易紅，龍漢安，王艦梅，肖秀麗，葉入裴

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，四川瀘州 646000)

目前，浸潤性乳腺癌的治療多采用手術(shù)、化療、內(nèi)分泌治療、放療及靶向治療等綜合治療方式，但其病死率仍居高不下。DOC2/DAB2相互作用蛋白(DAB2IP)是Ras-鳥苷三磷酸酶活性蛋白(Ras-GAP) 家族的成員之一，該蛋白可參與調(diào)控細(xì)胞凋亡、血管生成、腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移，并與放療耐受、化療抵抗有密切關(guān)系[1,]。DAB2IP在尿路上皮癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌等惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中均發(fā)揮重要作用[2]。目前DAB2IP在浸潤性乳腺癌組織中的表達(dá)及對患者化療效果的影響研究較少。我們觀察了浸潤性乳腺癌組織、癌旁正常組織、發(fā)生癌轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)組織DAB2IP的表達(dá)變化，分析DAB2IP表達(dá)與浸潤性乳腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 本院2017 年1 ～12月間診治的浸潤性乳腺癌患者124例，年齡32～74(49.7±11.2)歲；均行腫瘤切除術(shù)，術(shù)中病理診斷為浸潤性乳腺癌，腫瘤直徑0.9～12(5.0±2.5)cm；WHO分級為I級3例，Ⅱ級77例，III級18例(接受新輔助化療病例不計入WHO分級)；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移40例；接受術(shù)前新輔助化療26例，治療后病理反應(yīng)評級Miller-Payne分級為1級+2級20例、3級+4級6例。術(shù)中保留患者浸潤性乳腺癌組織、癌旁正常組織、發(fā)生癌轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)組織標(biāo)本，備檢。本研究已取得患者及其家屬同意，且經(jīng)醫(yī)院倫理委員會通過。

1.2 主要試劑 兔抗人多克隆抗體DAB2IP 購自美國Abcam公司，1∶300 稀釋； 兔抗羊二抗、DAB 顯色劑購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.3 浸潤性乳腺癌、癌旁正常、發(fā)生癌轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)組織DAB2IP檢測 采用免疫組化EnVision 兩步法。取浸潤性乳腺癌組織、癌旁正常組織、發(fā)生癌轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)組織標(biāo)本，經(jīng)10%中性甲醛溶液固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，高壓修復(fù)。加入非免疫山羊血清，室溫孵育10 min。滴加一抗，4 ℃孵育過夜，滴加二抗，室溫孵育30 min。 DAB顯色，顯微鏡下控制，自來水沖洗終止顯色。蘇木素復(fù)染2 min，0.1%稀鹽酸分化，飽和碳酸鋰反藍(lán)。脫水、透明、封片。以已知陽性標(biāo)本為陽性對照。DAB2IP 蛋白表達(dá)陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)：以乳腺癌細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色至深棕色顆粒為陽性細(xì)胞。陽性細(xì)胞必須符合以下標(biāo)準(zhǔn)：①細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰；②陽性顆粒定位準(zhǔn)確；③著色明顯高于背景，對比清楚。按顯色細(xì)胞數(shù)記分為陽性細(xì)胞數(shù)<1/3計1分， 陽性細(xì)胞數(shù)1 / 3～2/3計2分，陽性細(xì)胞數(shù)≥2/3計3分。按細(xì)胞顯色深淺記分為無陽性反應(yīng)細(xì)胞計0分，淺黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計算3分。二者乘積為最終結(jié)果，0 判為-，1～2 判為+，3～4判為++，6～9判為+++。至少隨機觀察5 ～ 10 個高倍鏡視野(放大倍數(shù)為× 400)。-、+為低表達(dá)者，++、+++為高表達(dá)者。計算強陽性表達(dá)率，強陽性表達(dá)率=高表達(dá)例數(shù)/總例數(shù)×100%。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17．0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理。計數(shù)資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher精確概率法；相關(guān)性采用Spearman 相關(guān)分析法。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

浸潤性乳腺癌組織DAB2IP表達(dá)-、+、++、+++分別為56、23、18、27例，癌旁正常組織DAB2IP表達(dá)-、+、++、+++分別為8、16、32、68例，發(fā)生癌轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)組織DAB2IP表達(dá)-、+、++、+++分別為23、10、5、2例。浸潤性乳腺癌、癌旁正常、發(fā)生癌轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)組織DAB2IP強陽性表達(dá)率分別為21.8 %(27 / 124)、54.8 %(68 / 124)、5.0 %(2 / 40)，兩兩比較，P均<0.05。

浸潤性乳腺癌組織DAB2IP表達(dá)與浸潤性乳腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系見表1。浸潤性乳腺癌組織DAB2IP表達(dá)與浸潤性乳腺癌患者年齡、脈管侵犯、神經(jīng)侵犯、WHO分級均無關(guān)(P均>0.05)，與腫瘤大小(P=0.008)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.03)、HER2(P=0.004)、ki67(P=0.013)、P53(P=0.014)有關(guān)。

26例接受新輔助化療的患者中，浸潤性乳腺癌組織DAB2IP高表達(dá)6例、低表達(dá)20例。Miller-Payne分級為1級+2級者中DAB2IP高表達(dá)2例、低表達(dá)18例，3級+4級者中DAB2IP高表達(dá)4例、低表達(dá)2例。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，浸潤性乳腺癌組織DAB2IP表達(dá)與浸潤性乳腺癌新輔助化療治療后Miller-Payne分級有關(guān)(P=0.013)。

3 討論

DAB2IP是新發(fā)現(xiàn)的Ras GTP酶活性蛋白家族的成員。DAB2IP是腫瘤細(xì)胞生長，轉(zhuǎn)移和癌癥進(jìn)展的抑制因子，涉及多種生物過程的調(diào)節(jié)，包括增殖、細(xì)胞凋亡、上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)、癌癥干細(xì)胞(CSC)、自噬等等。該蛋白是多個信號通路的重要分子開關(guān)，參與細(xì)胞內(nèi)信號調(diào)控。在膀胱癌中，下調(diào)DAB2IP激活PI3K / Akt和Ras / ERK信號通路增強膀胱癌T24和5637細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力[3]。DAB2IP可同時調(diào)節(jié)PI3K-AKT和ASK1通路，影響前列腺癌細(xì)胞的存活和凋亡[4]。在結(jié)直腸癌中，轉(zhuǎn)錄復(fù)合物EZH2 / HDAC1 / Snail通過抑制DAB2IP啟動子轉(zhuǎn)錄活性及表達(dá)促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[5]。DAB2IP還可抑制NF-κB誘導(dǎo)的EMT現(xiàn)象和腫瘤干細(xì)胞的功能，從而抑制結(jié)直腸癌進(jìn)展[6]。多項研究[7,8]表明，DAB2IP還在肝癌、膽囊癌、卵巢癌、腎細(xì)胞癌等惡性腫瘤中表達(dá)下調(diào)。在前列腺癌中，DAB2IP表達(dá)受啟動子甲基化和組蛋白修飾的抑制。在乳腺癌中，DAB2IP表達(dá)可因DAB2IP啟動子區(qū)域的甲基化而降低，且DAB2IP表達(dá)降低與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，Ki-67表達(dá)升高與乳腺癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況呈正相關(guān)[9]。本研究結(jié)果顯示，DAB2IP在乳腺癌中的表達(dá)高于癌旁組織及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶，且與腫瘤大小、增殖指數(shù)Ki67及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，提示DAB2IP低表達(dá)與乳腺癌的生長、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

表1 浸潤性乳腺癌組織DAB2IP表達(dá)與浸潤性乳腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系(例)

Valentino等[10]發(fā)現(xiàn)，突變型P53通過結(jié)合并抑制細(xì)胞質(zhì)中的腫瘤抑制因子DAB2IP促進(jìn)胰島素介導(dǎo)的PI3K/AKT1的活化，同時胰島素可以與炎癥協(xié)同作用以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。抑制基因p53突變是人Her2陽性乳腺癌中最普遍的遺傳事件，突變型P53通過mutp53-HSF1-HER2正反饋環(huán)擴增HER2信號傳導(dǎo)[15]。

乳腺癌治療方法有多種，主要有手術(shù)切除、放射治療、化療、內(nèi)分泌和分子靶向治療等。其中，化療方法包括術(shù)前化療，即新輔助化療(NCT)和術(shù)后化療。因為癌細(xì)胞最終會產(chǎn)生化學(xué)抗性，因此了解癌癥化療抵抗機制至關(guān)重要。在DAB2IP敲低后，前列腺癌KD細(xì)胞表現(xiàn)出對幾種化學(xué)治療藥物的抗性，增加DAB2IP可以恢復(fù)藥物敏感性，特別是增強前列腺癌(PCa)細(xì)胞對微管穩(wěn)定藥物(紫杉醇，多西紫杉醇)和Plk1抑制劑(BI2536)的敏感性[12]。DAB2IP通過調(diào)節(jié)Wnt / β-catenin和IGF-I，抑制早期生長應(yīng)答蛋白 1-分泌型簇集素(EGR1-sCLU) 基因的表達(dá)，而 EGR1-sCLU 基因的表達(dá)與化療耐受性相關(guān)。當(dāng)敲除DAB2IP后，可增加膀胱癌細(xì)胞的集落形成，降低PARP和caspase-3的表達(dá)，增加Bcl-2和Mcl-1的表達(dá)，從而減少癌細(xì)胞的凋亡，誘導(dǎo)化療耐受[13]。另外，DAB2IP還通過與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活子3(STAT3)的相互作用影響腫瘤的化療抗性。Wu等[14]發(fā)現(xiàn)，DAB2IP通過STAT3/Twist1/P-糖蛋白信號通路，調(diào)控非肌肉浸潤性膀胱癌對吡柔比星的耐藥及腫瘤復(fù)發(fā)。此外，DAB2IP可能與抑制Slug的轉(zhuǎn)錄或激活、ABCC1等耐藥基因、CD133等干性基因的表達(dá)，來抑制胰腺癌的生長、轉(zhuǎn)移和化療抗性，從而抑制化療藥物吉西他濱的抗性，促進(jìn)對新型化療藥物鹽霉素對胰腺癌細(xì)胞的敏感性作用。在本研究中，我們也發(fā)現(xiàn)，低表達(dá)DAB2IP的組別，新輔助化療后的Miller-Payne分級低，可能與DAB2IP缺失后引起的化療抵抗相關(guān)。

綜上所述，浸潤性乳腺癌組織DAB2IP表達(dá)降低；此外，DAB2IP的表達(dá)與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、HER2、ki67及P53的表達(dá)密切相關(guān)，提示DAB2IP可能通過HER2的擴增及過度表達(dá)、P53突變參與乳腺癌生長、轉(zhuǎn)移。值得注意的是，DAB2IP缺失對化療耐受的影響在新輔助化療中得以體現(xiàn)，使得DAB2IP有望成為指導(dǎo)乳腺癌化療及判斷化療效果的新指標(biāo)，針對DAB2IP相關(guān)靶向治療在乳腺癌的治療方面具有有重要意義。