楊翠萍 蔡琨 宣錦

【摘要】目的：探討仙茅多糖對小鼠巨噬細胞吞噬活性的影響。方法：采用不同濃度的仙茅多糖（500，250，125，62.5，31.25μg/mL）分別處理小鼠腹腔原代巨噬細胞和小鼠巨噬細胞株RAW264.7細胞，36h后加入熒光標記的大腸桿菌，室溫避光孵育1.5h，熒光顯微鏡下觀察不同劑量的仙茅多糖對兩類細胞吞噬大腸桿菌活性的影響。結(jié)論：仙茅多糖呈劑量依賴性增強小鼠巨噬細胞的吞噬功能。

【關(guān)鍵詞】仙茅多糖;巨噬細胞;RAW264.7細胞;吞噬活性

【中圖分類號】R285.5【文獻標志碼】A【文章編號】1007-8517（2019）8-0020-04

Abstract：ObjectiveTodiscusstheeffectsofcurculigoorchioidespolysaccharide（COP）onphagocyticactivityofmousemacrophages.MethodsTheprimaryperitonealmacrophagesofmiceandRAW264.7cellsofmousemacrophagecelllineweretreatedwithdifferentconcentrationsofFestucaarundinaceapolysaccharides（500，250，125，62.5，31.25μg/mL）respectively.After36hours，fluorescentlabeledEscherichiacoliwasaddedandincubatedatroomtemperaturewithoutlightfor1.5hours.Theeffectsofdifferentdosesofcitronellapolysaccharideonthephagocyticactivityoftwokindsofcellswereobservedunderfluorescencemicroscope.ConclusionCurculigoorchioidespolysaccharideenhancedthephagocyticfunctionofmousemacrophagesinadose-dependentmanner.

Keywords：CurculigoOrchioidesPolysaccharide;Macrophage;RAW264.7Cell;PhagocyticActivity

多糖是一類存在于動植物和微生物中的天然高分子化合物，具有重要的生物功能和寶貴的藥用價值[1]。研究認為植物多糖普遍具有調(diào)節(jié)機體免疫功能的活性，尤其對機體非特異性免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)效應(yīng)比較顯著[2-4]。仙茅（CurculigoorchioidesGaertn）是石蒜科多年生草本植物，其藥用部位為根莖，其性溫，入腎，肝經(jīng)，主要功效有補腎助陽、益精血、強筋骨和行血消腫，主要用于腎陽不足、虛勞內(nèi)傷和筋骨疼痛等病癥[5]，仙茅多糖（Curculigoorchioidespolysaccharide，COP）是仙茅的水提醇沉部分，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)仙茅多糖能調(diào)節(jié)小鼠免疫功能，也能通過增加小鼠巨噬細胞株RAW264.7分泌活性因子TNF-α和NO，促進巨噬細胞的活化[6-7]。巨噬細胞是機體內(nèi)重要的非特異性免疫細胞，具有吞噬、清除病原體的，同時巨噬細胞也是許多多糖的主要作用靶細胞[8-9]。因此本實驗擬將仙茅多糖分別作用于小鼠巨噬細胞株RAW264.7和小鼠腹腔原代巨噬細胞，探討仙茅多糖對小鼠巨噬細胞吞噬活性的影響。

1材料與儀器

1.1動物SPF級昆明種小鼠，雌性（雌性小鼠與雄性小鼠腹腔巨噬細胞的非特異性免疫功能沒有差異），2月齡，體質(zhì)量為18～22g，購自長沙天勤動物實驗中心，合格證號：SCXK（湘）2014-001，飼養(yǎng)于實驗室獨立送風(fēng)飼養(yǎng)籠具中。

1.2細胞株小鼠單核巨噬細胞株RAW264.7購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會昆明細胞庫（編號：KCB200603YJ）。

1.3試劑仙茅藥材購買于貴陽市萬東橋藥材市場，經(jīng)貴陽中醫(yī)學(xué)院孫慶文教授鑒定為仙茅CurculigoorchioidesGaertn的根;熒光標記大腸桿菌（V6694）購買于美國BD公司;DAPI溶液（C0065）、抗熒光衰減封片劑（S2100）購買自北京索萊寶科技有限公司。營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（070912）購買于上海中科昆蟲生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.4儀器CO2培養(yǎng)箱（NewBrunswickGalaxy170s），熒光倒置顯微鏡（OLYMPUSU-RFL-T），生物安全柜（HaierHR60-HA2）。

2方法

2.1仙茅多糖的制備及濃度配置參照文獻[10]制備仙茅多糖，仙茅根塊曬干粉碎后用75%～80%的乙醇脫脂處理后風(fēng)干打粉。稱取5g干粉溶解于175mL蒸餾水中，于95℃水浴加熱提取150min。抽濾并收集濾液，殘渣按上述方法重復(fù)提取2次。濾液合并，減壓濃縮至一定體積后，加入終體積分數(shù)不低于80%食用酒精沉淀。抽濾后沉淀物分別用90%酒精和丙酮洗滌，真空干燥后采用苯酚法測定其中多糖的含量為50%。仙茅多糖用無血清DMEM培養(yǎng)基中配制成濃度為500μg/mL的母液，濾菌后4℃保存，實驗時用DMEM培養(yǎng)基稀釋即得。

2.2RAW264.7細胞培養(yǎng)用含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基（含青霉素1×105U/L、鏈霉素1×105U/L，pH7.2～7.4）置于5%CO2、37℃條件下培養(yǎng)。細胞傳至第3代，通過細胞形態(tài)學(xué)觀察，3～6代細胞用于實驗。

2.3小鼠腹腔原代巨噬細胞提取參照文獻[11-12]提取小鼠腹腔原代巨噬細胞，實驗前3天給小鼠腹腔注射5%淀粉營養(yǎng)肉湯，每只小鼠注射1mL、每天注射1次。干預(yù)結(jié)束后，小鼠脫頸處死并用75%酒精消毒，在無菌條件下，充分暴露小鼠腹部肌層，腹腔注入10mL含雙抗的DMEM培養(yǎng)基，輕揉腹部5min，然后吸取小鼠腹腔細胞懸液，移入離心管中，離心3000r/min，5min，用預(yù)冷PBS洗2次;得到細胞接種于24孔板，每孔接種細胞106個，共18孔，培養(yǎng)4h細胞貼壁，用預(yù)冷PBS洗2次，即得小鼠腹腔原代巨噬細胞。

2.4細胞培養(yǎng)及處理將RAW264.7細胞和小鼠腹腔原代巨噬細胞接種于24孔板中，待細胞貼壁后，吸棄上清，分別加入含不同濃度仙茅多糖的DMEM培養(yǎng)基，使仙茅多糖濃度為500，250，125，62.5，31.25，0μg/mL，每組設(shè)3個平行孔，分別刺激36h。

2.5巨噬細胞吞噬熒光標記大腸桿菌培養(yǎng)結(jié)束后，吸棄上清，預(yù)冷PBS洗2次，加入以雙蒸水200倍稀釋的熒光標記大腸桿菌溶液（1mL/孔），室溫避光孵育1.5h。干預(yù)結(jié)束后，吸棄上清，臺盼藍染色5min，PBS洗5次，每次3min，加入4%多聚甲醛固定細胞。最后以DAPI染核5Smin，取出爬片蓋于載玻片上，滴加抗熒光衰減封片劑并封片，于熒光倒置顯微鏡下觀察。

2.6巨噬細胞吞噬百分率玻片于熒光倒置顯微鏡下觀察200個細胞，記錄吞噬熒光標記大腸桿菌的巨噬細胞數(shù)量;吞噬百分率（PP%）=200個巨噬細胞內(nèi)吞噬熒光標記大腸桿菌的巨噬細胞數(shù)量/200個細胞巨噬細胞總數(shù)×100%。

2.7統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，組間采用單因素方差分析進行顯著性檢驗，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3結(jié)果

3.1仙茅多糖對RAW264.7細胞吞噬作用的影響如圖1所示，各組RAW264.7細胞吞噬熒光標記大腸桿菌后，細胞形態(tài)輪廓清晰，形狀呈圓形或橢圓形。正常對照組明顯可見RAW264.7細胞有吞噬熒光標記大腸桿菌;與正常對照組比較，仙茅多糖組細胞吞噬熒光標記大腸桿菌明顯較多。表1所示，仙茅多糖組細胞吞噬百分率都比正常對照組細胞吞噬百分率顯著性增高（P<0.01），仙茅多糖在濃度為31.25～500μg/mL范圍內(nèi)能增強RAW264.7細胞吞噬能力，且呈現(xiàn)出良好的量效關(guān)系。提示仙茅多糖能增強RAW264.7細胞的吞噬功能。

3.2仙茅多糖對小鼠腹腔原代巨噬細胞吞噬作用的影響如圖2所示，小鼠腹腔原代巨噬細胞吞噬熒光標記大腸桿菌后，細胞形態(tài)輪廓清晰，形狀呈圓形或橢圓形。正常對照組明顯可見小鼠腹腔原代巨噬細胞有吞噬熒光標記大腸桿菌;與正常對照組比較，仙茅多糖組細胞吞噬熒光標記大腸桿菌明顯較多。表2所示，仙茅多糖125～500μg/mL組細胞吞噬百分率都比正常對照組吞噬百分率顯著性增高（P<0.05或P<0.01），仙茅多糖在濃度為125～500μg/mL范圍內(nèi)可以增強小鼠腹腔原代巨噬細胞吞噬熒光標記大腸桿菌的能力，且呈現(xiàn)出較好的量效關(guān)系。提示仙茅多糖能增強小鼠腹腔原代巨噬細胞的吞噬功能。

4討論

巨噬細胞在正常機體的免疫防御過程中扮演著重要的角色，參與機體抗感染、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等過程，是機體非特異性免疫防御的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。由于小鼠和人具有同源性，許多學(xué)者以小鼠來源的巨噬細胞作為細胞模型研究人類巨噬細胞生理、病理免疫反應(yīng)。研究表明不同來源的巨噬細胞在復(fù)雜微環(huán)境中，其細胞形態(tài)、功能、表型會產(chǎn)生一系列復(fù)雜的變化[10]。所以，體外研究不同來源的小鼠巨噬細胞對了解人體巨噬細胞免疫反應(yīng)（如吞噬、細胞因子分泌）具有重要意義。小鼠腹腔原代巨噬細胞是通過無菌性炎癥刺激獲取的，此細胞很好地保留了外周巨噬細胞的許多生理學(xué)特性，是比較接近生理狀態(tài)的巨噬細胞。巨噬細胞株RAW264.7細胞源自Abelson鼠科的腹腔巨噬細胞，是一種白血病病毒誘導(dǎo)的腫瘤細胞，其生理狀態(tài)、某些基因或細胞因子表達（其sIg-，Ia-、Thy1.2-表面抗原陰性）發(fā)生了改變，采用此細胞不可避免的會影響實驗結(jié)果的準確性。因此，本實驗采用不同來源的小鼠巨噬細胞，以求更準確的探討仙茅多糖對巨噬細胞吞噬活性的影響。結(jié)果表明，仙茅多糖能增強這兩種不同來源的小鼠巨噬細胞的吞噬功能，并且呈劑量依賴性增強小鼠巨噬細胞的吞噬功能。

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（收稿日期：2019-03-01編輯：劉斌）