李寶紅，李盡文，歐陽(yáng)貴錦，許月瑩，梁淇峰，黎梓蕊，李 莉

(廣東醫(yī)科大學(xué)東莞科研中心 藥學(xué)院，廣東 東莞 523808)

肝臟是重要而復(fù)雜的代謝生理器官，被喻為“人體最大的化工廠”。在我國(guó)，肝臟疾病發(fā)病率高且范圍廣，給人們的健康和生活造成了極大的危害和負(fù)擔(dān)[1]。因此，尋找有效的預(yù)防和治療因各種原因所致的肝損傷的藥物或功能食品，具有廣闊的前景和深遠(yuǎn)的意義。

近些年來(lái)，隨著提取、純化工藝的迅速發(fā)展，天然產(chǎn)物藥物治療疾病得到大量學(xué)者的關(guān)注和認(rèn)可，取得了很大進(jìn)展；此類藥物具有多靶點(diǎn)、副作用小的特點(diǎn)，對(duì)有效預(yù)防和治療肝損傷的防治有一定的優(yōu)勢(shì)。朝鮮當(dāng)歸(Angelica gigas Nakai)，味辛性溫，主要分布于韓國(guó)、朝鮮、日本及我國(guó)東北各省。紫花前胡素是香豆素類化合物，是朝鮮當(dāng)歸的主要藥效成分，具有廣泛的藥理作用。研究表明，紫花前胡素可以用于治療白血病、糖尿病、高血壓、腎毒素以及腫瘤等，效果良好[2-3]。然而，目前紫花前胡素對(duì)四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)的急性肝損傷的作用鮮有報(bào)道。本研究擬采用CCl4誘導(dǎo)小鼠建立急性肝損傷模型，觀察紫花前胡素對(duì)急性肝損傷的影響，為其在藥物和保健品研發(fā)中的發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

四氯化碳(CCl4)、DPPH，美國(guó)Sigma公司；紫花前胡素，上海源葉生物科技有限公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒，碧云天生物科技有限公司；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試劑盒、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試劑盒、抑制與產(chǎn)生超氧陰離子自由基測(cè)定試劑盒、羥自由基測(cè)試試劑盒，南京建成生物技術(shù)有限公司；過(guò)硫酸鉀分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

清潔級(jí)雄性ICR小鼠購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SYXK(粵)2016-0167，飼養(yǎng)于廣東醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(粵)2015-0147，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(粵)2013-0008。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組、模型建立與給藥方法

將50只健康雄性ICR小鼠 (20±2 g) 每組10只隨機(jī)分組，正常對(duì)照組，CCl4肝損傷模型組，紫花前胡素低、中、高劑量組 (50,100,200 mg/kg)。給藥組分別按各劑量紫花前胡素進(jìn)行灌胃，正常組、模型組按等體積生理鹽水灌胃，共30 d，隔天給藥。末次給藥1 h后，正常組腹腔注射等體積玉米油，模型組和紫花前胡素給藥組腹腔注射10 mL/kg CCl4，禁食不禁水繼續(xù)飼養(yǎng)24 h。各組小鼠眼眶靜脈叢取血，離心取血清于4 ℃保存?zhèn)溆?。采血后處死小鼠，迅速取肝組織，用冷生理鹽水洗滌干凈，于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè)

按照試劑盒操作說(shuō)明書(shū)，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)各組小鼠血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)及天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)活性。

1.4 肝臟組織細(xì)胞色素酶CYP2E1檢測(cè)

取等量肝臟組織，剪碎后于勻漿器將肝臟組織勻漿，將勻漿液于4℃超速離心，取上清液。按照試劑盒操作說(shuō)明書(shū)，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)小鼠肝組織CYP2E1水平。

1.5 紫花前胡素清除超氧陰離子能力的檢測(cè)

以維生素E為陽(yáng)性對(duì)照，按照試劑盒操作說(shuō)明書(shū)，利用酶標(biāo)儀，于波長(zhǎng)550nm處比色，檢測(cè)紫花前胡素清除超氧陰離子能力。

1.6 紫花前胡素清除羥自由基能力的檢測(cè)

以維生素E為陽(yáng)性對(duì)照，按照試劑盒操作說(shuō)明書(shū)，利用可見(jiàn)分光光度計(jì)，于波長(zhǎng)550nm處比色，檢測(cè)紫花前胡素清除羥自由基能力。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)結(jié)果用x±s表示，利用Prism 5軟件，one-way ANOVA檢驗(yàn)，以p<0.05為顯著性差異，組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 紫花前胡素對(duì)CCl4誘導(dǎo)急性肝損傷小鼠血清ALT、AST活力的影響

表1 紫花前胡素對(duì)CCl4誘導(dǎo)急性 肝損傷小鼠血清ALT、AST活力的影響

注：與正常對(duì)照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05

如表1所示，在采用腹腔注射CCl4后，與正常組小鼠對(duì)比，模型組小鼠血清ALT和AST的活力顯著升高，表明造模成功。與模型組小鼠相比，紫花前胡素給藥組能夠顯著降低ALT和AST的活力，且呈濃度依賴性，表明小鼠提前給予紫花前胡素能夠?qū)Cl4誘導(dǎo)的急性肝損傷起到一定的緩解作用。

2.2 紫花前胡素對(duì)CCl4誘導(dǎo)急性肝損傷小鼠肝組織細(xì)胞色素酶CYP2E1的影響

圖1結(jié)果顯示，在采用腹腔注射CCl4后，與正常組小鼠對(duì)比，模型組小鼠CYP2E1的含量顯著升高，而提前給予低、中、高濃度紫花前胡素灌胃給藥后，與模型組比較，CYP2E1的含量顯著降低 (P < 0.05)，提示紫花前胡素可能通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體CYP2E1的含量來(lái)抵御CCl4誘導(dǎo)的肝損傷。

圖1 紫花前胡素對(duì)CCl4誘導(dǎo) 急性肝損傷小鼠肝組織CYP2E1的影響

2.3 紫花前胡素在體外對(duì)超氧陰離子及羥自由基的清除能力

紫花前胡素在體外，超氧陰離子及羥自由基的清除能力隨濃度增加呈上升趨勢(shì)，且與維生素E陽(yáng)性對(duì)照組的增強(qiáng)幅度相似，但其自由基清除效果不如同等濃度的維生素E陽(yáng)性對(duì)照組。

圖2 紫花前胡素在體外對(duì)超氧陰離子及羥自由基的清除能力

3 討論

本研究利用CCl4誘導(dǎo)小鼠建立急性肝損傷模型，觀察紫花前胡素對(duì)其保護(hù)作用及可能的機(jī)制。CCl4在肝細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)細(xì)胞色素酶CYP450作用，能夠生成三氯甲基(CCl3·)等自由基，而生成的自由基可以攻擊細(xì)胞膜脂質(zhì)雙分子層[4]，進(jìn)而改變細(xì)胞膜的通透性，肝細(xì)胞內(nèi)大量酶釋放到血液中，包括ALT及AST。因此，通過(guò)檢測(cè)血清中的ALT和AST的含量能夠判斷肝臟受損傷程度[5]。本研究結(jié)果表明，提前給予紫花前胡素對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃，可以有效抑制CCl4引起的血清ALT及AST的升高，提示紫花前胡素對(duì)CCl4導(dǎo)致的小鼠急性肝損傷具有一定的保護(hù)作用。而在進(jìn)一步檢測(cè)中，我們發(fā)現(xiàn)各濃度紫花前胡素處理組能夠有效抑制細(xì)胞色素酶CYP2E1的產(chǎn)生，提示紫花前胡素可能減少CCl3·等自由基的產(chǎn)生，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)其對(duì)肝損傷的保護(hù)作用。

此外，我們觀察了紫花前胡素在體外對(duì)自由基的清除能力。超氧陰離子和羥自由基均具有極強(qiáng)的氧化能力，能夠攻擊機(jī)體造成糖類、氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸及脂類等生物大分子，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞死亡[6]。我們的結(jié)果表明，在體外，紫花前胡素能夠有效的清除超氧陰離子及羥自由基，具有較強(qiáng)的抗氧化活性。因此，我們推測(cè)紫花前胡素能夠抗氧化進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)肝損傷的保護(hù)作用。

4 結(jié)論

研究結(jié)果表明，紫花前胡素對(duì)CCl4導(dǎo)致的小鼠急性肝損傷具有一定的保護(hù)作用，推測(cè)可能是通過(guò)抑制細(xì)胞色素酶CYP2E1的產(chǎn)生進(jìn)而減少三氯甲基等自由基的產(chǎn)生實(shí)現(xiàn)的。此外，紫花前胡素自身的清除自由基的能力也能夠較好的預(yù)防和改善肝損傷。但紫花前胡素是如何抑制CYP2E1產(chǎn)生的需要進(jìn)一步的研究。本研究為紫花前胡素在臨床治療肝損傷提供了初步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。