顏一丹，欒曉瑾，陳霞，謝冰，鄭倩雯，王敏，陳萬銀，喬晨，于駿，方杰

(1江蘇大學附屬醫(yī)院, 江蘇鎮(zhèn)江212001; 2江蘇大學附屬醫(yī)院 )

果蠅(Drosophila melanogaster)的生殖系統(tǒng)簡單、生命周期短、繁殖快、遺傳背景清楚，已被作為經(jīng)典模型用于研究生殖事件中復雜的遺傳背景和相關(guān)分子機制[1～4]。精子的產(chǎn)生過程主要由生殖干細胞微環(huán)境(stem cell niche)調(diào)控。生殖干細胞(germline stem cells ，GSCs)是成體干細胞(Adult Stem Cells，ASCs)的一種類型，具有自我更新及分化潛能。而干細胞穩(wěn)態(tài)維持需要生殖干細胞微環(huán)境的調(diào)控[5，6]。果蠅與哺乳動物精子的發(fā)生是一個高度保守的過程[1,6]。在果蠅睪丸的頂端，GSCs和包囊干細胞圍繞著中心細胞，GSC非對稱分裂產(chǎn)生兩個子代細胞，其中一個因靠近niche繼續(xù)維持干細胞的特性，另一個因遠離niche而發(fā)育成為精原母細胞(gonialblast，GB)，經(jīng)過有絲分裂、減數(shù)分裂，最終發(fā)育成精子[7]。UAS-Gal4系統(tǒng)是果蠅遺傳學中一種常用的異位表達系統(tǒng), 通過UAS-Gal4系統(tǒng)可調(diào)控基因表達水平的改變。有研究[4]表明,通過UAS-Gal4系統(tǒng)可以在果蠅睪丸及卵巢中進行大規(guī)模的基因篩選，揭示GSCs的自我更新和分化中存在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并且篩選鑒定出多個影響GSCs維持、分化或涉及精子、卵子發(fā)生的其他過程的基因，并進一步對這些基因進行功能注釋及解析[4,8]。在果蠅睪丸的篩選中，鑒定到一批與蛋白合成和降解相關(guān)且參與生殖干細胞微環(huán)境的調(diào)控因子[2]，其中一個調(diào)控因子是CG5844。CG5844基因為果蠅睪丸GSC調(diào)節(jié)因子。研究[2]表明，參與mRNA剪接和翻譯—蛋白質(zhì)合成的一組基因有助于GSCs自我更新維持和早期生殖細胞分化。真核細胞mRNA剪接由一個巨大的、動態(tài)的復合物—剪切體完成，剪接體組分(U2A)可編碼U2小核糖核蛋白顆粒(snRNP)的組成蛋白，它作為一種主要的剪接體亞基，與前體mRNA上的其他snRNP結(jié)合以組裝剪接體。目前有研究顯示，果蠅睪丸生殖細胞中U2A的缺乏將導致精原細胞無法分化為精母細胞和成熟的精子，最終影響雄性果蠅的生育能力[3]。目前關(guān)于CG5844基因在果蠅S2胚胎細胞中的功能及作用機制尚未被闡明。2017年12月～2018年12月，我們觀察了沉默、過表達CG5844基因的果蠅S2胚胎細胞中的U2A表達變化，旨在探索CG5844基因在S2細胞中調(diào)控剪接體功能的機理，為果蠅生殖干細胞發(fā)生的潛在機制提供新的思路。

1 材料與方法

1．1 細胞、試劑及儀器 S2細胞購自于果蠅基因組學資源中心。攜帶有FAM熒光標記的小干擾RNA(FAM-siRNA)由蘇州吉瑪基因公司設(shè)計和合成。質(zhì)粒CG5844、載體pUAS-attB、大腸桿菌DH5α均由本實驗室保存。限制性內(nèi)切酶、反轉(zhuǎn)錄酶、Taq 酶、TRIzol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自日本Takara公司；DNA凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒小抽試劑盒均購于美國Axygen公司。Lip2000脂質(zhì)體、Hoechst 33342購于美國Invitrogen公司；免疫熒光一抗：兔抗U2A抗體由南京醫(yī)科大學生殖醫(yī)學國家重點實驗室贈予，雞抗GFP 抗體購于英國Abcam公司；免疫熒光二抗：Cy3標記驢抗兔IgG抗體、Alex Fluor 488標記驢抗雞 IgG抗體購于美國Jackson公司。Effectene 轉(zhuǎn)染試劑盒購于德國Qiagen公司；DMSO購于日本SIGMA公司；DMEM培養(yǎng)基、Opti-MEM培養(yǎng)液購于美國Gibco公司；胎牛血清購于以色列Bioind公司；引物合成于上海生物工程公司。

1.2 沉默CG5844表達的S2細胞CG5844基因及U2A表達觀察

1.2.1 CG5844 siRNA敲減效率驗證 2個CG5844 siRNA片段(siCG5844-1、siCG5844-2，均可沉默CG5844表達)，取S2細胞分為A、B組，分別轉(zhuǎn)染siCG5844-1、siCG5844-2，轉(zhuǎn)染48 h后qRT-PCR法測算兩組細胞CG5844基因相對表達量，進一步計算敲減率，A、B組敲減率分別為72.12%±3.68%、52.39 %±4.82%，二者比較，P<0.001。因此本實驗選用siCG5844-1進行后續(xù)實驗。

1.2.2 S2細胞分組及 CG5844 siRNA轉(zhuǎn)染 取S2細胞分為觀察A、對照A組，復蘇細胞后，用完全培養(yǎng)基(DMEM+10%胎牛血清)進行培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境為28 ℃恒溫培養(yǎng)箱，根據(jù)細胞生長速度和狀態(tài)，及時進行細胞換液和細胞傳代，并以適當密度重新接種至新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)[9]。待細胞生長至適當密度(80%～90%)后，可進行轉(zhuǎn)染。觀察A、對照A組分別轉(zhuǎn)染siCG5844-1、空白質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染步驟如下：使用Effectene 轉(zhuǎn)染試劑盒，每孔用共計0.8 μg質(zhì)粒轉(zhuǎn)染S2細胞，用緩沖液EC將質(zhì)粒稀釋至100 μL，渦旋后在室溫下放置5 min。再加入20 μL Effectene轉(zhuǎn)染試劑室溫放置5 min，之后加入600 μL opti-MEM并混勻，此混合物為最終培養(yǎng)基。當進行敲減實驗時，使用Lipo2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染S2細胞。 首先用250 μL Opti-MEM稀釋15 μL的Lipo2000，輕混勻后室溫放置5 min，在250 μL opti-MEM中加入15 μL的siRNA，將兩管混合物充分混勻后，室溫放置20 min，使siRNA終濃度為150 nmol/L，4～6 h后更換成完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至48 h。siCG5844-1攜帶FAM熒光標記，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染48 h時免疫熒光鏡下可見綠色熒光細胞，表明轉(zhuǎn)染成功。

1.2.3 A組 S2細胞CG5844基因檢測 采用qRT-PCR法。 細胞總RNA的提取及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按照說明書進行，熒光定量PCR反應(yīng)體系在反應(yīng)管中充分混勻，短暫離心，置入安捷倫Mx3000P熒光定量PCR儀中進行反應(yīng)。GAPDH上游引物5′-GTGGTGAACGGCCAGAAGAT-3′；下游引物5′-GCCTTGTCAATGGTGGTGAA-3′。CG5844上游引物5′-TTAGCACCGACGAGAAGGAGGAG-3′；下游引物5′-AGTAGCCATTGATGCCGCACAC-3′。反應(yīng)條件為: 95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸10 s，40個循環(huán)，檢測熒光信號; 溶解曲線分析: 95 ℃ 15 s，60 ℃1 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s。以GAPDH為內(nèi)參，以2-ΔΔCt代表CG5844基因的相對表達量。實驗重復3次，取平均值。

1.2.4 A組 S2細胞U2A檢測 采用免疫熒光法。轉(zhuǎn)染24 h時取兩組細胞種板，再孵育24 h在培養(yǎng)皿中進行免疫染色，具體步驟如下：加入4%多聚甲醛200 μL固定30 min。在含有0.1%Triton X-100(PBST)的1x PBS中洗滌3次，并在5%牛血清白蛋白(BSA)中封閉30 min后，將樣品與一抗在室溫孵育1 h。之后0.1%PBST中洗滌3次，每次10 min。然后將樣品在室溫下與二抗一起孵育1 h，之后在0.1%PBST中洗滌3次。最后在封片前用Hoechst 33342染色10 min。在奧林巴斯BX51熒光正置顯微鏡上捕獲圖像并使用Adobe Photoshop CS5軟件處理。具體抗體信息如下：一抗：兔抗U2A抗體(1∶1 000稀釋)；雞抗GFP 抗體(1∶1 000稀釋)。二抗：Cy3標記驢抗兔IgG抗體(1∶1 000稀釋)；Alex Fluor 488標記驢抗雞 IgG抗體(1∶1 000稀釋)。使用Image J軟件對兩組細胞的免疫熒光強度進行分析，測算U2A的相對表達量。實驗重復3次，取平均值。

1.3 CG5844過表達的S2細胞CG5844基因及U2A表達觀察

1.3.1 pUAS-attB-CG5844重組表達載體構(gòu)建 利用Vector NT1軟件設(shè)計引物并送生物公司合成，引物序列如下：CG5844上游引物5′-ATAAGAATGCGGCCGCGATGCTTCGCAAATTTGGAGGTC-3′, 下游引物 5′-GCTCTAGACTACTTTTCGTTTGGCTTATCCTTGG-3′。PCR擴增CG5844的CDS片段，并對PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳，在紫外分析儀中切取含有目的片段的凝膠，并用DNA凝膠回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物。之后用限制性內(nèi)切酶對純化產(chǎn)物和pUAS-attB空載體進行雙酶切(37 ℃，3 h)，通過T4連接酶對以上酶切產(chǎn)物進行連接(16 ℃，1 h)，使用感受態(tài)細胞(DH5α)對連接產(chǎn)物進行轉(zhuǎn)化并涂布至帶有氨芐抗性的LB平板上倒置培養(yǎng)(37 ℃，12～16 h)。挑取單克隆后進行擴大培養(yǎng)(37 ℃，250 rpm，16 h)，并用質(zhì)粒抽提試劑盒對菌液進行抽提，之后進行雙酶切鑒定。結(jié)果顯示，質(zhì)粒被酶切成兩條帶，與DNA Marker比對發(fā)現(xiàn)，一條大于2 000 bp，另一條帶位于1 000 和2 000 bp之間，而pUAS-attB載體和CG5844片段的大小均分別位于這兩個區(qū)間，后續(xù)測序結(jié)果顯示與已知序列一致，表明本研究已正確構(gòu)建pUAS-attB-CG5844質(zhì)粒(可過表達CG5844)。

1.3.2 S2細胞分組及pUAS-attB-CG5844轉(zhuǎn)染 取S2細胞分為觀察B、對照B組，待細胞生長至適當密度(80%～90%)后，可進行轉(zhuǎn)染。觀察B、對照B組分別轉(zhuǎn)染pUAS-attB-CG5844、載體pUAS-attB。轉(zhuǎn)染步驟同“1.2.2”。轉(zhuǎn)染4～6 h后更換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至48 h。為了驗證重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染時通過Ub-Gal4驅(qū)動pUAS-attB-CG5844的同時,驅(qū)動pUAS-attB-GFP作為熒光標記，免疫熒光鏡下可見觀察B組GFP信號明顯多于對照B組說明轉(zhuǎn)染成功。

1.3.3 B組細胞CG5844基因檢測 采用qRT-PCR法。 所有操作均同“1.3.3”。以GAPDH為內(nèi)參，以2-ΔΔCt代表CG5844基因的相對表達量。實驗重復3次，取平均值。

1.3.4 B組細胞U2A檢測 采用免疫熒光法。所有操作均同“1.3.4”。使用Image J軟件對兩組細胞的免疫熒光強度進行分析，測算U2A的相對表達量。 實驗重復3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 沉默CG5844表達的S2細胞CG5844基因、U2A相對表達量比較 觀察A、對照A組CG5844基因相對表達量分別為0.29±0.04、1.0± 0，二者比較，P<0.05。觀察A、對照A組U2A相對表達量分別為11.34±0. 58、1.65±0.23，二者比較，P<0.05。見圖1。

圖1 觀察A組、對照A組U2A表達情況觀察(比例尺：30 μm)

2.2 CG5844過表達的S2細胞CG5844基因及U2A相對表達量比較 觀察B、對照B組CG5844基因相對表達量分別為18.87±2.44、1.0±0，二者比較，P<0.05。觀察B、對照B組U2A相對表達量分別為1.30±0.07、2.17±0.06 ，二者比較，P<0.05。見圖2。

圖2 觀察B組、對照B組U2A表達情況觀察(比例尺：30 μm)

3 討論

根據(jù)flybase數(shù)據(jù)庫(http://flybase.org/)結(jié)果顯示，CG5844基因在果蠅睪丸中優(yōu)勢表達，并且被發(fā)現(xiàn)為果蠅睪丸GSC調(diào)節(jié)因子。目前，關(guān)于CG5844基因的相關(guān)報道較少，且在果蠅中的生物學功能和調(diào)控機制尚不清楚，因此具有較高的創(chuàng)新性。已有的研究[10]顯示，CG5844基因可影響線粒體功能，從而參與果蠅S2胚胎細胞中缺氧誘導的蛋白翻譯的抑制。翻譯的調(diào)控在干細胞生物學的調(diào)節(jié)中具有重要作用。目前已有研究[11]報道了翻譯調(diào)節(jié)在小鼠胚胎干細胞中的重要性，其在分化期間顯示出mRNA水平和翻譯的顯著增加。

應(yīng)用RNA干擾技術(shù)特異性地敲減靶基因，已成為目前使用最為活躍及常規(guī)的分子生物學方法。而通過過表達使基因表達改變，是反向遺傳學基因功能研究的重要方法之一[12]。本實驗分別應(yīng)用RNA干擾技術(shù)和Ub-Gal4系統(tǒng)介導CG5844基因在S2細胞中的敲減及過表達，研究了CG5844基因在S2細胞中的表達及其可能調(diào)控作用，發(fā)現(xiàn)CG5844影響U2A的表達水平，提示CG5844可能通過影響剪接體，從而調(diào)控S2細胞的命運。

剪接體成分復雜，構(gòu)象高度動態(tài)，其由五個小核糖核蛋白(snRNP)復合物(U1，U2，U4，U5和U6)和大約150種蛋白組成[13]。mRNA加工所需的主要剪接體對于真核生物基因的表達必不可少，并且在疾病的發(fā)生發(fā)展中具有重要意義[14]。RNA剪接過程中剪接體組分的功能作用和逐步裝配途徑已經(jīng)得到很好的研究，RNA剪接過程由snRNP和其他剪接因子逐步相互作用催化，隨后形成剪接體復合物，稱為E，A，B，Bact和C復合物。在剪接因子SF3b1與U2輔助因子(U2AF)相互作用后，SART1預(yù)組裝tri-snRNP U4-U6 / U5被募集到A復合體，從而形成具有催化活性的剪接體?；谖㈥嚵蟹治龅难芯匡@示，SNRPA1被鑒定為關(guān)鍵的剪接體成分，其在調(diào)節(jié)人類干細胞多能性的獲得和維持中起關(guān)鍵作用[15]。Pre-mRNA募集U2 snRNP是剪接體裝配中的關(guān)鍵步驟，而U2A是U2 snRNP特異性蛋白之一，它作為一種主要的剪接體亞基，對雄性生育力至關(guān)重要。研究[3,16]顯示,U2A的人類同源基因SNRPA1在果蠅中的點突變也將導致精原細胞分化障礙，生殖細胞將無法發(fā)育成為成熟的精子。Sm蛋白是剪接體小核糖核蛋白的共同核心的重要組分, 學者Anne等[17]在對果蠅卵子發(fā)生過程中SmB分布的分析表明，精氨酸甲基化在指導SmB的亞細胞定位中有關(guān)鍵作用，并且該修飾特異性地促進了生殖細胞的形成和發(fā)育。精原母細胞在進行減數(shù)分裂形成精母細胞進而分化為成熟精子之前，將進行4次有絲分裂生成16個精原母細胞，此過程稱為轉(zhuǎn)換擴增分裂過程(Trans-Amplication，TA)。Mei-P26蛋白主要在GSC和精母細胞中高表達，一系列研究報道[11]顯示Mei-P26的表達由Bam、CCR4、Tut等共同作用調(diào)控，而它的表達與否決定了GSC是否從TA增殖階段進入分化階段, Mei-P26在生殖細胞形成和成熟過程中調(diào)控不同的發(fā)育程序，且發(fā)揮關(guān)鍵性作用。研究[18]表明，在果蠅精子形成過程中，polo基因突變體將導致嚴重的胞質(zhì)分裂缺陷，且Aurora A作為重要的細胞周期調(diào)節(jié)蛋白在此過程中也發(fā)揮不可或缺的作用。另外，果蠅boule基因突變可以導致生殖細胞發(fā)育阻滯和無精子癥，提示果蠅精子發(fā)生過程中細胞的分化需要眾多基因產(chǎn)物的協(xié)調(diào)作用[19]。目前已有研究[20～22]報道顯示，蛋白質(zhì)合成的調(diào)節(jié)對于果蠅睪丸和卵巢中GSC的自我更新至關(guān)重要。在RNAi轉(zhuǎn)基因果蠅篩選中，發(fā)現(xiàn)有9種核糖體蛋白、4種剪接體相關(guān)蛋白以及3種eIF3復合蛋白有助于GSC的干性維持和早期生殖細胞分化[2]。本實驗通過免疫熒光實驗結(jié)果分析，敲減CG5844時U2A蛋白表達水平上調(diào)。反之，在S2細胞實現(xiàn)CG5844過表達時，U2A蛋白表達水平下調(diào)，剪接體的表達受到抑制，提示CG5844與剪接體之間存在競爭性關(guān)系。

綜上所述，在S2胚胎細胞中CG5844基因可能通過調(diào)控剪接體關(guān)鍵蛋白U2A的表達，從而影響剪接體的功能，最終影響S2細胞的發(fā)育。研究CG5844基因?qū)2細胞的具體調(diào)控機制為男性不育的致病機制提供新的見解。