嚴(yán)晶 胡申才

摘要：近年來由于耐藥菌的頻頻出現(xiàn)，抗生素在抗感染領(lǐng)域面臨前所未有的挑戰(zhàn)，目前研制可裂解病原菌的噬菌體制劑已為一大熱點(diǎn)。噬菌體裂解酶是雙鏈DNA噬菌體在基因組復(fù)制晚期合成的一類蛋白質(zhì)，它能夠水解細(xì)菌細(xì)胞壁中的肽聚糖從而殺滅細(xì)菌。噬菌體裂解酶在體內(nèi)外的試驗(yàn)中都表現(xiàn)出很高的殺菌性、種屬特異性和安全性，因而具有廣闊的應(yīng)用前景。簡要介紹了噬菌體裂解酶的結(jié)構(gòu)性質(zhì)，并對(duì)裂解酶顯示出的抗菌性能及應(yīng)用進(jìn)行了綜述。

關(guān)鍵詞：噬菌體;裂解酶;耐藥菌

中圖分類號(hào)：S562? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2019）10-0005-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.10.001? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract： More recently， the original application of phage as therapeutics to treat human and animal infections has been rekindled， particularly in an era where antibiotic resistance has become so problematic. Bacteriophage lysins，which are peptidoglycan hydrolases encoded by double-stranded DNA bacteriophage， are produced in phage-infected bacterial cells toward the end of the lytic cycle. It was proved that the phage lysins exhibited high activity against bacteria， narrow antibacterial spectrum， and apparent safety in vitro and vivo experiments. Those paved solid foundation for further exploration of their application. A review on the structure and mode of action of lysins and their application were presented.

Key words： bacteriophage; lysin; antibiotic resistant bacteria

噬菌體（Bacteriophage，phage）是能夠感染細(xì)菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物的病毒的總稱[1]，據(jù)Brüssow[2]推算地球上大概有1032個(gè)噬菌體存在，這個(gè)數(shù)據(jù)大概是細(xì)菌數(shù)量的10倍?？梢哉f，凡是有細(xì)菌分布的地方， 就會(huì)有噬菌體存在。噬菌體感染的最后一步就是水解細(xì)菌細(xì)胞壁釋放成熟顆粒（絲狀噬菌體除外）。單鏈DNA噬菌體通過合成干擾宿主細(xì)菌肽聚糖合成的酶而導(dǎo)致宿主菌胞壁的水解，而雙鏈DNA噬菌體則可通過在復(fù)制晚期所合成的裂解酶（lysin或endolysin）來水解宿主菌的肽聚糖結(jié)構(gòu)[3]。

1? 裂解酶的結(jié)構(gòu)和溶菌機(jī)制

裂解酶又稱內(nèi)溶素、溶胞壁酶，是一類細(xì)胞壁水解酶。它被應(yīng)用到體外時(shí)，可以快速使革蘭氏陽性菌裂解死亡[4]。多數(shù)噬菌體裂解酶具有“雙結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)”的特點(diǎn)：N端結(jié)構(gòu)域具有催化活性，能夠特異地切斷肽聚糖中的化學(xué)鍵，稱為催化域CD。C端結(jié)構(gòu)域可以識(shí)別和結(jié)合宿主細(xì)菌細(xì)胞壁上的特異性底物，稱為結(jié)合域CBD[5]。還有一些裂解酶（如大多數(shù)分枝桿菌噬菌體裂解酶） 含有多個(gè)不同的催化結(jié)構(gòu)域和1個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域。另外，金黃色葡萄球菌噬菌體裂解酶Hyd H5擁有2個(gè)催化結(jié)構(gòu)域，卻不含結(jié)合結(jié)構(gòu)域[6]。而少數(shù)革蘭陰性菌噬菌體裂解酶N端為結(jié)合結(jié)構(gòu)域，C端為催化結(jié)構(gòu)域。因?yàn)榱呀饷傅淖饔梦稽c(diǎn)是細(xì)菌細(xì)胞壁上的肽聚糖苷鍵，且為高度保守的肽聚糖成分，且隨著細(xì)菌進(jìn)化，噬菌體也進(jìn)化，使得細(xì)菌很難對(duì)裂解酶產(chǎn)生抗性[7]。

根據(jù)裂解酶催化結(jié)構(gòu)域的作用位點(diǎn)，可粗略地將其分為胞壁酸酶（作用于胞壁上聚糖骨架中的β-1，4-糖苷鍵）、肽鏈內(nèi)切酶（作用于多肽鏈） 或酰胺酶（水解聚糖骨架和多肽鏈之間的酰胺鍵）[8]。還有一些裂解酶可以作用于其他位點(diǎn)，例如分枝桿菌噬菌體裂解酶Lysin B可以水解分枝菌酸和肽聚糖-阿拉伯半乳聚糖復(fù)合物間的化學(xué)鍵[9]。

裂解酶從細(xì)菌內(nèi)部裂解細(xì)菌的方式稱為“自內(nèi)裂解”。將某些裂解酶加入到對(duì)其敏感的細(xì)菌中，在缺少噬菌體的情況下也能引起細(xì)菌裂解，則稱為“自外裂解”，也就是說，該類噬菌體裂解酶在細(xì)菌外也能發(fā)揮快速、高效的溶菌作用。

裂解酶的活性和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)顯示了其良好的抗菌作用，也使其在成為新型抗菌藥物方面擁有廣闊的前景。

2? 噬菌體裂解酶的優(yōu)勢(shì)

2.1? 不產(chǎn)生細(xì)菌抗性

基于相關(guān)抗菌藥物，如抗生素的缺點(diǎn)，耐藥性的超級(jí)細(xì)菌不斷進(jìn)化對(duì)其產(chǎn)生抗性，使得藥物失效。在Nelson等[10]將化膿鏈球菌長時(shí)間暴露于含低濃度裂解酶的平板上，連續(xù)傳代40次也不會(huì)產(chǎn)生抗性。同樣，Loeffler等[11]將肺炎鏈球菌與低濃度裂解酶Pal混合，經(jīng)過液體培養(yǎng)基中的10次傳代，未出現(xiàn)抗性細(xì)菌。原理推測(cè)可能是Pal在肺炎鏈球菌上的作用位點(diǎn)是膽堿，膽堿對(duì)于肺炎鏈球菌的存活是必需的。推測(cè)噬菌體隨著細(xì)菌共同進(jìn)化，為了裂解宿主后脫離宿主，裂解酶的結(jié)合結(jié)構(gòu)域針對(duì)宿主細(xì)胞壁受體分子，經(jīng)演化后能夠特異性識(shí)別細(xì)菌并殺死細(xì)菌，使細(xì)菌很難對(duì)其產(chǎn)生耐受性。

2.2? 特異性介于抗生素和噬菌體之間

裂解酶的特異性相較于抗生素更好，相較于噬菌體，裂解譜又?jǐn)U大了。研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)青霉素耐藥的肺炎鏈球菌菌株可以被裂解酶殺死，同時(shí)對(duì)人體的正常菌群沒有影響，而抗生素在殺死病原菌的同時(shí)，也損傷了部分正常菌群。不僅如此，裂解酶的裂解譜卻可以超出本身噬菌體的宿主譜，比如瑞士乳桿菌噬菌體Ф-0303的裂解酶Mur-LH[12]、無乳鏈球菌噬菌體B30的裂解酶和產(chǎn)氣莢膜梭菌噬菌體Ф-3626的裂解酶Ply3626都可裂解多種同類細(xì)菌[13]。試驗(yàn)證明，具有酰胺酶活性的裂解酶還具有更寬的裂解譜，可以裂解不同類的細(xì)菌。據(jù)報(bào)道，人類致病菌糞腸球菌噬菌體Ф1的裂解酶PlyV12可能是裂解譜最廣的，不但可以裂解同類腸球菌，如糞腸球菌和乳酸腸球菌，同時(shí)還可以裂解化膿鏈球菌、B群、C群鏈球菌和金黃色葡萄球菌等[14-17]。

2.3? 裂解酶刺激產(chǎn)生的相關(guān)抗體不會(huì)削弱其殺菌作用

由于裂解酶是較大的蛋白分子，在其通過動(dòng)物體內(nèi)黏膜或經(jīng)注射進(jìn)入全身循環(huán)時(shí)有可能刺激產(chǎn)生免疫反應(yīng)從而影響自身作用的發(fā)揮。但Loeffler等[11]發(fā)現(xiàn)抗體的產(chǎn)生不會(huì)影響裂解酶自身的殺菌作用。Cpl-1裂解酶的體外試驗(yàn)對(duì)肺炎鏈球菌作用的時(shí)候，產(chǎn)生的相關(guān)兔源高價(jià)免疫血清只會(huì)減緩不會(huì)阻礙其裂解作用。Cpl-1在小鼠體內(nèi)的半衰期很短，為20.5 min，這導(dǎo)致1～2次應(yīng)用Cpl-1不能完全清除小鼠體內(nèi)的肺炎鏈球菌，之后感染會(huì)再次發(fā)生。在體內(nèi)試驗(yàn)中，設(shè)置試驗(yàn)組為Cpl-1 3次靜脈注射免疫的小鼠，對(duì)照組為未免疫的小鼠。用肺炎鏈球菌對(duì)小鼠靜脈攻毒10 h后再注入Cpl-1解毒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在1 min內(nèi)，試驗(yàn)組和對(duì)照組都使細(xì)菌滴度降低了相同的程度。

Rashel等[18]在金黃色葡萄球菌的體內(nèi)試驗(yàn)中，用裂解酶phiMR11也得到了相同的結(jié)論。推測(cè)是因?yàn)榱呀饷概c細(xì)菌細(xì)胞壁的親和力遠(yuǎn)比與抗體的強(qiáng)，可以通過在動(dòng)物黏膜表面或血液中重復(fù)注入裂解酶控制病原菌的定殖。還有研究顯示，對(duì)小鼠腹腔反復(fù)3次注射裂解酶MV-L以激活免疫反應(yīng)，這樣會(huì)使其血清中的抗體水平大幅度上升，但抗體對(duì)裂解酶的影響有限。如，在體外試驗(yàn)中，兔的高價(jià)免疫血清也只是對(duì)其活性產(chǎn)生一定限度的抑制;Rashel等[18]將金黃色葡萄球菌噬菌體？準(zhǔn)MR11的裂解酶MV-L與鼠的免疫血清混合孵育1 h，也獲得了同樣的結(jié)論。Loessner等[19]的研究也顯示出當(dāng)針對(duì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的特異性IgG存在時(shí)，李斯特菌裂解酶的結(jié)合結(jié)構(gòu)域仍會(huì)與細(xì)菌細(xì)胞壁上的底物結(jié)合，這表明裂解酶對(duì)底物的親和力高于其對(duì)抗體的親和力。雖然這能夠解釋抗體不能中和噬菌體的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，但無法解釋為何抗體無法中和催化結(jié)構(gòu)域。

2.4? 裂解酶的作用高效迅速

裂解酶在體外與細(xì)菌接觸的瞬間迅速破裂細(xì)菌細(xì)胞，可使細(xì)菌濁度迅速下降[20]。對(duì)鏈球菌裂解酶ClyV的體外試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，25 μg/mL的裂解酶可以在15 min內(nèi)使靶細(xì)菌的數(shù)量下降2個(gè)數(shù)量級(jí)。裂解酶在加入渾濁的細(xì)菌溶液后，短時(shí)間內(nèi)以肉眼可見的速度下降其濁度。在細(xì)胞試驗(yàn)中，將停乳鏈球菌與肺上皮細(xì)胞A549共孵育一段時(shí)間后，用PBS溶液洗去細(xì)胞表面黏附的鏈球菌，再加入有效工作濃度的ClyR進(jìn)行處理。裂解細(xì)胞后，對(duì)細(xì)胞內(nèi)殘存的靶細(xì)胞進(jìn)行稀釋平板計(jì)數(shù)，發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組的細(xì)菌數(shù)量降低了2個(gè)數(shù)量級(jí)。在體內(nèi)試驗(yàn)中，裂解酶同樣高效。盡管裂解酶在體內(nèi)的半衰期很短，如Cpl-1的半衰期只有16 min，但Loeffler等[11]發(fā)現(xiàn)將肺炎鏈球菌通過靜脈注射小鼠體內(nèi)攻毒1 h后，注入2.0 mg的Cpl-1可使小鼠存活48 h，其中有1只小鼠在血中和組織中的病原菌已經(jīng)消除。而對(duì)照組平均只能存活25 h，只有20%的小鼠可以存活48 h。短時(shí)間內(nèi)裂解酶在體內(nèi)外以及細(xì)胞胞內(nèi)都發(fā)揮了殺菌作用。

2.5? 裂解酶可與抗生素產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)

2種酶共同使用可產(chǎn)生協(xié)同或競爭抑制作用。對(duì)裂解酶來說，無論是裂解酶之間或裂解酶與抗生素之間，都具有協(xié)同效應(yīng)。Jado等[21]發(fā)現(xiàn)高濃度噬菌體Dp-1或高濃度裂解酶Cpl-1單獨(dú)使用，或低濃度Dp-1和低濃度Cpl-1共同使用，都可以使小鼠全部存活，而Dp-1或Cpl-1單獨(dú)使用時(shí)，因嚴(yán)重的菌血癥小鼠全部死亡。故低濃度的酶和噬菌體的混合物可以發(fā)揮與高濃度的單酶相同的效果，酶與噬菌體之間具有協(xié)同效應(yīng)。裂解酶與抗生素聯(lián)用也可發(fā)揮協(xié)同殺菌作用。Djurkovic等[22]發(fā)現(xiàn)將裂解酶Cpl-1與慶大霉素聯(lián)用，可降低青霉素對(duì)肺炎鏈球菌的最小抑菌濃度（MIC）。當(dāng)Cpl-1與青霉素聯(lián)用時(shí)，亦可以協(xié)同殺死對(duì)青霉素耐藥的菌株。Rashel[18]也證明了裂解酶與抗生素之間的協(xié)同效應(yīng)，將金黃色葡萄球菌裂解酶MV-L與糖肽類抗生素聯(lián)用，很好地控制了耐萬古霉素的金黃色葡萄球菌的繁殖。裂解酶與抗生素的協(xié)同效應(yīng)，為解決現(xiàn)階段愈加嚴(yán)重的細(xì)菌耐藥性問題提供了一種新思路。

3? 裂解酶的改造

由于裂解酶具有種屬特異性，且其結(jié)構(gòu)域的特殊性使得酶的作用范圍受到局限，因此將裂解酶進(jìn)行多功能設(shè)計(jì)，滿足廣譜性和性能的優(yōu)化。通過其結(jié)合結(jié)構(gòu)域作用于細(xì)胞壁，水解細(xì)胞壁最終摧毀細(xì)胞，作用高效且不易產(chǎn)生抗性。根據(jù)裂解酶結(jié)構(gòu)的模塊化，人們不但可以通過合成生物學(xué)合成有不同應(yīng)用能力的裂解酶，如通過混合排列重組天然裂解酶的功能結(jié)構(gòu)域來改變種屬特異性，提高廣譜裂解酶的殺菌活性和可溶性;而且還可以將不同源的結(jié)構(gòu)域和肽端連接起來進(jìn)行融合表達(dá)，如將減穩(wěn)肽和革蘭氏陰性菌的裂解酶融合表達(dá)，可以將其殺菌活性延伸到革蘭氏陰性菌。裂解酶及其他水解酶具有特殊的結(jié)構(gòu)域，其作用方式及模塊都有所不同。如肺炎球菌噬菌體裂解酶的膽堿結(jié)構(gòu)域發(fā)揮重要催化功能[23]，而金黃色葡萄球菌及乳球菌以細(xì)胞壁水解功能為主[24，25]，李斯特菌噬菌體裂解酶則以酰胺酶為主[26]。 雖然裂解酶因其結(jié)構(gòu)功能的特性被分為不同類型，但其最根本還是以酰胺酶及內(nèi)肽酶為主要作用形式。在這些酶中，有一類常見的蛋白家族CHAP，在作為催化結(jié)構(gòu)域時(shí)其表現(xiàn)為酰胺酶活性也會(huì)表現(xiàn)出內(nèi)肽酶的功能，在裂解過程中發(fā)揮重要作用。金黃色葡萄球菌噬菌體裂解酶LysK及Φ11具有高度同源的N末端CHAP及酰胺酶結(jié)構(gòu)域[27，28]，因此，將其CHAP作為主要催化基團(tuán)，并加入特殊的細(xì)胞結(jié)合結(jié)構(gòu)域（CBD）SH3b，將有望擴(kuò)大其裂解功能[29]。李斯特菌噬菌體與金黃色葡萄球菌噬菌體裂解酶裂解功能類似，也是通過催化切割N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡糖胺殘基將宿主細(xì)胞壁裂解，其裂解酶CBD不僅有種屬特異性，甚至有血清或菌株特異性[30]，因此，將其與金黃色葡萄球菌噬菌體裂解酶的酰胺酶活性進(jìn)行結(jié)合，其多功能活性將會(huì)同時(shí)作用于2種病原菌。另外，還可以對(duì)全長裂解酶進(jìn)行截?cái)嗵幚?，研究發(fā)現(xiàn)B族鏈球菌裂解酶PlyGBS的N端（GBS180）180氨基酸的殺菌活性比全長PlyGBS殺菌活性更好，但殺菌譜窄;而將其與廣譜裂解酶ClyR的CBD融合在C端表達(dá)后，得到新裂解酶ClyE，在提高殺菌活性的同時(shí)，又拓寬了殺菌譜。不僅如此，ClyR[31-34]也是一個(gè)經(jīng)嵌合改造的廣譜裂解酶，是將來自B族鏈球菌裂解酶PlyC的N端147個(gè)氨基酸與豬鏈球菌裂解酶PlySs2的C端85個(gè)氨基酸嵌合而成。裂解酶結(jié)構(gòu)域重構(gòu)可以作為多功能酶蛋白構(gòu)建的新方法[35]，而把裂解酶蛋白進(jìn)行有效配比亦能獲得復(fù)合裂解效果，也是獲得廣譜抗菌的新途徑。工程嵌合裂解酶可以通過重組不同來源的結(jié)構(gòu)域或分子融合來構(gòu)建，這樣嵌合體可能被賦予新的特性，包括結(jié)合特異性、殺菌譜、溶解性、穩(wěn)定性、活性等[36，37]。這些嵌合裂解酶也在醫(yī)療、農(nóng)牧業(yè)等多方面得到了應(yīng)用。噬菌體裂解酶的單個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域也在診斷和免疫治療中得到廣泛應(yīng)用[38，39]。此外，采用多肽等小分子進(jìn)行聯(lián)合構(gòu)建等方法使酶譜擴(kuò)大[40]，同樣早期還有將酶與抗生素聯(lián)用等發(fā)揮協(xié)同抗菌等的研究[41]，這些不僅能放大酶的作用同時(shí)也會(huì)降低抗生素的用量，都將給裂解酶產(chǎn)品的開發(fā)提供依據(jù)。

4? 噬菌體裂解酶用于治療的發(fā)展趨勢(shì)

在抗生素逐漸對(duì)耐藥菌株失效的困境下，可以篩選耐藥菌的噬菌體，并將其產(chǎn)生的裂解酶單獨(dú)用藥或和抗生素等其他抗菌藥物一起聯(lián)合用藥[42]，這擴(kuò)大了裂解酶的廣譜性，又避免了靶細(xì)胞的耐藥性;另外，也可以通過分子生物學(xué)的方法改造噬菌體裂解酶，擴(kuò)大其宿主譜，使其能夠特異性裂解某一種屬的細(xì)菌，甚至不同種屬的細(xì)菌。從生物技術(shù)的角度來說，后一種方法更加切實(shí)有效， 因?yàn)檠芯空咭呀?jīng)通過分子生物學(xué)的方法，相對(duì)容易地改造優(yōu)化了裂解酶。其次，篩選、培育能在體內(nèi)長期循環(huán)的噬菌體也是一大趨勢(shì)。為延緩機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)裂解酶的清除，延長裂解酶在體內(nèi)存留時(shí)間，可以通過連續(xù)傳代的方法來篩選那些發(fā)生變異后能在體內(nèi)長期循環(huán)的噬菌體，從而生產(chǎn)其對(duì)應(yīng)的裂解酶。

盡管裂解酶有很多優(yōu)勢(shì)，但仍存在很多問題：①有研究指出天然裂解酶在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)有些對(duì)表達(dá)菌株具有明顯的毒性，蛋白表達(dá)往往以包涵體的形式存在;②裂解酶本質(zhì)是蛋白質(zhì)，進(jìn)入機(jī)體后易受到蛋白酶的攻擊，而具有較短的半衰期;③很難掌握裂解酶在治療過程中的最佳時(shí)間和最適劑量;④裂解酶治療的宿主譜很窄等。

關(guān)于噬菌體裂解酶對(duì)細(xì)菌的殺菌效果的研究日益增多，如何長期地保存裂解酶、如何高效安全地給藥、如何大量生產(chǎn)和應(yīng)用裂解酶、如何評(píng)價(jià)裂解酶治療的效用等難題有待解決[43]。運(yùn)用分子生物學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)方法，從基因水平改造噬菌體，使其攜帶一種甚至多種細(xì)菌的通用配體，擴(kuò)大其宿主譜，提高現(xiàn)有噬菌體裂解酶的裂解能力，以及更換表達(dá)菌株使裂解酶在真核生物和細(xì)胞水平上表達(dá)是今后的研究方向。

參考文獻(xiàn)：

[1] ABENDON S T，GARC？魱A P，MULLANY P，et al. Editorial：Phage therapy：Past，present and future[J].Front Microbiol，2017，8：981.

[2] BR？譈SSOW H. What is needed for phage therapy to become a reality in western medicine？[J].Virology，2012，434（2）：138-142.

[3] AJUEBOR J，MCAULIFFE O，O'MAHONY J，et al. Bacteriophage endolysins and their applications[J].Science progress，2016，99（2）：183-199.

[4] PASTAGIA M，SCHUCH R，F(xiàn)ISCHETTI V A，et al. Lysins：The arrival of pathogen-directed anti-infectives[J].Journal of medical microbiology，2013，62：1506-1516.

[5] GERSTMANS H，CRIEL B，BRIERS Y.Synthetic biology of modular endolysins[J].Biotechnol Adv，2018，36（3）：624-640.

[6] RODRIGUEZ L，MARTINEZ B，ZHOU Y，et al. Lytic activity of the virion-associated peptidoglycan hydrolase HydH5 of Staphylococcus aureus bacteriophage vB_SauS-philPLA88[J]. BMC Microbiol，2011，11：138.

[7] FISCHETTI V A. Bacteriophage endolysins：A novel anti-infective to control gram-positive pathogens[J].International journal of medical microbiology，2010，300（6）：357-362.

[8] YOUNG R. Bacteriophage lysis-mechanism and regulation[J].Microbiological reviews，1992，56（3）：430-481.

[9] PAYNE K，SUN Q，SACCHETTINI J，et al. Mycobacteriophage Lysin B is a novel mycolylarabinogalactan esterase[J].Molecular microbiology，2009，73（3）：367-381.

[10] NELSON D，LOOMIS L，F(xiàn)ISCHETTI V A. Prevention and elimination of upper respiratory colonization of mice by group A streptococci by using a bacteriophage lytic enzyme[J].PNAS，2001，98（7）：4107-4112.

[11] LOEFFLER J M，DJURKOVIC S，F(xiàn)ISCHETTI V A. Phage lytic enzyme Cpl-1 as a novel antimicrobial for pneumococcal bacteremia[J].Infection and immunity，2003，71（11）：6199-6204.

[12] DEUTSCH S M，GUEZENEC S，PIOT M，et al. Mur-LH，the broad-spectrum endolysin of Lactobacillus helveticus temperate bacteriophage ？準(zhǔn)-0303[J].Applied and environmental microbiology，2004，70（1）：96-103.

[13] SCHMITZ J E，OSSIPRANDI M C，RUMAH K R，et al. Lytic enzyme discovery through multigenomic sequence analysis in Clostridium perfringens[J].Applied microbiology and biotechnology，2011，89（6）：1783-1795.

[14] QIAO J J，LI Y P，WEI C H，et al. Rapid detection of viral antibodies based on multifunctional Staphylococcus aureus nanobioprobes[J].Enzyme and microbial technology，2016，95：94-99.

[15] YANG H，XU J，LI W，et al. Staphylococcus aureus virulence attenuation and immune clearance mediated by a phage lysin-derived protein[J].EMBO J，2018，37（17）：e98045.

[16] YU J，ZHANG Y，ZHANG Y，et al. Sensitive and rapid detection of Staphylococcus aureus in milk via cell binding domain of lysin[J].Biosensors & bioelectronics，2016，77：366-371.

[17] LIU J，ZHANG X，YANG H，et al. Study of the interactions between endolysin and bacterial peptidoglycan on S. aureus by dynamic force spectroscopy[J].Nanoscale，2015，7（37）：15245-15250.

[18] RASHEL M，UCHIYAMA J，UJIHARA T，et al. Efficient elimination of multidrug-resistant Staphylococcus aureus by cloned lysin derived from bacteriophage ？準(zhǔn)MR11[J].Journal of infectious diseases，2007，196（8）：1237-1247.

[19] LOESSNER M J，KRAMER K，EBEL F，et al. C-terminal domains of Listeria monocytogenes bacteriophage murein hydrolases determine specific recognition and high-affinity binding to bacterial cell wall carbohydrates[J].Molecular microbiology，2002，44（2）：335-349.

[20] SHI Y B，LI N，YAN Y X，et al. Combined antibacterial activity of phage lytic proteins holin and lysin from Streptococcus suis bacteriophage SMP[J].Current microbiology，2012，65：28-34.

[21] JADO I，L？魷PEZ R，GARC？魱A E，et al. Phage lytic enzymes as therapy for antibiotic-resistant Streptococcus pneumoniae infection in a murine sepsis model[J].Journal of antimicrobial chemotherapy，2003，52（6）：967-973.

[22] DJURKOVIC S，LOEFFLER J M，F(xiàn)ISCHETTI V A. Synergistic killing of Streptococcus pneumoniae with the bacteriophage lytic enzyme Cpl-1 and penicillin or gentamicin depends on the level of penicillin resistance[J].Antimicrob agents chemother，2005，49（3）：1225-1228.

[23] CROUX C，RONDA C，L？魷PEZ R，et al. Interchange of functional domains switches enzyme specificity：Construction of a chimeric pneumococcal-clostridial cell wall lytic enzyme[J].Mol Microbiol，1993，9（5）：1019-1025.

[24] OSHIDA T，SUGAI M，KOMATSUZAWA H，et al. A Staphylococcus aureus autolysin that has an N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase domain and an endo-beta-N-acetylglucosaminidase domain：Cloning，sequence analysis，and characterization[J].Proc Natl Acad Sci USA，1995，92（1）：285-289.

[25] SHEEHAN M M，GARC？魱 J，L？魷PEZ R，et al. Analysis of the catalytic domain of the lysin of the lactococcal bacteriophage Tuc2009 by chimeric gene assembling[J].FEMS Microbiol Lett，1996， 140（1）：23-28.

[26] MILOHANIC E，JONQUI？魬RES R，COSSART P，et al. The autolysin Ami contributes to the adhesion of Listeria monocytogenes to eukaryotic cells via its cell wall anchor[J].Mol Microbiol，2001，39（5）：1212-1224.

[27] BECKER S C，F(xiàn)OSTER-FREY J，STODOLA A J，et al. Differentially conserved staphylococcal SH3b_5 cell wall binding domains confer increased staphylolytic and streptolytic activity to a streptococcal prophage endolysin domain[J].Gene，2009，443（1-2）：32-41.

[28] HORGAN M，O'FLYNN G，GARRY J，et al. Phage lysin LysK can be truncated to its CHAP domain and retain lytic activity against live antibiotic-resistant staphylococci[J].Appl Environ Microbiol，2009，75（3）：872-874.

[29] SINGH P K，DONOVAN D M，KUMAR A. Intravitreal injection of the chimeric phage endolysin Ply187 protects mice from Staphylococcus aureus endophthalmitis[J].Antimicrobial agents and chemotherapy，2014，58（8）：4621-4629.

[30] SCHMELCHER M，SHABAROVA T，EUGSTER M R，et al. Rapid multiplex detection and differentiation of Listeria cells by use of fluorescent phage endolysin cell wall binding domains[J].Applied and environmental microbiology，2010，76（17）：5745-5756.

[31] SCHOLTE C M，NELSON D C，GARCIA M，et al. Short communication：Recombinant bacteriophage endolysin PlyC is nontoxic and does not alter blood neutrophil oxidative response in lactating dairy cows[J].Journal of dairy science，2018，101（7）：6419-6423.

[32] YANG H，WANG M，YU J，et al. Antibacterial activity of a novel peptide-modified lysin against Acinetobacter baumannii and Pseudomonas aeruginosa[J].Frontiers in microbiology，2015， 6：1471.

[33] YANG H，BI Y，SHANG X，et al. Antibiofilm activities of a novel chimeolysin against Streptococcus mutans under physiological and cariogenic conditions[J].Antimicrob agents chemother，2016，60（12）：7436-7443.

[34] ALI S B，DIVI？魬S C，PR？魪VOST H. Genetic organization of the citCDEF locus and identification of mae and clyR genes from Leuconostoc mesenteroides[J].J Bacteriol，1999，181（14）：4411-4416.

[35] WANG S，GU J，LV M，et al.，The antibacterial activity of E-coli bacteriophage lysin lysep3 is enhanced by fusing the Bacillus amyloliquefaciens bacteriophage endolysin binding domain D8 to the C-terminal region[J].Journal of microbiology，2017，55（5）：403-408.

[36] YANG H，YU J，WEI H. Engineered bacteriophage lysins as novel anti-infectives[J].Front Microbiol，2014，5：542.

[37] VAREA J，MONTERROSO B，S？魣IZ J L，et al. Structural and thermodynamic characterization of Pal，a phage natural chimeric lysin active against pneumococci[J].Journal of biological chemistry，2004，279（42）：43697-43707.

[38] SCHMELCHER M，KOROBOVA O，SCHISCHKOVA N，et al. Staphylococcus haemolyticus prophage ？準(zhǔn) SH2 endolysin relies on cysteine，histidine-dependent amidohydrolases/peptidases activity for lysis ‘from without[J].Journal of biotechnology，2012，162（2-3）：289-298.

[39] RAZ A，SERRANO A，LAWSON C，et al. Lysibodies are IgG Fc fusions with lysin binding domains targeting Staphylococcus aureus wall carbohydrates for effective phagocytosis[J].PNAS，2017，114（18）：4781-4786.

[40] MA Q，GUO Z M，GAO C C，et al. Enhancement of the direct antimicrobial activity of Lysep3 against Escherichia coli by inserting cationic peptides into its C terminus[J].Antonie van leeuwenhoek，2017，110（3）：347-355.

[41] ENTENZA J M，LOEFFLER J M，GRANDGIRARD D，et al. Therapeutic effects of bacteriophage Cpl-1 lysin against Streptococcus pneumoniae endocarditis in rats[J].Antimicrobial agents and chemotherapy，2005，49（11）：4789-4792.

[42] 王? 錚，沈文彬，張浩天，等.噬菌體裂解酶作為抗菌藥物的研究進(jìn)展[J].上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2013，33（3）：368-373.

[43] 王? 琰，陸承平.噬菌體裂解酶的抗菌特性[J].微生物學(xué)報(bào)，2009，49（10）：1277-1281.