樊叢照，朱 軍，趙亞琴，王果平，李曉瑾

（新疆維吾爾自治區(qū)中藥民族藥研究所，國(guó)家中醫(yī)藥管理局新疆中藥民族藥資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 烏魯木齊 830002）

民族藥材天山堇菜，又稱“比乃非謝”，系堇菜科多年生草本植物天山堇菜（西藏堇菜）Viola kunawarensis的干燥全草，具有清熱解毒、消炎退燒、潤(rùn)肺消腫、潤(rùn)肺止咳、通利二便等功效，是降熱比那甫西糖漿、益腦吾斯提庫(kù)都斯糖漿等4種民族藥成藥制劑的主要成分[1-3]。現(xiàn)市場(chǎng)流通的天山堇菜藥材基原不清，藥材形態(tài)各異，各執(zhí)一詞，難辨真?zhèn)?，?yán)重影響相關(guān)藥品質(zhì)量控制和應(yīng)用。然而，堇菜屬植物變異復(fù)雜，種間存在雜交，分類相當(dāng)困難，各學(xué)者對(duì)于堇菜屬屬下的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系意見并不統(tǒng)一[4-6]，所以，僅采用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法鑒定市售天山堇菜藥材的基原極為困難，制約了產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

準(zhǔn)確的基原鑒定是保障藥材質(zhì)量的根本，因各種原因，民族藥材質(zhì)量控制及監(jiān)管整體水平較低[7]，雖然已制定了3部地方標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)定了200余種藥材的基原，但由于民族藥材的地域性、多外來種，基原不清仍然是制約藥材應(yīng)用與產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵，也使基于原植物特點(diǎn)的傳統(tǒng)特性形態(tài)與性狀鑒別相形見絀。DNA條形碼技術(shù)，已被《中華人民共和國(guó)藥典》2015版收載，ITS2及psbA-trnH序列作為候選序列，具有通用性強(qiáng)、鑒定結(jié)果可靠、重復(fù)性良好的特點(diǎn)，已應(yīng)用于多種民族藥材溯源研究[8-13]。本研究擬采用DNA條形碼ITS2序列，為明確天山堇菜藥材基原提供鑒定方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究中所使用的126份堇菜屬植物樣本采自新疆不同地區(qū)（表1），憑證標(biāo)本保存于新疆大學(xué)標(biāo)本館（XJU）及新疆中藥民族藥研究所標(biāo)本館（新疆XTNM），“天山堇菜”藥材樣品采自新疆各地民族藥材市場(chǎng)（表2）。

1.1.1 試劑

PCR擴(kuò)增所用引物由上海生工生物工程有限公司合 成 ，ITS2 正 向 序 列 ：5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′，反向序列：5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′[14]；DNA 提取試劑盒（DP305-03）、2×Taq Master Mix等購(gòu)自天根生物。

表1 實(shí)驗(yàn)材料信息

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

實(shí)驗(yàn)所使用的DNA提取研磨儀為GRINDER，型號(hào)GT-100；離心機(jī)為上海安亭科學(xué)儀器，型號(hào)Anker TGL-16C；PCR擴(kuò)增儀為An Analytik Jena company，型號(hào)070-851。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取及檢測(cè)

稱取干燥樣品（莖葉）30 mg，DNA提取研磨儀1000 r·min-1研磨2 min，植物DNA提取試劑盒提取總DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因組DNA的質(zhì)量。

表2 天山堇菜藥材樣品信息

表3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1.2.2 PCR擴(kuò)增及測(cè)序

反應(yīng)體積25 μL，dNTP 0.4 μL（10 mmol·L-1），PCR緩沖液2.5 μL（10×），引物各1.0 μL（2.5 μmol·L-1），聚合酶1.0 U，總DNA 1 μL（約30 ng）。引物ITS2擴(kuò)增程序：94℃，變性5 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸45 s（40個(gè)循環(huán)）；72℃延伸10 min[14]。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳檢測(cè)并純化后，使用ABI 3730 XL（Applied Biosystems Co.,USA）測(cè)序儀由美吉生物測(cè)序公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用 CodonCode Aligner V 4.0.4（CodonCode Co.,USA）校對(duì)拼接測(cè)序結(jié)果，去除引物區(qū)。使用軟件MEGA5.0（molecular evolutionary genetics analysis）分析比對(duì)結(jié)果[15]，基于隱馬爾可夫模型的HMMer注釋方法，去除ITS2序列兩端5.8S和28S區(qū)段獲得間隔區(qū)序列[16]，用鄰接（NJ）構(gòu)建系統(tǒng)聚類樹，使用bootstrap（1000次重復(fù)）檢驗(yàn)各分支的支持率[17].

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增及測(cè)序結(jié)果

從126份植物樣本及18份藥材樣本中均成功提取了基因組DNA，PCR擴(kuò)增及測(cè)序結(jié)果表明所有實(shí)驗(yàn)樣本擴(kuò)增成功，擴(kuò)增結(jié)果質(zhì)量滿足測(cè)序要求，并獲得了有效的雙向測(cè)序結(jié)果。

2.2 基原植物及同屬近緣種DNA條形碼鑒定數(shù)據(jù)庫(kù)的建立

使用基原植物天山堇菜及其同屬17種植物的37條ITS2單倍型序列建立DNA條形碼鑒定數(shù)據(jù)庫(kù)（表3），數(shù)據(jù)庫(kù)中的ITS2序列特征如表4所示，天山堇菜15個(gè)樣本為1個(gè)單倍型，ITS2序列長(zhǎng)度為210 bp，GC含量為67.6%。天山堇菜近緣種17種植物36條ITS2序列單倍型長(zhǎng)度為210-222 bp，GC含量變化范圍為60.6%-67.1%（平均64.4%），共有72個(gè)變異位點(diǎn)，種間平均K2P距離為0.115（0-0.229）。

2.3 市售藥材鑒定結(jié)果

從市場(chǎng)中獲得的民族藥材天山堇菜ITS2序列為210-236 bp，GC含量變化為62.2%-69.1%（平均66.3%），序列間存在109個(gè)變異位點(diǎn)，源于多種植物?；贗TS2序構(gòu)建的NJ鑒別樹表明（圖1），不同來源的天山堇菜藥材樣品分別聚為5類，其中編號(hào)為YCT03008、YCT03016、YCT03018的藥材樣品與天山

堇菜聚為一支，藥材YCT03005-06、YCT03010與香堇菜聚為一支，YCT03003與YCT03004聚為一支，YCT03001-02、YCT03007與 YCT03017聚為一支，YCT03009單獨(dú)為一支。

表4 天山堇菜基原植物、近緣種及藥材樣本的ITS2序列特征

圖1 基于ITS2序列的單倍型NJ鑒別樹，在圖中顯示分支支持率（≥50%，bootstrap 1000次重復(fù)）

18份不同來源的民族藥材天山堇菜鑒定結(jié)果（圖2），市售藥材有8份為天山堇菜（占44.4%）；3份為香堇菜（占16.7%）；6份未在數(shù)據(jù)庫(kù)中鑒定出有效結(jié)果，由兩種植物組成（占33.3%），與堇菜屬植物相似度較高，為堇菜屬植物；另有1份為非堇菜屬植物（占5.6%）。

3 討論

3.1 天山堇菜DNA條形碼鑒定數(shù)據(jù)庫(kù)的可靠性

本研究首次采用DNA條形碼技術(shù)建立民族藥材“天山堇菜”的鑒定體系。研究中使用的18種126份天山堇菜及其近緣種植物憑證標(biāo)本由新疆不同分類專家鑒定，保證了鑒定數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。通過建立126份堇菜屬憑證標(biāo)本樣品的ITS2序列數(shù)據(jù)庫(kù)，分析了種內(nèi)種間變異，結(jié)果表明堇菜屬不同種植物種間變異遠(yuǎn)大于種內(nèi)變異；NJ樹鑒別鑒定結(jié)果表明，不同植物均各自聚為一支，ITS2序列可將天山堇菜與其近緣種植物區(qū)分，因此ITS2序列在天山堇菜藥材鑒定中具有很大的潛力。

3.2 市售藥材天山堇菜的植物基原混亂

圖2 市售民族藥材天山堇菜植物來源

本研究建立的ITS2體系成功應(yīng)用于不同植物來源的天山堇菜藥材鑒定。通過將18份不同批次的市售“天山堇菜”藥材ITS2序列與鑒定數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，結(jié)果表明，目前天山堇菜的臨床用藥與現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)存在很大差距，市售藥材至少來源于5種植物，包括天山堇菜、香堇菜、堇菜屬2種未知植物及薄荷屬植物。藥材在流通過程中以同屬植物作為替代品的現(xiàn)象很常見[18,19]，目前《中華人民共和國(guó)藥品標(biāo)準(zhǔn)(維藥分冊(cè))》及《新疆民族自治區(qū)中藥民族藥飲片炮制規(guī)范》等地方標(biāo)準(zhǔn)中收載的天山堇菜藥材唯一基原為天山堇菜V.kunawarensis，根據(jù)藥材管理辦法，未被收載的同屬植物均為偽品。本研究中正品藥材天山堇菜僅占44.4%，天山堇菜用藥安全存在很大的隱患，其同屬數(shù)種植物作為偽品流入市場(chǎng)，它們是否與天山堇菜具有相同的功效，還需要結(jié)合化學(xué)成分和藥理作用進(jìn)行深入研究。

3.3 DNA條形碼在藥材監(jiān)管領(lǐng)域的應(yīng)用前景

天山堇菜為新疆地產(chǎn)藥材，其在民族藥制劑中的使用量較大，由于資源有限，近年來主要依賴于進(jìn)口，導(dǎo)致混偽品藥材流入市場(chǎng)。DNA條形碼技術(shù)近年來已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品安全和中藥材真?zhèn)舞b定等領(lǐng)域，本研究結(jié)果可在進(jìn)出口海關(guān)檢查過程及藥品安全監(jiān)測(cè)中可發(fā)揮重要作用，可從源頭上杜絕偽品藥材進(jìn)入市場(chǎng)，為監(jiān)管機(jī)構(gòu)提供一種優(yōu)良的檢測(cè)手段，在民族藥材基原控制領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。