD組大鼠腸絨毛表面Occludin、ZO-1線性熒光結(jié)構(gòu)紊亂、斷裂，強(qiáng)度減弱，結(jié)構(gòu)模糊。造模第1、7、21天三組大鼠回腸末端Occludin、ZO-1的IOD值比較見表3。與正常組、假手術(shù)組比較，造模第1、7、21天HIBD 組大鼠回腸末端Occludin、ZO-1的IOD值均降低(P均<0.05).HIBD組造模各時點大鼠回腸末端Occludin、ZO-1的IOD值間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。

表3 造模第1、7、21天三組大鼠回腸末端Occludin、ZO-1的IOD值比較

注：與正常組、假手術(shù)組比較，aP<0.05。

3 討論

我國圍生期兒童CP的發(fā)病率達(dá)2‰～5‰，這類患兒常出現(xiàn)喂養(yǎng)困難、嘔吐、腹脹、消化不良等消化道不良反應(yīng)，并可進(jìn)一步導(dǎo)致營養(yǎng)不良、吸入性肺炎、膿毒血癥和多臟器功能衰竭等并發(fā)癥[13]。因此，探討CP消化系統(tǒng)功能變化及其機(jī)制，以采取相應(yīng)措施改善患兒消化系統(tǒng)功能和營養(yǎng)不良，對提高CP預(yù)后具有積極的意義。HIBD模型是研究CP的常用模型，該方法造模成功率高，操作簡單，死亡率較低。尼氏染色見模型大鼠大腦皮層及海馬、紋狀體、丘腦神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)損傷/梗死的病理改變，同時術(shù)后神經(jīng)行為學(xué)檢查顯示，模型組大鼠存在明顯異常，提示造模成功。懸吊試驗和斜坡試驗均是HIBD模型大鼠常用的神經(jīng)行為學(xué)測試方法[9，10]。懸吊試驗反映大鼠的肌肉力量，斜坡試驗則反映大鼠身體的協(xié)調(diào)能力。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分未隨術(shù)后時間的推移而明顯改善，說明本模型神經(jīng)系統(tǒng)損傷持續(xù)存在，模型穩(wěn)定。模型大鼠食欲差、體質(zhì)量增長緩慢；模型大鼠小腸黏膜、漿膜等存在充血水腫、腸蠕動減少等改變，提示存在胃腸道功能障礙。

腸組織HE染色可見HIBD大鼠小腸黏膜絨毛上皮細(xì)胞變性壞死，腸絨毛高度、隱窩深度均明顯降低。正常的小腸絨毛結(jié)構(gòu)是營養(yǎng)物質(zhì)消化與吸收的前提，作為小腸絨毛的基本結(jié)構(gòu)，絨毛高度、隱窩深度是衡量小腸消化吸收的重要指標(biāo)[14]。隱窩底部的干細(xì)胞不斷分化，以補(bǔ)充黏膜上皮的正常脫落；而隱窩深度體現(xiàn)腸黏膜上皮細(xì)胞的新生能力，隱窩變淺提示腸黏膜上皮細(xì)胞成熟率上升，腸黏膜更新緩慢。本組模型大鼠腸絨毛萎縮、隱窩變淺，且未隨術(shù)后時間延長而有所改善，提示HIBD大鼠持續(xù)存在消化吸收功能降低，腸絨毛更新緩慢。這些變化有助于解釋CP兒童常存在營養(yǎng)不良。

D-LA是腸道固有菌群如大腸桿菌、乳桿菌等的代謝產(chǎn)物，人類正常組織并不生成D-LA，而缺乏D-LA脫氫酶，無法將其快速代謝，血漿D-LA水平可部分反映胃腸道通透性和腸黏膜屏障功能的改變[7]。iFABP僅存于哺乳動物的胃腸道，主要位于小腸黏膜上皮細(xì)胞胞質(zhì)中，具有較好的器官特異性，參與小腸對長鏈脂肪酸等的攝取和運輸；正常情況下，周圍血中無法檢測到iFABP[11]。但當(dāng)腸黏膜通透性增加時，iFABP釋放，進(jìn)入血液循環(huán)，周圍血中可檢測出iFABP。因此，血漿iFABP水平可以反應(yīng)腸黏膜上皮細(xì)胞破壞的程度，且升高時間早于D-LA，不受進(jìn)食狀態(tài)、腸道菌群過度繁殖等的影響，可作為腸黏膜損害早期診斷特異而敏感的血清標(biāo)志物。模型組大鼠血清D-乳酸、iFABP水平明顯升高，提示HIBD大鼠存在小腸屏障功能異常。模型組大鼠血清D-乳酸、iFABP水平未隨術(shù)后時間延長而降低，提示HIBD大鼠小腸屏障功能障礙難以自行逆轉(zhuǎn)，需要進(jìn)行積極臨床干預(yù)。

腸黏膜上皮細(xì)胞、細(xì)胞間緊密連接和細(xì)胞骨架蛋白等構(gòu)成了腸道機(jī)械屏障，上皮細(xì)胞間緊密連接主要是由跨膜蛋白 Occludin、緊密連接蛋白 ZO-1等組成的復(fù)合體構(gòu)成，并位于緊密連接的頂端。細(xì)胞間緊密連接結(jié)構(gòu)破壞可引起細(xì)胞間隙擴(kuò)大，最終引起腸黏膜屏障功能障礙[15]。本研究中正常組和假手術(shù)組大鼠小腸黏膜表面Occludin、ZO-1呈連續(xù)線性表達(dá)；HIBD模型組大鼠小腸黏膜表面Occludin、ZO-1線性結(jié)構(gòu)紊亂，Occludin、ZO-1表達(dá)量減少，且與大鼠血清D-乳酸、iFABP水平以及小腸絨毛高度、隱窩深度研究結(jié)果一致，表明HIBD后小腸屏障功能障礙的發(fā)生與小腸黏膜結(jié)構(gòu)破壞及更新緩慢相關(guān)，且小腸黏膜屏障功能損傷后難以自行修復(fù)。

綜上所述，HIBD大鼠眼球血清D-LA、iFABP水平升高，回腸末端腸絨毛高度和隱窩深度降低，HIBD大鼠存在小腸屏障功能障礙，伴隨小腸黏膜絨毛、隱窩結(jié)構(gòu)破壞，Occludin、ZO-1蛋白表達(dá)減少，且難以自行逆轉(zhuǎn)。改善小腸黏膜屏障功能可能有助于改善CP患兒營養(yǎng)不良，促進(jìn)患兒康復(fù)。