陳盈盈，李曉琴，劉春玲

(新疆醫(yī)科大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院(附屬腫瘤醫(yī)院)，烏魯木齊 830011)

根據(jù)國(guó)際癌癥研究署2018年發(fā)布的全球癌癥統(tǒng)計(jì)資料顯示，當(dāng)今世界肺癌仍然是發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅人類的生命安全[1]。Hh信號(hào)通路發(fā)現(xiàn)以來，不僅在調(diào)控人類胚胎發(fā)育和干細(xì)胞的分化中至關(guān)重要，而且和惡性腫瘤密切相關(guān)，其在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)演化中起重要作用[2～4]。GLI3蛋白作為通路下游轉(zhuǎn)錄因子GLI蛋白家族中的一員，具備雙向調(diào)節(jié)功能[5]，在Hh信號(hào)通路中的作用十分關(guān)鍵，但目前罕有關(guān)于GLI3蛋白NSCLC的研究。本研究通過觀察NSCLC組織中GlI3蛋白的表達(dá)變化，分析GLI3蛋白表達(dá)與NSCLC臨床病理參數(shù)、預(yù)后的關(guān)系，并探討其意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2013年1～12月新疆醫(yī)科大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院(附屬腫瘤醫(yī)院)收治的NSCLC患者82例，男56例，女26例；年齡39～75歲，中位年齡62.5歲；有吸煙史26例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移35例；瘤體>3 cm 38例；TNM分期Ⅰ～Ⅱ期46例，ⅢA期36例；病理類型：腺癌43例，鱗癌39例。手術(shù)留取NSCLC組織82例份及癌旁組織(距腫瘤組織5 cm以外)各82例份。所有組織樣本取下后立即液氮冷凍，隨后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存。

1.2 NSCLC及癌旁組織中GLI3蛋白檢測(cè)方法 采用免疫組化法。選取NSCLC及配對(duì)的癌旁石蠟組織標(biāo)本各82例份。以4 μm厚度為基準(zhǔn)連續(xù)切片，60 ℃下烤片3 h，浸泡二甲苯、過梯度酒精脫蠟(依次順序?yàn)?00%-100%-95%-95%-90%-80%-70%)、入去離子水水化；修復(fù)組織抗原后，使用免疫組化油筆圈住組織，經(jīng)3%過氧化氫去離子水孵育10 min，再分3次置入磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中；后吸除多余PBS液，即刻滴入第一抗體，入37 ℃恒溫箱孵育1 h，待孵育完成后，使用吸水紙吸去多余一抗，再次使用PBS液沖洗3次同上；擦干多余PBS液，滴加二抗，室溫下孵育30 min，重復(fù)上法PBS中浸洗3次，每缸仍為5 min；擦干切片，置入新鮮配置的DAB顯色液中顯色，清水沖洗后入蘇木素染色液中復(fù)染1 min，浸溫水返藍(lán)；依次過梯度酒精脫水(順序?yàn)?0%-80%-90%-95%-95%-100%-100%)，依次浸泡缸2缸二甲苯透明，封片。光鏡下觀察結(jié)果。以同一條件下染色的陽(yáng)性顆粒作陽(yáng)性對(duì)照組，用PBS代替一抗作陰性對(duì)照組。免疫組化結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：GLI3蛋白主要定位在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，當(dāng)出現(xiàn)淡黃色至深褐色為陽(yáng)性細(xì)胞，在目標(biāo)表達(dá)部位染色后，采用染色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)相結(jié)合的二級(jí)計(jì)分法進(jìn)行評(píng)分，染色強(qiáng)度無計(jì)0分、淡黃色計(jì)1分、黃褐色計(jì)2分、深褐色計(jì)3分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為10%計(jì)0分、10%～25%計(jì)1分、26%～50%計(jì)2分、51%～100%計(jì)3分，兩者相乘，<6分為低表達(dá)，>6分為高表達(dá)[6]。

1.3 患者預(yù)后隨訪 采用查閱患者門診復(fù)查和住院復(fù)查資料，以及電話、短信、微信、電子郵箱等方式進(jìn)行隨訪。依據(jù)NSCLC指南和診療規(guī)范，術(shù)后第1年內(nèi)，無臨床癥狀或癥穩(wěn)定的患者，每3個(gè)月行1次門診或住院檢查隨訪，此后每6個(gè)月隨訪復(fù)查1次。隨訪至隨訪時(shí)間結(jié)束或患者死亡，失訪者隨訪時(shí)間按截尾數(shù)據(jù)處理。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS24.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC及癌旁組織中GLI3蛋白表達(dá)比較 NSCLC及癌旁組織中GLI3蛋白高表達(dá)者分別為49例(59.8%)、31例(37.8%)，兩者比較，P<0.05。

2.2 GLI3蛋白高表達(dá)與NSCLC臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系 結(jié)果見表1。

表1 GLI3蛋白高表達(dá)與NSCLC臨床病理參數(shù)的關(guān)系

注：GLI3蛋白高表達(dá)與NSCLC腫瘤直徑及腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均<0.05)。

2.3 NSCLC組織中GLI3蛋白表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系 根據(jù)GLI3蛋白表達(dá)水平將NSCLC患者分為高表達(dá)者(49例)及低表達(dá)者(33例)，中位生存時(shí)間分別為50個(gè)月、57個(gè)月，兩者比較，P<0.05。

3 討論

近年隨著醫(yī)療水平的進(jìn)步，肺癌的總體生存期有了一定程度的提高，但是預(yù)后仍然不夠理想，個(gè)體化差異太大，5年生存率為4%～18%[1]，整體預(yù)后仍待改善。隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展及其在腫瘤學(xué)領(lǐng)域的不斷應(yīng)用，腫瘤的研究早已進(jìn)入了基因分子水平。Hh信號(hào)通路因其在機(jī)體調(diào)控的廣泛作用和疾病中異常改變，吸引了無數(shù)研究者的關(guān)注。在脊椎動(dòng)物中，HH信號(hào)通路的主要組成結(jié)構(gòu)有作為配體的三個(gè)同源Hh分泌蛋白(SHH、DHH、IHH)及分布于靶細(xì)胞膜上的受體Smo蛋白和轉(zhuǎn)錄因子GLI蛋白家族等[7]。果蠅在Hh信號(hào)通路中只有一個(gè)GLI轉(zhuǎn)錄因子的同源基因(Ci)，而在生命架構(gòu)更高級(jí)的脊椎動(dòng)物中，GLI蛋白家族有3個(gè)成員(GLI1、GLI2和GLI3)[8]。近年研究揭示，GLI蛋白不僅參與Hh信號(hào)傳導(dǎo)，而且與肺惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如在小細(xì)胞肺癌中，常常伴有GLI蛋白的異常激活[9]；GLI1和GLI2則可介導(dǎo)NSCLC癌細(xì)胞的增殖、凋亡及耐藥等機(jī)制的發(fā)生[1,11]；但作為Hh-GLI信號(hào)通路中的主要傳導(dǎo)介質(zhì)，GLI3蛋白在NSCLC的研究尚淺。2010年白曉燕等[12]曾闡述，GLI3在NSCLC組織中的表達(dá)水平高于正常組織，但迄今為止，關(guān)于GLI3蛋白在NSCLC中的表達(dá)差異及與NSCLC臨床病理參數(shù)、患者預(yù)后關(guān)系的研究仍不充分。

Steg等[13]發(fā)現(xiàn)，在胰腺癌中，應(yīng)用siRNA干擾GLI3蛋白的表達(dá)，可減弱癌細(xì)胞的活力；Trnski[14]則發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用氯化鉀抑制糖原合成酶激酶-3β，可以促進(jìn)GLI3蛋白加工成抑制形態(tài)和減少直腸癌細(xì)胞增殖，并可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；此外在急性髓性白血病中，有學(xué)者通過降低GLI3蛋白抑制區(qū)活性，發(fā)現(xiàn)可以阻止腫瘤細(xì)胞增殖[15]。鐘文等[16]應(yīng)用siGLI3干擾GLI3蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)GLI3蛋白的表達(dá)能促進(jìn)癌細(xì)胞遷移；Fu等[17]進(jìn)行的功能實(shí)驗(yàn)表明，GLI3蛋白甲基化在體外和體內(nèi)有助于NSCLC中的腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。因此，我們可以推測(cè)，GLI3蛋白在部分腫瘤中呈高表達(dá)，且可通過調(diào)控GLI3蛋白的活性，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展；并且在NSCLC中，GLI3蛋白可能存在有2種不同的調(diào)控機(jī)制和作用方式。本研究顯示，NSCLC癌組織中GLI3蛋白表達(dá)水平高于癌旁組織。

腫瘤體積大小是腫瘤TNM分期的重要決定因素，轉(zhuǎn)移則一直以來被認(rèn)為是腫瘤導(dǎo)致患者死亡的主要因素，而其中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是NSCLC患者最常見也是最主要的轉(zhuǎn)移方式，是顯著影響其臨床預(yù)后的重要因素[18]。Popper等[19]發(fā)現(xiàn)，腫瘤通過淋巴路徑的轉(zhuǎn)移相比較血行擴(kuò)散，通常需要更長(zhǎng)的時(shí)間才會(huì)出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。Ye等[20]最近的一項(xiàng)研究表明，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與NSCLC患者的長(zhǎng)期癌癥特異性存活率(CSS)相關(guān)。此外還有許多研究已證實(shí)，腫瘤直徑和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間密切相關(guān)，如Rami-Porta等[21]進(jìn)行的大量數(shù)據(jù)的研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤體積越大越大，NSCLC患者的5年生存率越小，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率越高，并隨著腫瘤向肺周圍組織轉(zhuǎn)移的程度而增加，生存惡化的趨勢(shì)越顯著。故尋找能可靠預(yù)測(cè)患者腫瘤轉(zhuǎn)移的因素，是研究者期望解決的難題。Armas等[22]研究發(fā)現(xiàn)，在惡性腫瘤的早期階段，GLI3蛋白在HH-GLI通路中優(yōu)先表達(dá)。本研究顯示，NSCLC組織GLI3蛋白高表達(dá)主要與患者的腫瘤直徑及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，可以預(yù)測(cè)GLI3蛋白可能是腫瘤增殖發(fā)育旺盛和轉(zhuǎn)移傾向明顯的一個(gè)潛在標(biāo)志物。

盡管胚胎期GLl3主要在Hh信號(hào)通路起負(fù)調(diào)控作用[23]，但本研究顯示，GLI3蛋白的高表達(dá)是NSCLC患者預(yù)后生存的獨(dú)立影響因素，GLI3蛋白可通過抑制NSCLC細(xì)胞增殖分化，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力，促進(jìn)肺癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。結(jié)合Marie-Ange等[24]研究發(fā)現(xiàn)，GLI3蛋白通過增加細(xì)血管密度，促進(jìn)腫瘤病情進(jìn)展。本研究顯示，GLI3蛋白表達(dá)水平高表達(dá)者中位生存時(shí)間較低表達(dá)者短。因此我們推測(cè)，GLI3蛋白對(duì)NSCLC病情的發(fā)展具有重要的促進(jìn)作用，但是其具體作用方式還需進(jìn)一步的研究，同時(shí)GLl3對(duì)NSCLC的影響也可能具有多種的作用形式。

總之，NSCLC組織中GLI3蛋白呈廣泛高表達(dá)狀態(tài)，且與腫瘤直徑及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，GLI3蛋白可能在NSCLC的發(fā)生發(fā)展中起一定的作用。