孫雪芹，劉玫，孫天航，張欣欣，史傳奇

(哈爾濱師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150025)

堇菜屬(Viola)是堇菜科(Violaceae)最大的屬，約500余種，世界分布。中國(guó)約120種，東北42種、1變種及4變型[1-3]。本屬植物用途廣泛，可供藥用，有清熱解毒、消腫止痛及散瘀之功效[如紫花地丁(Violaphilippica)及雞腿堇菜(Violaacuminata)]，也可供觀賞[如三色堇(Violatricolor)][4-5]。

堇菜屬植物的柱頭形態(tài)、花色和托葉常被作為分類的主要依據(jù)[1,6-7]。中國(guó)堇菜屬分為4亞屬，即堇菜亞屬(Subgen.Viola)、二裂花柱亞屬(Subgen.Dischidium)、須毛柱頭亞屬(Subgen.Chamaemelanium)及美麗堇菜亞屬(Subgen.Melanium)[1]。孫坤等[8]對(duì)38種國(guó)產(chǎn)堇菜屬植物進(jìn)行了數(shù)量分類研究，認(rèn)為須毛柱頭亞屬和二裂花柱亞屬應(yīng)作為同一亞屬，堇菜亞屬中裂葉堇菜組(Sect. Pinnatae)和闊鞘堇菜組(Sect. Vaginatae)應(yīng)并入合生托葉組(Sect. Adnatae)。張春宇等[9]指出紫花地丁和早開堇菜(Violaprionantha)根的木質(zhì)部、葉片的柵欄組織及海綿組織等結(jié)構(gòu)明顯不同。葉表皮的微形態(tài)特征不支持將早開堇菜及茜堇菜(Violaphalacrocarpa)合并到紫花地丁，不支持將總裂葉堇菜降為裂葉堇菜的變種[10]。堇菜屬多數(shù)種類的花粉粒為三孔溝，其中三色堇的花粉為五孔溝，是本屬內(nèi)較為進(jìn)化的類型[11-12]。一些學(xué)者指出堇菜屬果實(shí)和種皮表面紋飾在種間差別明顯，可作為種的鑒定依據(jù)[13-14]。而分子系統(tǒng)學(xué)研究顯示美麗堇菜亞屬與堇菜組和鳥嘴柱頭堇菜組有較近親緣關(guān)系，二裂花柱亞屬與須毛柱頭亞屬近緣[15]。葉柄的解剖學(xué)特征對(duì)植物分類及系統(tǒng)演化研究，以及鑒定植物屬種間的親緣關(guān)系起到重要作用，對(duì)屬及種的鑒定有著很大的參考價(jià)值[16-17]。然而，關(guān)于堇菜屬植物葉柄結(jié)構(gòu)的報(bào)道很少[18]，且無系統(tǒng)的解剖學(xué)研究。本文的目的是通過深入研究東北堇菜屬植物葉的形態(tài)結(jié)構(gòu)，完善堇菜屬形態(tài)學(xué)，為該屬的分類及分子系統(tǒng)學(xué)研究提供形態(tài)學(xué)依據(jù)，并為進(jìn)一步深入研究中國(guó)堇菜屬及堇菜科提供了基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)材料為我國(guó)東北堇菜屬28種及1變種的葉片及葉柄，它們分別隸屬于堇菜屬的4個(gè)亞屬：美麗堇菜亞屬及二裂花柱亞屬各1種，須毛柱頭堇菜亞屬3種，其他均屬于堇菜亞屬。植物采自野外，經(jīng)王臣教授鑒定，標(biāo)本存放于哈爾濱師范大學(xué)植物標(biāo)本館(HANU)，部分材料取自于黑龍江植物資源所標(biāo)本館(HNR)以及東北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物標(biāo)本館(NEAU)。物種名稱及憑證標(biāo)本(包括物種的采集人，采集號(hào)及存放的標(biāo)本館)的詳盡信息見表1，分類地位見表2。

表1 東北堇菜屬物種、憑證標(biāo)本及采集地Table 1 Taxa of Viola in northeastern China, together with voucher specimen details and localities

1.2 方法

葉表皮撕取法：分別取5個(gè)葉片，用鑷子撕取其上、下表皮，放在載玻片上，用刀片輕輕刮去殘留的葉肉，直至可清楚地觀察到上、下表皮細(xì)胞為止。用水沖去葉肉細(xì)胞，加入1～2滴50%甘油水溶液，蓋上蓋玻片。在顯微鏡下觀察表皮細(xì)胞、氣孔及毛狀體的形態(tài)并記錄。

GMA(Glycol methacrylate，乙二醇甲基丙烯酸酯)半薄切片法：將從標(biāo)本上取的材料吸水膨脹固定于FAA(Formalin-acetic acid-alcohol mixture，福爾馬林-醋酸-酒精混合液)，新鮮材料直接用FAA固定，時(shí)間不少于24 h，取靠近托葉的葉柄，長(zhǎng)約0.5 cm。采用Feder和O’Brien[19]的方法，材料經(jīng)50%酒精(2次，每次4～6 h)，100%酒精(2次，每次4～6 h)，異丙醇(2次，每次6 h)和正丁醇(2次，每次6 h)脫水后，進(jìn)入GMA滲透3次，第1和2次各為1～2 d，第3次不少于5 d，之后將材料及GMA裝入膠囊，將其置于60℃溫箱24 h。用Leica Ultralcut R切片，厚度約為2 μm。同樣采用Feder和O’Brien[19]的方法，用考馬斯亮藍(lán)及希夫試劑染色，中性樹膠封片。

所有觀察結(jié)果經(jīng)Olympus BX51顯微鏡觀察，Olympus DP70照相。

表2 東北堇菜屬物種的分類地位(中國(guó)植物志)Table 2 The taxonomic status of Viola in northeastern China (Flora of China)

2 結(jié)果與分析

2.1 葉及托葉的形態(tài)

東北堇菜屬植物的葉具裂或無裂(表3)，裂葉堇菜組的葉具裂，其他各組葉邊緣較整齊。葉裂分為全裂，如掌葉堇菜(圖1C)，深裂(缺刻大于1/2葉片)，如南山堇菜及裂葉堇菜(圖1D)，或淺裂(缺刻小于1/2葉片)，如總裂葉堇菜(圖1E)。后者的葉片形狀變化較大，為心形或廣卵形，如斑葉堇菜和雞腿堇菜(圖1A1,J1)；腎形，如大黃花堇菜、興安圓葉堇菜和雙花堇菜(圖1B)；長(zhǎng)卵形，如立堇菜、三色堇和紫花地丁(圖1H,I,M)；長(zhǎng)三角形，如白花東北堇菜及寬葉白花堇菜(圖1G)及匙形，如興安堇菜(圖1F)。

本文研究的堇菜屬物種均具托葉(表3)，但有的不明顯。根據(jù)托葉與葉柄的基部著生方式可分為合生及離生兩種類型。前者如雞腿堇菜、興安圓葉堇菜和掌葉堇菜(圖1A1,B,C)。后者如立堇菜和三色堇(圖1H,I)。托葉的形狀主要為披針形及卵圓形。多數(shù)物種，如興安堇菜、紫花地丁和斑葉堇菜的托葉為披針形(圖1M,J2)，少數(shù)物種，如黃花堇菜和大黃花堇菜的為卵圓形(圖1L)。本文研究的物種僅三色堇的托葉具小裂片(圖1I)。

圖1 東北堇菜屬植物葉及托葉繪圖Fig.1 The leaves and stipules in Viola in northeastern China, showing the shape of leaves and stipules

示葉及托葉形狀A(yù)1, A2. 雞腿堇菜基生葉及莖生葉托葉；B. 興安圓葉堇菜；C. 掌葉堇菜；D. 裂葉堇菜；E. 總裂葉堇菜；F. 興安堇菜；G. 寬葉白花堇菜；H. 立堇菜；I. 三色堇；J1, J2. 斑葉堇菜；K. 堇菜；L. 黃花堇菜托葉；M. 紫花地丁。比例尺：圖A1, A2, B, C, D, E, F, G, H, I, J1, K, M=1 cm；J2, L=0.5 cm。Basal leaf and stipule of stem leaf: A1, A2.V.acuminata; B.V.brachyceras; C.V.dactyloides; D.V.dissecta; E.V.fissifolia; F.V.gmeliniana; G.V.lactiflora; H.V.raddeana; I.V.tricolor; J1, J2.V.variegata; K.V.verecunda; L.V.xanthopetalastipule; M.V.yedoensis. Scale bar=1 cm in A1, A2, B, C, D, E, F, G, H, I, J1, K, M; 0.5 cm in J2, L.

2.2 毛狀體及氣孔的形態(tài)

除少數(shù)物種未見毛狀體(如堇菜和寬葉白花堇菜)外，其余物種均有毛狀體。毛狀體多集中在葉脈及葉緣，少數(shù)葉柄也被毛。毛狀體多為單細(xì)胞非腺毛，呈披針形，如茜堇菜、三色堇和雙花堇菜(圖2B,C)。僅在球果堇菜觀察到兩細(xì)胞非腺毛，呈披針形(圖2A1,A2)。部分物種毛狀體上具瘤狀突起，如斑葉堇菜和三色堇(圖2C)。氣孔分布于葉的上、下兩面及葉柄，下表皮氣孔較多。絕大多數(shù)物種的氣孔周圍有3個(gè)副衛(wèi)細(xì)胞，其中一個(gè)明顯較其他的細(xì)胞小，為不等型，如早開堇菜和堇菜(圖2D,E)，部分物種氣孔周圍的細(xì)胞同其他表皮細(xì)胞形態(tài)相似，為不規(guī)則型，如深山堇菜、斑葉堇菜等(圖2E)。堇菜屬表皮細(xì)胞的細(xì)胞壁多呈波浪狀彎曲，如堇菜(圖2E)，但有的物種較平滑，如總裂葉堇菜、早開堇菜(圖2D)。

2.3 葉柄結(jié)構(gòu)

堇菜屬植物葉柄橫切面多為半圓形(圖3)，如雞腿堇菜、裂葉堇菜及總裂葉堇菜(圖3A,C,D)；三角形，如白花東北堇菜(圖3F)。葉柄近軸面的特征在不同的物種有變化，分為較平，如總裂葉堇菜(圖3D)；中間凸起，如球果堇菜、茜堇菜及斑葉堇菜(圖3B,H,J)。近軸面兩側(cè)向外延伸，形成翼，如雞腿堇菜、球果堇菜和奇異堇菜(圖3A,B,C)；部分物種無明顯翼，如總裂葉堇菜(圖3E)。

葉柄表皮由一層近方形的細(xì)胞組成，無明顯角質(zhì)層，細(xì)胞排列緊密整齊，但東方堇菜葉柄一些表皮細(xì)胞的外壁明顯突起(圖2G)。此外，研究中葉柄的表皮細(xì)胞可見細(xì)小的絨毛狀突起(如球果堇菜，圖2C)。緊挨表皮有1～3層細(xì)胞構(gòu)成的厚角組織，細(xì)胞排列緊密，且形態(tài)同表皮細(xì)胞相似。厚角組織以內(nèi)的薄壁細(xì)胞較大，排列疏松，有明顯的胞間隙，維管束規(guī)則分布在薄壁組織中，多數(shù)物種有3個(gè)維管束，大維管束在中間位置，小維管束位于兩側(cè)，如東北堇菜及紫花地丁(圖3F,O)。有些物種的維管束多于3個(gè)，東北堇菜、白花東北堇菜和紫花地丁具4個(gè)維管束(圖3F,O)，興安堇菜的維管束為6個(gè)，它們的排列方式均為中央一個(gè)較大，周圍的較小。根據(jù)維管束形狀不同，分為以下4種：新月形，如雞腿堇菜和奇異堇菜(圖3A,G)；腎形，如裂葉堇菜、總裂葉堇菜和東北堇菜(圖3C,D)；箭頭形，如茜堇菜和斑葉堇菜(圖3H,J)；馬蹄形，如球果堇菜、堇菜和紫花地丁(圖3B,F,I,K,L)。部分物種的韌皮部及木質(zhì)部外側(cè)具纖維，纖維為2～3層纖維細(xì)胞，如斑葉堇菜和雙花堇菜(圖2H,J)，或幾個(gè)纖維細(xì)胞聚集在一起，分散排列，如總裂葉堇菜及東北堇菜(圖2I,3E,F)，有些物種的韌皮部及木質(zhì)部外側(cè)無纖維，如雞腿堇菜、球果堇菜和堇菜(圖3A,C,N)。一些物種葉柄中央具溶生性通氣組織，如堇菜和紫花地丁(圖3K,L)，而這種通氣組織在多數(shù)物種中不存在。淀粉粒存在于一些物種靠近表皮的細(xì)胞，如東北堇菜及紫花地丁(圖3O)。

圖2 東北堇菜屬植物葉及葉柄Fig.2 The leaves and petiole in Viola in northeastern China

示毛狀體、氣孔、表皮、維管束、纖維。A1, A2. 球果堇菜的葉表皮毛；B. 雙花堇菜的葉表皮毛；C. 三色堇的葉表皮毛；D. 早開堇菜氣孔；E. 堇菜氣孔；F. 球果堇菜葉柄表皮；G. 東方堇菜葉柄表皮；H. 雙花堇菜葉柄維管束；I. 總裂葉堇菜葉柄維管束；J. 斑葉堇菜葉柄維管束。比例尺: 圖A1, B, J=80 μm；A2, C, D, E, F=25 μm；G=100 μm；H, I=50 μm。Showing trichome, stomata, epidermis, vascular and fiber. Ttrichome on leaves: A1, A2.V.collina; B.V.biflora; C.V.tricolor; Stomata of leaves: D.V.prionantha; E.V.verecunda; Epidermis of petiole: F.V.collina; G.V.orientalis; Vascular bundle of petiole: H.V.biflora; I.V.fissifolia; J.V.variegata. Scale bar=80 μm in A1, B, J; 25 μm in A2, C, D, E, F; 100 μm in G; 50 μm in H, I.

圖3 東北堇菜屬植物葉柄橫切面繪圖Fig.3 The transverse section of petioles in Viola in northeastern China

示橫切面形狀、維管束的分布及形狀。A. 雞腿堇菜；B. 雙花堇菜；C. 球果堇菜；D. 裂葉堇菜；E. 總裂葉堇菜；F. 東北堇菜；G. 白花東北堇菜；H. 奇異堇菜；I. 東方堇菜；J. 茜堇菜；K. 早開堇菜；L. 三色堇；M. 斑葉堇菜；N. 堇菜；O. 紫花地丁。比例尺：圖L=400 μm; A, B, H, I, O=500 μm; D, F, G, K, M, N=600 μm; C， E, J=670 μm。Showing the shapes of transverse sections, distribution and shapes of vascular bundles. A.V.acuminata; B.V.biflora; C.V.collina; D.V.dissecta; E.V.fissifolia; F.V.mandshurica; G.V.mandshuricavar.f.abliflora; H.V.mirabilis; I.V.orientalis; J.V.phalacrocarpa; K.V.prionantha; L.V.tricolor; M.V.variegata; N.V.verecunda; O.V.yedoensis. Scale bar=400 μm in L; 500 μm in A, B, H, I, O; 600 μm in D, F, G, K, M, N; 670 μm in C, E, J.

2.4 根據(jù)觀察的堇菜屬28種1變種葉的形態(tài)結(jié)構(gòu)的特征，編制檢索表如下

3 討論

葉片作為植物體最重要的營(yíng)養(yǎng)器官，是植物進(jìn)化過程中對(duì)環(huán)境變化比較敏感且可塑性較大的器官，與植物抗旱性密切相關(guān)[20-23]，易受到水熱等微環(huán)境的影響而發(fā)生變化[24]。而葉柄是植物比較保守和原始的器官[25]，在鑒定植物種屬間的親緣關(guān)系中起到重要作用[26]。葉柄維管束的數(shù)目、位置及排列等是屬組間比較有分類價(jià)值的解剖形狀[27]。研究結(jié)果表明堇菜屬植物翼、葉柄近軸面的特征、通氣組織及維管束的結(jié)構(gòu)等在不同物種之間有明顯區(qū)別，可以作為分類的依據(jù)，其中葉柄維管束排列方式基本一致，是屬內(nèi)穩(wěn)定的特征。這與堇菜屬的花粉外壁紋飾研究結(jié)果一致[12]，表明了本屬是一個(gè)較為自然的類群。

研究表明美麗堇菜亞屬花粉外壁紋飾及種皮表面紋飾與堇菜屬其他物種差異明顯，須毛柱頭亞屬的花粉外壁穿孔極多也較為特殊，支持將美麗堇菜亞屬及須毛柱頭亞屬作為亞屬的分類處理[8,11,13]，但其他關(guān)于堇菜屬的數(shù)量分類學(xué)研究則認(rèn)為應(yīng)將須毛柱頭亞屬和二裂花柱亞屬作為同一亞屬的不同組處理[12]。本文研究的位于須毛柱頭亞屬的東方堇菜其葉柄的一些表皮細(xì)胞明顯突起，位于美麗堇菜亞屬的三色堇的托葉具小裂片。由于這些特征不存在于研究的其他物種，故支持須毛柱頭亞屬及美麗堇菜亞屬的建立。

堇菜亞屬種類多，而且結(jié)構(gòu)變化較大，植物葉表皮微形態(tài)可為屬種間的分類提供依據(jù)[28]。本研究中涉及堇菜亞屬6個(gè)組，其中二細(xì)胞非腺毛僅見堇菜組，顯示堇菜組是一個(gè)特化的類群，支持王慶瑞[1]關(guān)于堇菜組的建立。裂葉堇菜組與合生托葉組葉的結(jié)構(gòu)相似，均具單細(xì)胞非腺毛，不等型氣孔，腎形及馬蹄形維管束，應(yīng)將裂葉堇菜組并入合生托葉組，這一結(jié)論也與數(shù)量分類、分子系統(tǒng)學(xué)和其他學(xué)者的研究結(jié)果一致[8,15,29]。

黃勇等[30]根據(jù)葉形變化認(rèn)為早開堇菜和紫花地丁在形狀上無差別，應(yīng)合并。而早開堇菜、茜堇菜和紫花地丁葉表皮微形態(tài)，根葉解剖結(jié)構(gòu)，花粉形態(tài)及果實(shí)和種子的形態(tài)上均存在著明顯的差異，應(yīng)為3個(gè)不同的種[9-10,14,31]。本研究揭示的早開堇菜、茜堇菜和紫花地丁的氣孔類型，維管束數(shù)量和形狀，是否存在纖維等特征存在區(qū)別，故支持前人將他們作為獨(dú)立的種。東北堇菜與白花東北堇菜的葉柄橫切面形狀存在著較大的差異，因此對(duì)后者是否為獨(dú)立種需要進(jìn)一步的深入研究。此外，葉柄維管束的數(shù)量及排列方式在組內(nèi)具有穩(wěn)定性，可作為劃分組的形態(tài)依據(jù)。

我們的研究深入揭示了堇菜屬植物葉，包括葉片、托葉及葉柄的形態(tài)結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)在不同物種間存在差異，在組內(nèi)具有相似的特征，為種及組的劃分提供了形態(tài)學(xué)依據(jù)。完善了堇菜屬的形態(tài)學(xué)研究，為進(jìn)一步深入研究中國(guó)堇菜屬及堇菜科提供了基礎(chǔ)資料，從而也為分子系統(tǒng)學(xué)對(duì)這一類群的研究提供了形態(tài)學(xué)依據(jù)。