莊盈婷，孫虎芝，潘 強(qiáng)，王佳存，劉 爽，劉廣芹，劉 慧，任慧英,2*

(1.青島諾安百特生物技術(shù)有限公司，山東青島 266000；2．青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，山東青島 266109)

目前，隨著抗生素的大量和不合理的使用，人類和動(dòng)物源性的致病菌逐漸產(chǎn)生耐藥性，超級(jí)細(xì)菌等多重耐藥細(xì)菌的出現(xiàn)，使得細(xì)菌耐藥性問題成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)學(xué)面臨的最主要問題[1-3]。2016年英國《全球抗生素耐藥回顧》中指出，目前中國抗生素的用量約占世界抗生素用量的一半，如不采取措施，到2050年，抗生素耐藥每年將導(dǎo)致100萬人早死。尋找安全、綠色、有效的抗菌劑成為解決抗生素耐藥問題的主要方案。

噬菌體是細(xì)菌、真菌、放線菌等微生物的天敵，廣泛存在于自然界中，數(shù)量巨大，種類繁多，是目前理想的天然抗菌劑[4]。隨著噬菌體治療的優(yōu)勢被廣泛認(rèn)識(shí)，越來越多的研究也集中到了噬菌體的產(chǎn)品開發(fā)中，噬菌體的產(chǎn)業(yè)化無疑是噬菌體治療的助推器。2006年8月18日美國FDA批準(zhǔn)了用于肉類防腐的第一個(gè)噬菌體產(chǎn)品。2007年，美國USDA農(nóng)業(yè)部上市了針對大腸埃希菌O157的噬菌體制劑。韓國iNtRON公司成功研制了在雞飼料中添加的噬菌體[5]。越來越多的噬菌體制成產(chǎn)品應(yīng)用于食品、藥品等行業(yè)。

噬菌體產(chǎn)品在食品藥品行業(yè)中發(fā)揮著越來越重要的作用，隨著噬菌體產(chǎn)業(yè)化的推進(jìn)，噬菌體的需求量也越來越高，噬菌體的大規(guī)模生產(chǎn)是噬菌體產(chǎn)品的必須條件，摸索高效的噬菌體發(fā)酵工藝也是降低噬菌體產(chǎn)品成本的重要措施。目前對噬菌體的研究主要集中在生物學(xué)特性、基因組學(xué)及蛋白質(zhì)組學(xué)方面，對噬菌體生產(chǎn)發(fā)酵參數(shù)和規(guī)?；a(chǎn)的制備條件等研究較少[6-8]。本文參考國內(nèi)外噬菌體發(fā)酵的方法和改進(jìn)措施，總結(jié)影響噬菌體發(fā)酵的主要因素和相應(yīng)參數(shù)，為噬菌體的工業(yè)化生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 影響噬菌體發(fā)酵工藝的主要因素

微生物發(fā)酵主要是通過嚴(yán)格控制各種發(fā)酵條件，從而實(shí)現(xiàn)微生物大量增殖的過程。微生物發(fā)酵已廣泛應(yīng)用于食品、藥品和化工產(chǎn)品的生產(chǎn)中，針對微生物發(fā)酵條件的研究已經(jīng)相當(dāng)深入[9]。噬菌體發(fā)酵作為微生物發(fā)酵中的一種，影響其發(fā)酵工藝的主要因素與一般的微生物發(fā)酵有很多相同之處，例如pH、溫度、溶氧等基本條件。但噬菌體作為一種細(xì)菌病毒，其發(fā)酵條件與普通的細(xì)菌發(fā)酵條件也有很多的不同之處，例如宿主菌的選擇、最佳感染復(fù)數(shù)等。

1.1 噬菌體和宿主菌對噬菌體發(fā)酵的影響

提高噬菌體發(fā)酵的效價(jià)應(yīng)選擇高效價(jià)增值的噬菌體和宿主菌。噬菌體的增殖需要在宿主菌中進(jìn)行，所以噬菌體的發(fā)酵在一定程度上依賴宿主菌的發(fā)酵，選擇適宜發(fā)酵的宿主菌和噬菌體是噬菌體工業(yè)生產(chǎn)的基礎(chǔ)[10]。Merabishvili M等[11]研究發(fā)現(xiàn)，并不是所有的噬菌體都能大量生產(chǎn)，當(dāng)噬菌體的產(chǎn)量增加時(shí)，25個(gè)噬菌體中會(huì)有2個(gè)噬菌體因?yàn)槭湛s性而受到限制，不能繼續(xù)增殖。另外，大量研究發(fā)現(xiàn)同一噬菌體對不同宿主菌在相同的條件下的結(jié)合效率是不同的。噬菌體通過識(shí)別宿主菌的表面受體完成吸附，進(jìn)入不同宿主細(xì)胞的噬菌體，在不同宿主菌細(xì)胞內(nèi)酶的作用下其增殖的效率是不同的[12]。選擇高效價(jià)增殖的宿主菌往往是提高噬菌體發(fā)酵的關(guān)鍵。

1.2 感染復(fù)數(shù)對噬菌體發(fā)酵的影響

感染復(fù)數(shù)是指作用的噬菌體與感染的宿主菌的數(shù)量比例，最佳感染復(fù)數(shù)是指獲得最高噬菌體效價(jià)的噬菌體與宿主菌數(shù)量比例。研究發(fā)現(xiàn)，噬菌體發(fā)酵按照最佳感染復(fù)數(shù)比例接種，能獲得穩(wěn)定的最高噬菌體效價(jià)[13]。Zhang C等[14]在對大腸埃希菌噬菌體生物學(xué)特性的研究中，噬菌體在按照最佳感染復(fù)數(shù)接種后，獲得最高的噬菌體效價(jià)。李夢哲[15]研究也發(fā)現(xiàn)，在噬菌體增殖的過程中并非接種的噬菌體的數(shù)量越多越好，在適宜的宿主菌和噬菌體的比例下更利于噬菌體的增殖。感染復(fù)數(shù)是研究病毒感染和產(chǎn)出之間量效關(guān)系的重要生物學(xué)指標(biāo)，而最佳感染復(fù)數(shù)在經(jīng)濟(jì)有效地獲取最大量的噬菌體產(chǎn)出中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。

1.3 培養(yǎng)基對噬菌體發(fā)酵的影響

噬菌體的發(fā)酵培養(yǎng)基并非營養(yǎng)物質(zhì)越豐富越好。發(fā)酵培養(yǎng)基的成分作為宿主菌和噬菌體的主要能源，是噬菌體發(fā)酵中的關(guān)鍵影響因素，如果發(fā)酵培養(yǎng)基的營養(yǎng)供給不足，會(huì)導(dǎo)致宿主菌生產(chǎn)緩慢，進(jìn)而影響噬菌體的增殖，且如果沒有足夠的能量供給，噬菌體也無法完成吸附和釋放等過程[16]。但Heilmann S等[17]指出當(dāng)宿主菌處于饑餓狀態(tài)時(shí)，能產(chǎn)生高效的噬菌體感染。這一結(jié)論也在Grieco S H等[18]的試驗(yàn)中等到了證實(shí)，使用富含營養(yǎng)的培養(yǎng)基，卻得到了32%的噬菌體產(chǎn)量。所以在噬菌體發(fā)酵過程中，并非發(fā)酵培養(yǎng)基的營養(yǎng)物質(zhì)越豐富越好。

噬菌體發(fā)酵培養(yǎng)基中添加一定濃度的抗生素可以提高噬菌體的發(fā)酵效價(jià)。Krisch H M等[19]研究發(fā)現(xiàn)，噬菌體發(fā)酵滴度的升高與低水平的抗生素特別是β內(nèi)酰胺和喹諾酮類抗生素之間存在協(xié)同作用。針對3種T型噬菌體(T4，RB33和RB49)進(jìn)行研究，在各自噬菌體發(fā)酵中分別添加0.003 μg/mL或0.03 μg/mL β內(nèi)酰胺抗生素(CTX)。T4噬菌體在添加0.003 μg/mL的CTX后，發(fā)酵產(chǎn)量比沒有添加CTX的對照組提高了10倍；RB33和RB49噬菌體在添加0.03 μg/mL的CTX后，發(fā)酵產(chǎn)量比對照組分別提高了10倍和5倍。目前，大腸埃希菌與肌尾噬菌體之間、耶爾森菌和長尾噬菌體之間，均已建立了噬菌體產(chǎn)量與抗生素之間的協(xié)同作用。這種藥物介導(dǎo)噬菌體繁殖產(chǎn)量提升的機(jī)制，可能與宿主菌受到藥物抑制后細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化有關(guān)。宿主菌細(xì)胞在受到抗生素抑制后，體積變大且產(chǎn)生長脂肪細(xì)絲，該受到抑制狀態(tài)下的宿主菌更易于噬菌體的增殖。因此，推斷噬菌體增殖的最佳條件可能不是人們普遍認(rèn)為的指數(shù)生長期的宿主菌，而是受到抑制的宿主菌的數(shù)量。

1.4 離子對噬菌體發(fā)酵的影響

噬菌體發(fā)酵過程中添加離子可以影響噬菌體的發(fā)酵效價(jià)，二價(jià)陽離子可以通過降低排斥力并通過中和宿主細(xì)胞表面聚合物與噬菌體表面之間的電荷影響噬菌體的初次附著，在噬菌體感染周期的不同階段發(fā)揮重要作用[20]。每個(gè)噬菌體對于特定的二價(jià)陽離子具有其自身的特異性。 Chhibber S等[21]研究金屬離子在MRSA噬菌體增殖和產(chǎn)量中的作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，5 mmol/L CaCl2顯著提高了噬菌體的發(fā)酵產(chǎn)量，并有效縮短了噬菌體的吸附時(shí)間。作用機(jī)理主要是培養(yǎng)基中鈣離子可以中和宿主細(xì)胞表面聚合物與噬菌體表面之間的電荷，降低排斥力，促進(jìn)噬菌體MR-10的初次附著。而習(xí)羽[22]在研究二價(jià)陽離子對一株烈性乳桿菌噬菌體吸附的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，在吸附45 min后，加Ca2+的試驗(yàn)組可達(dá)到96.22%的吸附率，空白試驗(yàn)組為63.78%，而加Mg2+的試驗(yàn)組只有19.5%，鈣離子顯著提高了乳桿菌噬菌體的吸附能力，而鎂離子抑制了乳桿菌噬菌體的吸附。

1.5 pH對噬菌體發(fā)酵的影響。

噬菌體的發(fā)酵pH一般為中性，pH偏高或偏低都會(huì)對噬菌體的發(fā)酵產(chǎn)生很大影響，適宜的pH發(fā)酵條件可以獲得高效價(jià)的噬菌體發(fā)酵產(chǎn)物。噬菌體的發(fā)酵環(huán)境是影響噬菌體發(fā)酵的主要因素，培養(yǎng)基的pH會(huì)對噬菌體及其宿主菌的生長造成很大的影響，pH的變化會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)基中離子濃度的變化，在一定程度上會(huì)影響噬菌體的吸附，從而影響噬菌體的增殖[23]。張志平等[24]在熒光假單胞菌噬菌體的研究中發(fā)現(xiàn)，該噬菌體的最佳感染pH 在7.5～8.0之間，超出此pH范圍，噬菌體的增殖受到了明顯的抑制。不僅不同的pH會(huì)影響噬菌體的增殖，在發(fā)酵過程中調(diào)控pH與不調(diào)控pH，對噬菌體發(fā)酵的最終效價(jià)也會(huì)產(chǎn)生很大的影響。Grieco發(fā)現(xiàn)，與發(fā)酵過程中不調(diào)控pH的噬菌體發(fā)酵相比，調(diào)控pH保持在7.4進(jìn)行的發(fā)酵噬菌體產(chǎn)量增加了165%，高于沒有任何pH控制的水平。因此，在發(fā)酵過程中控制pH可以顯著提高噬菌體的發(fā)酵產(chǎn)量[18]。

另外。噬菌體發(fā)酵過程中對溫度、溶氧和轉(zhuǎn)速的控制也是非常重要的發(fā)酵參數(shù)，溫度會(huì)影響宿主菌和噬菌體內(nèi)的酶發(fā)揮作用，選擇宿主菌和噬菌體最適的生長溫度，可以有效提高噬菌體發(fā)酵的最終產(chǎn)量。溶氧和轉(zhuǎn)速主要控制噬菌體發(fā)酵過程中的溶氧和培養(yǎng)基均勻度，摸索不同噬菌體的最適溶氧和轉(zhuǎn)速，可以保證噬菌體的能量供應(yīng)，獲得較高的噬菌體產(chǎn)量。

2 總結(jié)與展望

細(xì)菌的耐藥性問題已經(jīng)成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)學(xué)的主要問題，2016年G20峰會(huì)，細(xì)菌的耐藥性威脅被寫進(jìn)公告，2016年我國農(nóng)業(yè)部2428號(hào)公告決定停止硫酸黏桿菌素用于動(dòng)物促生長。噬菌體作為新一代抗菌劑的代表，其作用效果已經(jīng)被證實(shí)，目前噬菌體已經(jīng)被批準(zhǔn)用于銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、腸炎沙門菌等多種細(xì)菌的控制中。美國和歐洲等國家也批準(zhǔn)了噬菌體產(chǎn)品的上市。噬菌體產(chǎn)品以其綠色、安全、有效的優(yōu)勢，成為適合解決細(xì)菌耐藥性問題的重要選擇。

噬菌體的發(fā)酵是噬菌體產(chǎn)品工業(yè)化的關(guān)鍵，本文綜述了目前研究發(fā)現(xiàn)的影響噬菌體發(fā)酵的主要因素，其中噬菌體和宿主菌、最佳MOI、培養(yǎng)基、離子和pH是影響噬菌體發(fā)酵的主要因素，另外，溫度、溶氧和轉(zhuǎn)速也是影響噬菌體發(fā)酵的重要因素。因此，噬菌體的發(fā)酵可以從上述方面進(jìn)行摸索和研究，獲得適宜工業(yè)化生產(chǎn)的噬菌體發(fā)酵條件。

目前對噬菌體發(fā)酵的研究還較少，對影響噬菌體發(fā)酵條件的原理研究也較少。隨著噬菌體應(yīng)用越來越廣泛，噬菌體的需求量會(huì)越來越多，噬菌體的大規(guī)模生產(chǎn)已成必然之勢，因此，針對噬菌體發(fā)酵條件的摸索還要繼續(xù)深入。比如，針對影響噬菌體發(fā)酵的因素進(jìn)行原理的研究及條件的優(yōu)化，針對不同的致病菌開發(fā)不同的噬菌體發(fā)酵工藝，研究不同噬菌體如肌尾噬菌體、長尾噬菌體和短尾噬菌體等的發(fā)酵工藝，對噬菌體發(fā)酵中的安全問題進(jìn)行研究等，這都是下一步研究需要解決的問題。