鄧秀玲 扈瑞平 李薇

【摘要】目的：研究蒙藥壯西-21對體外培養(yǎng)的人胃癌細胞生長的影響。方法：采用不同濃度蒙藥處理細胞后，通過MTT法檢測該藥對胃癌細胞生長的影響，應用熒光顯微鏡觀察細胞形態(tài)改變。結(jié)果：MTT顯示，蒙藥壯西-21能抑制人胃癌細胞的生長，呈現(xiàn)濃度依賴性;熒光鏡下可見藥物作用后，胃癌細胞呈現(xiàn)凋亡細胞的形態(tài)改變。結(jié)論：蒙藥壯西-21對胃癌細胞的生長具有明顯的抑制作用。

【關鍵詞】壯西-21;胃癌;生長抑制

【中圖分類號】R29【文獻標志碼】A【文章編號】1007-8517（2019）8-0033-03

Abstract：ObjectiveTostudytheeffectofMongoliadrugzhuangxi-21ongrowthofgastriccancercellsinvitro.MethodsMTTassaywasusedtodetectthegrowtheffectofzhuangxi-21ongastriccells，andthecellmorphologicchangeswasobservedbyfluorescencemicroscope.ResultsMTTassayshowedzhuangxi-21hasasignificantinhibitoryeffectontheproliferationofgastriccancercells，anditsinhibitoryeffectisenhancedwiththeincreaseofconcentration;morphologicchangesofapoptosiswereobservedbyfluorescencemicroscope.Conclusionzhuangxi-21hassignificantinhibitionofproliferationforgastriccancercellsinvitro.

Keywords：Zhuangxi-21;GastricCancerCells;GrowthInhibition

在我國胃癌的發(fā)病率居各種惡性腫瘤的第二位，其異質(zhì)性強，預后較差。目前對于胃癌的治療主要采用手術、化療和放療三大手段，臨床上常用的化療和放療藥物，在殺傷腫瘤細胞的同時也給人體帶來不同程度地損傷或不良反應[1]。臨床實踐表明，蒙藥在抗腫瘤方面有一定的優(yōu)勢，如藥理作用廣泛，不良反應小，不易產(chǎn)生耐藥性等[2]。

蒙藥壯西-21（以下簡稱壯西）是由寒水石等二十一味藥物組成的復方藥，臨床主要用于治療消化性潰瘍、慢性胃炎、胃癌等消化系統(tǒng)疾病[3-5]。壯西抗腫瘤作用主要來自臨床實踐中，雖然療效確切，但無進一步研究，特別是鮮見有從細胞、分子水平研究其作用機制的報道。本研究以體外培養(yǎng)的胃癌細胞為對象，觀察復方蒙藥壯西對胃癌細胞生長的影響。

1材料和方法

1.1試劑和儀器蒙藥壯西（內(nèi)蒙古國際蒙醫(yī)院），用PBS配成50mg/mL貯液，過濾除菌4℃保存?zhèn)溆?，實驗時用培養(yǎng)液稀釋到所需濃度。胃癌MGC-803細胞（北京腫瘤研究所提供），培養(yǎng)基DMEM（Gibco公司），胎牛血清（中國醫(yī)學科學院血液學研究所），紫杉醇（四川太極制藥有限公司），Hochest33342、碘化丙啶（PI）、塞唑藍（MTT）和二甲基亞砜（DMSO）（Sigama公司）。酶標儀（日本550型），CO2恒溫孵育箱（美國NAPCO），熒光顯微鏡（日本，NIKON）。

1.2細胞培養(yǎng)將胃癌MGC-803細胞置于含10%胎牛血清、80u/mL慶大霉素的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)于37℃含5%濕飽和CO2溫箱中，常規(guī)傳代，取對數(shù)生長期的細胞用于實驗。

1.3細胞的活力實驗MTT法，將培養(yǎng)的細胞調(diào)整濃度為3×104個/mL，接種于96孔板上，每孔0.2mL，培養(yǎng)24h，棄培養(yǎng)液，分別加入蒙藥壯西，使終濃度分別為：2.5、1.25、0.63、0.31、0.15mg/mL。另設陰性對照組（不加藥）、空白對照組（無細胞和藥）、陽性對照組（紫杉醇處理組）其作用終濃度為10-6mol/L，各組設8個復孔。以上各組總體積均為200μL。培養(yǎng)72h，每孔加入20μL5%MTT，37℃溫育4h，棄培養(yǎng)液加DMSO200μL，振蕩10min，酶標儀檢測570nm處吸光度OD值。按公式計算細胞生長抑制率。

抑制率=（對照組平均OD值-實驗組平均OD值）/（對照組平均OD值-空白組平均OD值）×100%

1.4細胞形態(tài)觀察：壯西作用細胞48h后，采用熒光雙染法觀察細胞形態(tài)變化。取1×106個細胞離心，經(jīng)PBS洗滌2次，重懸于200μLPBS中，分別加25μL熒光染料Hoechst33342和PI。37℃溫育8～10min，離心洗滌后滴片，于熒光顯微鏡下觀察細胞形態(tài)改變。

1.5統(tǒng)計學處理采用SPSS19.0軟件進行處理，所有數(shù)據(jù)用（x±s）表示，采用t檢驗進行統(tǒng)計。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1壯西對胃癌細胞的生長抑制作用壯西對胃癌MGC-803細胞的增殖有一定的抑制作用，其生長抑制率隨濃度的增加而升高，呈現(xiàn)濃度依賴性趨勢。壯西對胃癌細胞生長的最高抑制率達84.87%，高于陽性對照組紫杉醇的抑制率，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表1。

2.2壯西對細胞形態(tài)的影響倒置光顯微鏡下觀察到，正常培養(yǎng)的對照組細胞呈梭形貼壁生長，大小均勻，核圓居中，胞質(zhì)清亮透明。2.5mg/mL蒙藥處理組作用48h后，部分細胞失去正常生長形態(tài)，細胞變小變圓，胞質(zhì)亮度下降，胞膜皺縮、內(nèi)陷;隨著時間推移，細胞形狀不規(guī)則，最后破碎壞死。熒光鏡下可見，對照組細胞被Hoechst33342染色后，發(fā)出均勻的藍色熒光，大小一致，提示為正?；罴毎?2.5mg/mL處理組部分細胞的細胞核或細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)濃染致密的顆粒狀或塊狀熒光，提示為細胞染色質(zhì)凝集、核固縮或核碎裂，為凋亡細胞的形態(tài)改變。此外，鏡下見壞死細胞被PI紅染。如圖1所示。

3討論

細胞異常增殖和分化與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關，腫瘤治療的一個基本問題是如何抑制腫瘤細胞的無限增殖能力。蒙藥壯西-21，漢名為寒水石二十一味散，由寒水石、蓽撥、訶子、石榴、瞿麥、沙棘、五靈脂、砂仁、紫花地丁、木鱉子、人工牛黃、連翹、木香、降香、麥冬等二十一味藥物組成，其藥理作用是調(diào)體內(nèi)“赫依”“希拉”“巴達干”三根，具有保護消化道黏膜、抑制胃酸分泌的作用。組方中寒水石、蓽撥、五靈脂均具有抗腫瘤的作用[6]，但單體成分或提取物并不能反映蒙藥復方的廣泛藥理作用及蒙醫(yī)理論，而且蒙藥的臨床應用主要以復方制劑為主。為從細胞水平揭示蒙藥壯西的抗腫瘤作用，本實驗以體外培養(yǎng)的胃癌細胞為對象，觀察復方蒙藥壯西對胃癌細胞生長的影響。

MTT法是目前檢測藥物在體外對腫瘤細胞殺傷作用常用的方法之一，其原理是利用活細胞特別是增殖細胞內(nèi)將MTT氧化為藍紫色甲臜晶體，沉積于細胞內(nèi)，通過酶標儀檢測吸光度，了解細胞的存活情況，而死細胞則不能氧化MTT。本實驗通過MTT法觀察不同濃度的蒙藥壯西組對人胃癌細胞MGC-803生長的影響，結(jié)果表明壯西在體外能顯著抑制胃癌細胞的生長，尤以高濃度組的抑制率最高，且抑制作用隨藥物濃度的增加而增強，呈現(xiàn)劑量依賴的趨勢。2.5mg/mL藥物處理后對細胞的抑制率超過了紫杉醇組的抑制率。倒置光顯微鏡下見，蒙藥作用后細胞形態(tài)發(fā)生明顯的改變。采用熒光雙染法對胃癌細胞的形態(tài)學變化進行進一步觀察，發(fā)現(xiàn)胃癌細胞經(jīng)壯西作用后，部分細胞核凝集、碎裂成片狀，呈凋亡細胞的形態(tài)改變，還有部分細胞趨向壞死的改變，表明該藥在體外對胃癌細胞發(fā)揮生長抑制作用的機制之一，可能是誘導細胞凋亡。組方中的主藥寒水石在蒙醫(yī)中有不同的炮制方法，可用于治療不同的病癥[7]。其中寒水石與與訶子、硼砂、光明鹽、蓽茇、麥冬組成灰化小劑，趙立遠等[8]研究發(fā)現(xiàn)該化灰小劑可抑制S-180荷瘤小鼠的腫瘤的生長，其作用機制可能是通過調(diào)節(jié)免疫，調(diào)控凋亡相關蛋白的表達有關。本實驗也初步觀察到了壯西有誘導細胞凋亡的作用。本實驗僅觀察了蒙藥對胃癌細胞殺傷的生物學效應，其具體的作用機理尚需深入研究。

參考文獻

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[8]趙立遠，陸景坤，孫鵬，等.蒙藥寒水石化灰小劑對S-180荷瘤小鼠的抗腫瘤作用相關研究[J].中華中醫(yī)藥雜志（原中國醫(yī)藥學報），2016，31（12）：5232-5236.

（收稿日期：2019-02-18編輯：程鵬飛）