王華林 程麗飛 盧偉龍

【摘要】目的：研究柴胡-黃芩藥對的不同分離部位對過氧化氫（H2O2）刺激的肝星狀細(xì)胞增殖的影響，探討柴胡-黃芩藥對抗肝纖維化主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。方法：柴胡-黃芩水提液經(jīng)D101型大孔吸附樹脂吸附，依次用水、30%、60%和90%的乙醇梯度洗脫，分別得到水洗脫部位（A）、30%乙醇洗脫部位（B）、60%乙醇洗脫部位（C）及90%乙醇洗脫部位（D）。體外培養(yǎng)肝星狀細(xì)胞，采用不同濃度的H2O2刺激肝星狀細(xì)胞增殖，篩選最佳造模濃度，然后用柴胡-黃芩藥對水提液及A、B、C、D的高、中、低劑量組進(jìn)行干預(yù)24h。采用MTT法測定各組肝星狀細(xì)胞的抑制情況;應(yīng)用ELISA法檢測細(xì)胞上清液中透明質(zhì)酸酶（hy-aluronidase，HA）、層黏連蛋白（laminin，LN）、Ⅲ型前膠原（procollagenⅢ，PCⅢ）、Ⅳ型膠原（collagentypeⅣ，Ⅳ-C）的濃度。結(jié)果：結(jié)果顯示，5μmol/L的H2O2能顯著刺激肝星狀細(xì)胞增殖，柴胡-黃芩藥對及其各分離部位對H2O2刺激的肝星狀細(xì)胞增殖均具有一定的抑制作用，而且能夠?qū)⒌虷A、LN、PCⅢ、Ⅳ-C的細(xì)胞釋放水平，具有劑量相關(guān)性，其中B、C高劑量組對其抑制作用最為明顯，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)論：柴胡-黃芩藥對及其30%、60%乙醇洗脫部位對H2O2刺激的肝星狀細(xì)胞增殖均具有一定的抑制作用，30%、60%乙醇洗脫部位可能是柴胡-黃芩藥對抗肝纖維化主要有效部位。

【關(guān)鍵詞】柴胡-黃芩藥對;肝星狀細(xì)胞;不同分離部位;H2O2;肝纖維化

【中圖分類號(hào)】R285.5【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A【文章編號(hào)】1007-8517（2019）8-0024-05

Abstract：ObjectiveTostudytheeffectofdifferentfractionsofBupleurium-Scutellariaontheproliferationofhepaticstellatecellsstimulatedbyhydrogenperoxide（H2O2）.InordertoseekforthebasisofthemainpharmacodynamicsubstancesofBupleurium-Scutellariainanti-hepaticfibrosis.MethodsBupleurium-ScutellariawaterextractionliquidwasadsorbedbyD101macroporousresin，afterbeingelutedbywater，30%，60%and90%ethanol，respectivelygetwater-elutedfraction（A），30%ethanol-elutedfraction（B），60%ethanol-elutedfraction（C）and90%ethanol-elutedfraction（D）.TheHSCofratwasculturedinvitro，withdifferentconcentrationsofH2O2tostimulatetheproliferationofhepaticstellatecell，screeningtheoptimumconcentration，usingthehigh，mediumandlowdosegroupofBupleuri-ScutellariaewaterextractionliquidandA，B，C，Dtointervenefor24h.TomeasuretheinhibitionofhepaticstellatecellsbyMTTassay.TheHA，LN，PCⅢ，Ⅳ-CconcentrationinthecellsupernatantwasdetectedbyELISA.ResultsTheexperimentalresultsshowthatthetendencytowards5μmol/LH2O2couldsignificantlystimulatetheproliferationofhepaticstellatecell，Bupleurium-ScutellariaanditsdifferentfractionshavecertaininhibitiontotheproliferationofhepaticstellatecellbyH2O2stimulated，anditcanreducethereleaselevelofHA，LN，PCⅢ，Ⅳ-Cincell.Therewasacertaindosecorrelation.amongthem，BandChighdosegroupoftheinhibitoryeffectismostobvious，Therewereacertainstatisticallysignificant（P<0.01）.ConclusionBupleuri-Scutellariaeandits30%，60%ethanol-elutedfractionshavecertaininhibitoryeffectontheproliferationofhepaticstellatecellsstimulatedbyH2O2.30%ethanol-elutedfractionand60%ethanol-elutedfractionmaybethemaineffectivepartforBupleuri-Scutellariaeinanti-hepaticfibrosis.

Keywords：Bupleurium-Scutellaria;HSC;DifferentFractions;H2O2;HepaticFibrosis

肝纖維化是指肝臟內(nèi)彌漫性細(xì)胞外基質(zhì)（特別是膠原物質(zhì)）的過度沉積[1]，是各種病因引起的肝臟損傷后的一種損傷修復(fù)反應(yīng)，其中肝星狀細(xì)胞（Hepaticstellatecell，HSC）的活化是關(guān)鍵，因?yàn)楦闻K受損后HSC活化是細(xì)胞外基質(zhì)的主要來源。氧化應(yīng)激是造成HSC活化增殖的重要因素，研究表明氧化應(yīng)激相關(guān)分子過氧化氫（H2O2）能夠刺激HSC活化增殖，改變細(xì)胞外基質(zhì)的沉降[2-3]。

隨著肝組織的持續(xù)損傷，增生的纖維組織逐步取代正常的肝組織，最終發(fā)展成為肝硬化，其在全球呈現(xiàn)出高發(fā)病率以及高死亡率[4]。肝纖維化是各種慢性肝病發(fā)展成為肝硬化的一個(gè)中間環(huán)節(jié)。肝纖維化屬于可逆性病變[5]，若在臨床早期采取抗肝纖維化治療，將對慢性肝病的治療以及阻止肝硬化的發(fā)生會(huì)產(chǎn)生非常積極的作用。目前，在抗肝纖維化方面中醫(yī)藥表現(xiàn)出獨(dú)特的療效，而且多是采用舒肝理氣、活血類中藥，其對于多種慢性肝病的治療具有積極意義[6]。課題組前期研究表明，柴胡-黃芩配伍水煎液對大鼠肝纖維化模型具有良好的保護(hù)作用[7]，但對于柴胡-黃芩藥對抗肝纖維化的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)尚未見報(bào)道，故本實(shí)驗(yàn)在建立體外H2O2刺激HSC活化增殖的基礎(chǔ)上，觀察柴胡-黃芩藥對不同分離部位的抗肝纖維化作用，以期尋找柴胡-黃芩藥對抗肝纖維化主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，為進(jìn)一步研究抗肝纖維化藥物開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試藥中藥材柴胡和黃芩均購自陜西中醫(yī)藥大學(xué)校醫(yī)院中藥房，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)生藥教研室教師鑒定為正品，符合2015版《中華人民共和國藥典》規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)。

1.2細(xì)胞大鼠肝星狀細(xì)胞株HSC-T6，購自灝洋生物公司。

1.3試劑與材料胎牛血清（批號(hào)：FB-10，美國KIRGEN公司）;DMEM-H（美國Hyclone公司）;胰蛋白酶（批號(hào)：1939066）、青鏈霉素雙抗（批號(hào)：1924794）美國Gibco公司;透明質(zhì)酸酶試劑盒（hy-aluronidase，HA，批號(hào)：201805）、層黏連蛋白試劑盒（laminin，LN，批號(hào)：201805）、Ⅲ型前膠原試劑盒（procollagenⅢ，PCⅢ，批號(hào)：201805）、Ⅳ型膠原試劑盒（collagentypeⅣ，Ⅳ-C，批號(hào)：201805）購自上海優(yōu)選生物科技有限公司;MTT（3-（4，5-二甲基-2-噻唑）-2，5-四氮唑溴鹽）（批號(hào)：EZ2811B347，美國Sigma公司）;乙醇為分析純（天津市天力化學(xué)試劑有限公司）;D101大孔吸附樹脂（天津市海光化工有限公司）;30%H2O2（天津北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司）。

1.4儀器CO2培養(yǎng)箱（新加坡ESCO）;倒置顯微鏡（奧特BDS200）;酶標(biāo)儀（美國BioTekELx808）;離心機(jī)（湘儀L530）;雙人型超凈工作臺(tái)（新加坡ESCO）;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52A（上海亞榮生化儀器廠）。

1.5方法

1.5.1柴胡-黃芩水提液的制備參照文獻(xiàn)及課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果[8]，柴胡飲片50g、黃芩飲片25g，共75g，加入8倍量水浸泡30min，煎煮，并保持沸騰30min;過濾，再加入8倍量水煎煮30min。過濾，合并兩次濾液混勻濃縮至150mL，即得濃度為0.5g/mL的柴胡-黃芩水提液。將得到的柴胡-黃芩水提液平均分成兩份，一份用于分離制備不同部位，一份進(jìn)行干燥得干粉用于后續(xù)體外實(shí)驗(yàn)。

1.5.2柴胡-黃芩不同分離部位的制備參照文獻(xiàn)方法制備柴胡-黃芩不同分離部位[9-11]，將上述0.5g/mL的柴胡-黃芩水提液上D101大孔吸附樹脂柱，徑高比為1∶10以上，依次用水和30%，60%，90%乙醇梯度洗脫，收集洗脫液，得到水和30%，60%，90%乙醇洗脫4個(gè)不同極性部位，即水洗脫部位（A）、30%乙醇洗脫部位（B）、60%乙醇洗脫部位（C）、90%乙醇洗脫部位（D），分別干燥得干燥粉末。

1.5.3大鼠HSC的培養(yǎng)將大鼠肝星狀細(xì)胞株（HSC-T6）于DMEM高糖培養(yǎng)基（含10%的胎牛血清、100kU/L青霉素、100mg/L鏈霉素），37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并傳代。取對數(shù)生長的HSC，以5×104（個(gè)）/mL濃度接種到96孔培養(yǎng)板中過夜。

1.5.4H2O2刺激HSC增殖模型的建立參照文獻(xiàn)方法建立H2O2刺激的HSC增殖模型[2-3]。將30%H2O2用無血清培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋，分別配制成為終濃度為0、1.25、2.5、5、10、20μmol/L的H2O2溶液。加入到細(xì)胞貼壁后的96孔板中，每個(gè)濃度分別設(shè)6個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24h后，每孔加入5mg/mL的MTT溶液20μL，置培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4h后，吸凈孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔加入150μLDMSO，震蕩10min，酶標(biāo)儀單波長檢測OD值。按下列公式計(jì)算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率%=（試驗(yàn)組OD值/對照組OD值）×100%。

1.5.5藥物處理實(shí)驗(yàn)分組如下：對照組（無藥物處理），H2O2模型組（5μmol/LH2O2作用24h），給藥組（5μmol/LH2O2作用24h后，再用柴胡-黃芩及A、B、C、D高中低劑量作用24h）。

1.5.6柴胡-黃芩及其不同分離部位對H2O2刺激的HSC增殖的影響各組培養(yǎng)24h后，加入5mg/mLMTT20μL，37℃孵育4h，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入DMSO150μL，低速震蕩10min，以充分溶解被還原的MTT結(jié)晶，酶標(biāo)儀單波長檢測OD值。

1.5.7柴胡-黃芩及其不同分離部位對H2O2刺激的HSC分泌HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C的影響各組培養(yǎng)24h后，收集細(xì)胞上清液，參照試劑盒使用說明書，應(yīng)用ELISA法檢測HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C的含量。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用SPSS13.0計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，研究數(shù)據(jù)資料以（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1H2O2刺激HSC增殖模型的建立在H2O2濃度0～5μmol/L范圍內(nèi)時(shí)，H2O2對HSC具有活化促增殖作用，且具有一定的劑量相關(guān)性;在H2O2濃度為5μmol/L時(shí)對HSC具有明顯的活化促增殖作用（P<0.01）;在H2O2濃度大于5μmol/L時(shí)，隨著濃度的不斷增大，H2O2對HSC的激活作用逐漸減弱，且在H2O2濃度為20μmol/L時(shí)HSC的存活率僅50%左右，H2O2對HSC表現(xiàn)為顯著的抑制作用（P<0.01）。綜上所述，本課題組選用5μmol/LH2O2作用24h作為HSC的增殖模型。如圖1所示。

2.2柴胡-黃芩及其不同分離部位對H2O2刺激的HSC增殖的影響與對照組比較，H2O2干預(yù)后，能夠顯著促進(jìn)HSC的增殖（P<0.01）;與H2O2組相比，柴胡-黃芩組（高、中劑量組）、A組（高劑量組）、B組（高、中劑量組）、C組（高、中劑量組）及D組（高劑量組）對H2O2誘導(dǎo)的HSC增殖均具有一定的抑制作用，其中柴胡-黃芩高劑量組及B組高劑量組、C組高劑量組對H2O2誘導(dǎo)的HSC增殖具有尤其明顯的抑制作用（P<0.01）。見表1。

2.3柴胡-黃芩及其不同分離部位對H2O2刺激的HSC分泌HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C的影響與對照組比較，H2O2作用于HSC后，HSC分泌的HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C含量明顯升高;與H2O2組比較，柴胡-黃芩組及A組、B組、C組、D組可以明顯降低H2O2誘導(dǎo)的HSC細(xì)胞分泌的HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C的含量，其中柴胡-黃芩組高劑量組、A組高劑量組及B組高劑量組對其作用最為明顯（P<0.01）。見表2。

3討論

HSC的激活過程是肝臟膠原產(chǎn)生和肝纖維化形成的重要環(huán)節(jié)。在一系列刺激因素的作用下，HSC被活化轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細(xì)胞，細(xì)胞大量增殖，合成細(xì)胞外基質(zhì)，在肝臟內(nèi)大量沉積，造成肝纖維化。氧化應(yīng)激在HSC的活化和細(xì)胞外基質(zhì)生成中具有重要作用，H2O2是氧化應(yīng)激的相關(guān)分子，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)H2O2能夠刺激HSC活化和細(xì)胞外基質(zhì)的生成[2-3]。

肝纖維化是慢性肝病發(fā)展成肝硬化的必經(jīng)階段?，F(xiàn)研究認(rèn)為肝纖維化是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程，屬于可逆性病變[5]，而肝硬化則是一種不可逆性病變。因此，抗肝纖維化則成為治療慢性肝病以及預(yù)防肝硬化的重要目標(biāo)。源自漢代張仲景的小柴胡湯是臨床治療肝病的常用方劑，具有確切的抗肝纖維化療效[12-14]，柴胡-黃芩是小柴胡湯的核心藥對。本課題組前期以小柴胡湯中的核心藥對柴胡-黃芩的抗肝纖維化作用為切入點(diǎn)，研究發(fā)現(xiàn)其水提液具有確切抗肝纖維化作用[7]。為了進(jìn)一步探究柴胡-黃芩藥對抗肝纖維化的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，篩選出其發(fā)揮抗肝纖維化作用的有效部位，故本實(shí)驗(yàn)在建立體外H2O2刺激HSC活化增殖的基礎(chǔ)上，觀察柴胡-黃芩藥對不同分離部位的抗肝纖維化作用。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組相比，HSC經(jīng)H2O2刺激后，大量增殖，其細(xì)胞培養(yǎng)液中HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C的含量顯著增加。由此可見，H2O2對于HSC具有一定的激活促增殖作用，使肝纖維化相關(guān)因子HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C分泌顯著增加，顯現(xiàn)出肝纖維化傾向。給予柴胡-黃芩藥對及其不同分離部位的高、中、低劑量干預(yù)后，各給藥組中的HSC的增殖均受到抑制，HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C含量也有所降低，其中柴胡-黃芩及B、C高劑量組中的HSC受到的抑制作用最為明顯，具有一定的劑量相關(guān)性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。

綜上所述，柴胡-黃芩藥對及其B、C部位對H2O2刺激的肝星狀細(xì)胞增殖具有一定的抑制作用，B、C可能是柴胡-黃芩抗肝纖維化的主要有效部位。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道柴胡中主要含多糖、皂苷、揮發(fā)油、黃酮、甾醇類等成分[15]，黃芩中主要含黃酮、萜類、苷類、揮發(fā)油等成分[16]。根據(jù)各成分的性質(zhì)推測B、C中可能含有的成分為皂苷、黃酮苷類等成分，但其具體成分有待進(jìn)一步研究。單味中藥本身所含成分復(fù)雜多樣，藥對及復(fù)方甚之，且中醫(yī)復(fù)方講求整體性以及多種成分之間的相互關(guān)系，兩味中藥共同煎煮會(huì)出現(xiàn)怎樣的成分變化，以及不同分離部位進(jìn)行重新配伍組合以后會(huì)出現(xiàn)怎樣的現(xiàn)象，有待進(jìn)一步的研究，以期為抗肝纖維化中藥研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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（收稿日期：2019-02-02編輯：程鵬飛）