曾憲飛，盧東雪，張西京，李軍民

(1. 武警陜西省總隊(duì)醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西西安 710054；2. 空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院麻醉科，陜西西安 710032)

急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)是肺泡毛細(xì)血管膜損傷所致的肺臟急性炎癥過(guò)程，以彌漫性肺泡損傷、肺血管內(nèi)皮和肺泡上皮屏障破壞、肺間質(zhì)和肺泡內(nèi)蛋白滲出及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、毛細(xì)血管血栓形成等為病理特征，臨床表現(xiàn)為頑固性低氧血癥及難治性急性呼吸衰竭，病死率高達(dá)35%～50%[1]。目前缺乏特異的血清標(biāo)志物，嚴(yán)重影響了ARDS的早期診斷和及早治療，已成為其高死亡率的重要原因之一[2]。

血管生成素(angiopoietin 2, Ang-2)是內(nèi)皮激活及其功能失調(diào)和屏障破壞的潛在標(biāo)志；Ⅱ型肺泡細(xì)胞表面抗原(krebs von den lungen 6, KL-6)主要由增殖和激活的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞分泌，可能成為肺泡損傷的直接標(biāo)志物；肺表面活性蛋白D(surfactant protein D, SP-D)主要來(lái)源于肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞和下呼吸道Clara細(xì)胞，是評(píng)價(jià)氣血屏障完整性的指標(biāo)，具有肺組織特異性；血管性血友病因子(von Willebrand factor, vWF)可用于評(píng)價(jià)內(nèi)皮細(xì)胞損傷程度，也是透明膜的組份之一；白介素8(interleukin-8, IL-8)是機(jī)體炎癥反應(yīng)的重要細(xì)胞因子，主要生物學(xué)活性是趨化和激活中性粒細(xì)胞。結(jié)合ARDS肺損傷機(jī)理和病理特征，理論上上述5種蛋白或細(xì)胞因子都可能成為肺損傷標(biāo)志物。本研究主要觀察血清Ang-2、KL-6、SP-D、vWF和IL-8在ARDS中的變化，以及早期診斷和預(yù)后評(píng)價(jià)價(jià)值，擬為降低ARDS病死率提供臨床依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象采用前瞻性研究設(shè)計(jì)，連續(xù)收集2016年12月至2018年1月西京醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)中心和武警陜西省總隊(duì)醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科收治的49例ARDS患者作為研究隊(duì)列，參照“柏林定義”(2012)[3]進(jìn)行ARDS診斷和分度。以同期連續(xù)收集的50例非ARDS患者作為對(duì)照組。研究納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡18～89歲，入ICU前氧合指數(shù)>300 mmHg，簽署知情同意書；排除腫瘤、血液病、慢性腎臟疾病、自身免疫性疾病、孕婦、使用免疫抑制劑、心肺復(fù)蘇后、慢性肺部疾病致急性呼吸衰竭。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 研究方法研究對(duì)象入重癥醫(yī)學(xué)中心(科)時(shí)(T1)、診斷為ARDS時(shí)(T2)采集靜脈全血4 mL，室溫放置60 min后2 500×g離心10 min，加樣槍吸取血清-80 ℃保存。收集入選患者年齡、性別、BMI、原發(fā)疾病等基本資料，檢測(cè)并監(jiān)測(cè)血?dú)夥治?、C反應(yīng)蛋白、血常規(guī)、血生化等，記錄急性生理學(xué)與慢性健康狀況評(píng)分系統(tǒng)(APACHEⅡ)評(píng)分、Murray肺損傷評(píng)分、序貫器官衰竭評(píng)分(SOFA)。隨訪病例28 d，記錄住院時(shí)間、病死率。

通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)血清Ang-2、KL-6、SP-D、vWF、IL-8水平，檢測(cè)試劑為R&D Systems(Ang-2、SP-D)、Abcam(vWF、IL-8)和USBiological Life Sciences(KL-6)產(chǎn)品，按操作說(shuō)明書進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1 患者的臨床基本資料研究對(duì)象的基本資料見(jiàn)表1。ARDS組和非ARDS組的年齡、性別構(gòu)成、BMI、原發(fā)疾病構(gòu)成比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。ARDS組PaO2/FiO2低于非ARDS組(P<0.001)，APACHEⅡ評(píng)分、Murray肺損傷評(píng)分、SOFA評(píng)分高于非ARDS組(P<0.005)，兩組間住院時(shí)間和28 d病死率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。不同程度ARDS分別為輕度11例(22%)、中度21例(43%)、重度17例(35%)。

2.2 血清標(biāo)志物水平的變化血清標(biāo)志物在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的水平見(jiàn)表2。在T1(入科時(shí))時(shí)間點(diǎn)，ARDS組5種標(biāo)志物水平高于非ARDS組(P<0.05)。T1時(shí)間點(diǎn)和T2(診斷ARDS時(shí))時(shí)間點(diǎn)比較，ARDS組在T2的氧合指數(shù)低于T1(P<0.05)，5種標(biāo)志物水平均高于T1(P<0.05)。ARDS患者中死亡組(n=17)與存活組(n=32)比較(表3)，死亡組的Ang-2、KL-6、SP-D、IL-8水平均高于存活組(P<0.05)；但兩組間vWF水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 ARDS與非ARDS患者的臨床基本資料

Tab.1 Clinical characteristics of the ARDS and non-ARDS patients

指標(biāo)ARDS組(n=49)非ARDS組(n=50) P年齡(歲)a53.0±11.749.8±14.8 0.067男性[n(%)]36(73)31(62)0.222BMI(kg/m2)a23.6±0.7724.2±0.860.657PaO2/FiO2(mmHg)b137(79,168)385(342,435)<0.001APACHEⅡ評(píng)分a28.3±8.420.3±7.80.002Murray評(píng)分b2.3(1.7, 3.0)0.31(0.25, 0.5)<0.001SOFA評(píng)分a8.4±3.83.5±2.90.004住院時(shí)間(d)b11.5(8.3,14.0)15.0(13.0,17.0)<0.00128d病死率[n(%)]17(34.7)8(16.0)0.032原發(fā)疾病[n(%)]0.425 創(chuàng)傷7(14.3)11(22.0) 大手術(shù)后19(38.8)24(48.0) 膿毒癥6(12.2)4(8.0) 急性胰腺炎12(24.5)6(12.0) 其他5(10.2)5(10.0)

2.3 血清標(biāo)志物早期診斷ARDS的效能評(píng)價(jià)通過(guò)ROC分析(圖1)，5種血清標(biāo)志物(T1)診斷ARDS的曲線下面積(AUC)由大到小為：KL-6>Ang-2>SP-D>vWF>IL-8。其中，KL-6在截點(diǎn)2.9 ng/mL診斷ARDS的靈敏度0.765，特異度0.792，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值0.796，陰性預(yù)測(cè)值0.760。血清標(biāo)志物(T1)兩兩聯(lián)合診斷ARDS，最大AUC達(dá)0.869(95%CI: 0.795, 0.942)(KL-6+Ang-2)。

2.4 血清標(biāo)志物預(yù)測(cè)患者預(yù)后的效能評(píng)價(jià)應(yīng)用血清標(biāo)志物(T2)預(yù)測(cè)ARDS預(yù)后(圖2)，結(jié)果表明，IL-8、KL-6、Ang-2、SP-D曲線下面積與0.5進(jìn)行比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，各標(biāo)志物診斷截點(diǎn)及相應(yīng)的靈敏度、特異性，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值(PPV)、陰性預(yù)測(cè)值(NPV)見(jiàn)圖2；vWF-AUC與0.5比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.308)，對(duì)預(yù)測(cè)ARDS預(yù)后的價(jià)值不大。5種標(biāo)志物兩兩聯(lián)合預(yù)測(cè)ARDS預(yù)后(圖3)，AUC排前兩位的分別是IL-8+KL-6，IL-8+Ang-2。

3 討 論

美國(guó)-歐洲共識(shí)會(huì)議(American-European Consensus Conference, AECC)(1994)和“柏林定義”(2012)[3]依據(jù)臨床特點(diǎn)、影像學(xué)表現(xiàn)和動(dòng)脈血?dú)夥治鰧?duì)ARDS進(jìn)行臨床診斷和分度，不但難以實(shí)現(xiàn)早期診斷，也僅具有中等水平的診斷靈敏度和特異性[4-5]，至少10種疾病容易被誤診為ARDS[5]。發(fā)掘可靠、穩(wěn)定、易獲取的ARDS診斷、預(yù)后預(yù)測(cè)標(biāo)志物尤為重要，利于提高診斷和預(yù)測(cè)能力，實(shí)現(xiàn)早診斷早治療。本研究觀察了5種血清生物學(xué)標(biāo)志物在ARDS中的變化，以及預(yù)測(cè)其發(fā)生發(fā)展和臨床預(yù)后的價(jià)值。這些標(biāo)志物涉及肺臟內(nèi)皮屏障破壞、肺泡損傷、機(jī)體炎癥反應(yīng)等多個(gè)方面。

表2 各組患者不同時(shí)間點(diǎn)血清標(biāo)志物水平的比較

Tab.2 Serum levels of the biomarkers at different time points

時(shí)間點(diǎn)PaO2/FiO2(mmHg)Ang-2*(pg/mL)KL-6*(ng/mL)SP-D*(ng/mL)vWF*(μg/mL)IL-8*(pg/mL)T1 非ARDS組385(342,435)1330(860,1900)2.0(1.4, 2.7)4.5(3.1, 7.0)4.6(3.8, 7.4)29.0(13.9, 52.7) ARDS組374(335, 411)#§2310(1820, 2630)3.5(2.9,4.0)6.8(5.4,8.4)6.6(4.8,7.9)50.0(29.7,65.6)T2 ARDS組137(79,168)4200(2950,5740)6.0(4.1,7.4)10.0(6.3,16.2)7.1(6.0,9.1)79.5(43.5, 138.7)

3組間比較，*P<0.001；與非ARDS組比較，#P=0.454；與T2ARDS組比較，§P<0.001。

表3 ARDS患者死亡組與存活組標(biāo)志物水平的比較(T2時(shí)間點(diǎn))

Tab.3 Serum levels of the biomarkers in death and survival ARDS patients at T2time-point

組別Ang-2(pg/mL)KL-6(ng/mL)SP-D(ng/mL)vWF(μg/mL)IL-8(pg/mL)死亡組5690(3830, 6730)* 7.4(6.6, 9.2)#14.1(10.0, 18.2)* 8.0(7.2, 10.0)§139.5(62.3,154.3)*存活組3540(2940,5130) 5.0(4.0, 7.3)8.5(6.3,13.2) 7.1(6.1,11.1)58.2(36.2,90.5)

與存活組比較，*P<0.001；與存活組比較，#P=0.004；與存活組比較，§P=0.308。

標(biāo)志物AUC95% CICut-off靈敏度特異性PPVNPVKL-60.8160.730, 0.9022.9(ng/mL)0.7650.7920.7960.760Ang-20.7870.691, 0.8841805(pg/mL)0.7500.7870.7960.740SP-D0.7090.605, 0.8135.6(ng/mL)0.6670.6880.6940.660vWF0.6880.582, 0.7956.0(μg/mL)0.6670.6480.6120.700IL-80.6670.559, 0.77446.0(pg/mL)0.6590.6210.5510.720

圖1 血清標(biāo)志物(T1)診斷急性呼吸窘迫綜合征的ROC分析

Fig.1 ROC of biomarkers at T1time-point for ARDS diagnosis

AUC：曲線下面積；95%CI：95%可信區(qū)間；Cut-off：截點(diǎn)值；PPV：陽(yáng)性預(yù)測(cè)值；NPV：陰性預(yù)測(cè)值。

標(biāo)志物AUC95% CICut-off靈敏度特異性PPVNPVIL-80.7640.627, 0.901104.6(pg/mL)0.6410.8060.6470.781KL-60.7510.610, 0.8926.6(ng/mL)0.6220.8080.7060.656Ang-20.7090.546, 0.8715490(pg/mL)0.6670.7940.5880.843SP-D0.6720.512, 0.83213.7(ng/mL)0.5630.7580.5290.781

圖2 血清標(biāo)志物(T2)預(yù)測(cè)預(yù)后不良的ROC分析

Fig.2 ROC of biomarkers at T2time-point for poor prognosis

AUC：曲線下面積；95%CI：95%可信區(qū)間；Cut-off：截點(diǎn)值；PPV：陽(yáng)性預(yù)測(cè)值；NPV：陰性預(yù)測(cè)值。

標(biāo)志物組合AUC95% CIIL-8+KL-60.8290.715, 0.943IL-8+Ang-20.7890.651, 0.926圖3 血清標(biāo)志物(T2)聯(lián)合預(yù)測(cè)預(yù)后不良的ROC分析Fig.3 ROC of biomarker panels (T2 time-point) for poor prognosisAUC:曲線下面積;95% CI,95%可信區(qū)間。

研究結(jié)果表明，在未發(fā)生ARDS時(shí)(入科時(shí)，T1)，ARDS組血清標(biāo)志物水平高于非ARDS組，隨著病情進(jìn)展，診斷ARDS時(shí)(T2)標(biāo)志物水平高于T1，表明5種標(biāo)志物均有可能成為診斷標(biāo)志物；ARDS病例中死亡組與存活組比較，Ang-2、KL-6、SP-D和IL-8水平在T2均不同程度升高，證明它們可能是預(yù)后判斷的良好指標(biāo)。上述結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致[6-8]。進(jìn)一步行ROC分析，KL-6和Ang-2具有較好的診斷準(zhǔn)確度(AUC為0.70～0.90)，聯(lián)合KL-6+Ang-2可提高診斷效能(AUC：0.869)，但5項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合(Ang-2+KL-6+SP-D+vWF+IL-8)未明顯提高AUC[0.878(95%CI: 0.807, 0.949)]，且5項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合應(yīng)用難度大、成本高，KL-6+Ang-2是本研究中最佳的ARDS診斷組合。2014年，一項(xiàng)納入54項(xiàng)研究3 753人的Meta分析表明[9]，KL-6是診斷ARDS最相關(guān)的血清標(biāo)志物，比值比為6.1(95%CI: 3.0, 12.1)，本研究中KL-6診斷效能最高，具有最大AUC(0.816)，與上述Meta分析結(jié)論一致。

目前，國(guó)內(nèi)外大多采用入院第1天或入院幾天后的標(biāo)志物水平預(yù)測(cè)ARDS死亡[8,10-11]。然而，重癥患者病情發(fā)展快，理論上以“入院時(shí)間點(diǎn)”作為觀察點(diǎn)不及“病情變化時(shí)間點(diǎn)”更反映預(yù)后，原因是前者固定，但后者(本研究中的T2)屬動(dòng)態(tài)時(shí)間點(diǎn)，不同患者、病情的T2不同。但在動(dòng)態(tài)時(shí)間點(diǎn)預(yù)測(cè)ARDS預(yù)后鮮見(jiàn)報(bào)道。AGRAWAL等[12]報(bào)道了采血后6 h內(nèi)發(fā)生急性肺損傷重癥患者的血清標(biāo)志物水平的預(yù)測(cè)價(jià)值，時(shí)間點(diǎn)與本研究T2接近，但樣本量小(n=19)。研究結(jié)果證實(shí)，T2時(shí)間點(diǎn)預(yù)測(cè)效能好于固定時(shí)間點(diǎn)。王冉等[13]報(bào)道，入組24 h內(nèi)Ang-2血清水平預(yù)測(cè)24 d死亡AUC為0.67，本研究T2Ang-2水平預(yù)測(cè)28 d死亡的AUC更高(0.71)。

IL-8在急性肺損傷中發(fā)揮中性粒細(xì)胞趨化效應(yīng)。一項(xiàng)大樣本研究(n=528)證明，血清IL-8與其他指標(biāo)(APACHE Ⅲ+年齡+SP-D+IL-8)聯(lián)合預(yù)測(cè)死亡的AUC為0.834[14]；CARTIN-CEBA等[15]評(píng)估了6種標(biāo)志物的預(yù)后預(yù)測(cè)價(jià)值，只有發(fā)生ARDS后1 d內(nèi)的血清IL-8水平與多器官功能衰竭密切相關(guān)。本研究表明，4種標(biāo)志物中IL-8預(yù)測(cè)28 d死亡的AUC(0.764)最大，具有中等預(yù)測(cè)價(jià)值，其余標(biāo)志物的AUC不理想，與上述研究一致。本研究中，IL-8與KL-6聯(lián)合應(yīng)用可提高預(yù)測(cè)效能(AUC 0.829)，而4項(xiàng)聯(lián)合(Ang-2+KL-6+SP-D+IL-8)預(yù)測(cè)死亡的AUC為0.833，相對(duì)于“IL-8+KL-6”無(wú)差異，考慮到難以應(yīng)用4項(xiàng)指標(biāo)的聯(lián)合預(yù)測(cè)模式，本研究認(rèn)為，“IL-8+KL-6”模式可滿足臨床需求。

關(guān)于vWF預(yù)測(cè)ARDS死亡的研究，袁超等[6]報(bào)道，診斷ARDS第1天vWF預(yù)測(cè)死亡的ROC-AUC為0.91。然而，本研究中死亡組和存活組在診斷ARDS時(shí)(T2)血清vWF并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.308，表3)，二元Logistic回歸分析證實(shí)vWF不具有預(yù)測(cè)ARDS死亡的價(jià)值(OR=1.002,P=0.748)，ROC分析的AUC為0.589(95%CI: 0.424, 0.755)，與AUC 0.5無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這些結(jié)果不支持vWF作為死亡預(yù)測(cè)標(biāo)志物，與宗曉龍等[8]的研究結(jié)果相似。研究結(jié)果的差異可能與研究對(duì)象不同有關(guān)。有研究表明[10,16]，肺內(nèi)源性ARDS和肺外源性ARDS的vWF水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但孰高孰低尚有爭(zhēng)議，CALFEE等[16]報(bào)道，肺內(nèi)源性ARDS的血漿vWF水平低于肺外源性ARDS，但ZHENG等[10]研究結(jié)果卻正好相反。所以，納入對(duì)象中肺內(nèi)外源性ARDS所占比例不同可能導(dǎo)致結(jié)論不一，需更大樣本量、區(qū)分肺內(nèi)外源性ARDS及統(tǒng)一vWF檢測(cè)方法的多中心研究獲得結(jié)論。

通過(guò)設(shè)立不同時(shí)間點(diǎn)、運(yùn)用多種血清標(biāo)志物診斷和預(yù)測(cè)ARDS及預(yù)后的研究，本研究認(rèn)為，危重患者入院時(shí)血清KL-6和Ang-2水平可早期診斷ARDS；診斷ARDS時(shí)的血清IL-8和KL-6可預(yù)測(cè)28 d死亡，同時(shí)，上述標(biāo)志物聯(lián)合應(yīng)用更具臨床價(jià)值。研究結(jié)論為血清標(biāo)志物的臨床應(yīng)用，對(duì)促進(jìn)ARDS早診斷早治療、降低死亡率具有實(shí)際意義。