李鑫淳，宋 陽(yáng)，路 妍，景 嵐

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010019)

向日葵銹病(PucciniahelianthiSchw)是向日葵重要病害之一，嚴(yán)重危害向日葵的品質(zhì)及含油量。向日葵銹菌是一種單性寄生菌，屬于擔(dān)子菌門(Basidiomycota)冬孢子綱(Teliomycetes)銹菌目(Uredinales)柄銹菌屬(Puccinia)，是一種具有性孢子、銹孢子、夏孢子、冬孢子、擔(dān)孢子5種不同孢子的真菌[1]。銹菌侵染向日葵后，形成大量的孢子堆，降低向日葵葉片光合作用和蒸騰作用，導(dǎo)致向日葵營(yíng)養(yǎng)及水分缺失過(guò)多過(guò)早枯死[2]。近10年來(lái)隨著我國(guó)向日葵種植面積不斷增加，向日葵銹病的發(fā)生逐年加重，給向日葵生產(chǎn)帶來(lái)的危害也日益嚴(yán)重[3]。

隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)及分子植物病理學(xué)的快速發(fā)展，人們對(duì)病原菌與寄主的互作機(jī)制的認(rèn)識(shí)日益完善。致病真菌通過(guò)分泌胞外酶來(lái)降解寄主結(jié)構(gòu)性屏障是其常用的策略[4-6]。例如，引起肺部病害的一種曲霉病是宿主通過(guò)吸入曲霉菌引起肺部屏障組織蛋白破壞，曲霉菌主要破壞肺部的免疫活性物質(zhì)，通過(guò)分解細(xì)胞組織達(dá)到致病效果[7]，曲霉菌(引起曲霉菌病)中的酶可以作為治療該病的靶標(biāo)。肺部蛋白有30%是彈性蛋白，彈性蛋白酶被認(rèn)為在真菌侵染過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[8]。金屬?gòu)椥苑置诘鞍酌甘撬饷割惖囊环N，對(duì)丙氨酸、甘氨酸、異亮氨酸、亮氨酸或纈氨酸等含羧基的多肽鍵起催化水解的作用，是活性中心依賴于金屬離子的一類蛋白酶[9]。金屬蛋白酶(Metalloproteinase)和彈性絲氨酸蛋白酶(Elastinolytic serine proteinase)在煙曲霉(Aspergillusfumigatus)及黃曲霉(Aspergillusflavus)均有發(fā)現(xiàn)，它們是引起曲霉病的2個(gè)重要發(fā)病因子[6，8，10-15]。并且已有證據(jù)表明，彈性蛋白酶是關(guān)鍵的毒力因子，絲氨酸蛋白酶基因喪失的煙曲霉突變體仍然具有毒性，可能是存在其他的一些蛋白酶起到補(bǔ)償作用。1994年Markaryan等[8]從煙曲霉中純化得到一個(gè)彈性金屬蛋白酶，并證明金屬蛋白酶并不能水解彈性蛋白。 向日葵銹菌是一類主要侵染向日葵葉片的真菌，向日葵銹菌可以分泌多種胞外蛋白酶發(fā)揮其致病作用[15]，此菌中的彈性金屬蛋白酶分泌到胞外可能與寄主互作來(lái)破壞向日葵葉片細(xì)胞壁中的蛋白質(zhì)，從而利于其進(jìn)一步侵染，進(jìn)而達(dá)到致病效果。本試驗(yàn)對(duì)向日葵銹菌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中一個(gè)高表達(dá)的基因(推斷其編碼彈性金屬蛋白酶)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，對(duì)其基因進(jìn)行分子克隆，通過(guò)生物信息學(xué)對(duì)其成熟蛋白基因序列分析，推斷蛋白功能。

1 材料和方法

1.1 序列的生物信息學(xué)分析

1.1.1 蛋白序列及特征性分析 應(yīng)用ORF Finder(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的蛋白序列進(jìn)行開放閱讀框的分析；利用Interpro對(duì)蛋白ORF區(qū)域進(jìn)行分析確定序列成熟區(qū)域；蛋白質(zhì)的功能區(qū)由PROSITE tools(http://au.expasy.org/prosite/)預(yù)測(cè)；Compute pI/Mw tool(http://us.expasy.org/tools/pi_tool.html)分析蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)以及分子量。

1.1.2 蛋白疏水性、跨膜區(qū)、信號(hào)肽、GPI錨定位點(diǎn)及亞細(xì)胞定位分析 通過(guò)ProtScale tool(http://www.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl)預(yù)測(cè)蛋白酶的疏水性；應(yīng)用 TMpred(http：//www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)對(duì)其進(jìn)行跨膜區(qū)分析；big-PI predictor(http://mendel.imp.ac.at/gpi/fungi_server.html)軟件用于鑒定蛋白質(zhì)的GPI錨定位點(diǎn)；應(yīng)用 SignalP4.1Server(http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)進(jìn)行蛋白質(zhì)的信號(hào)肽分析；利用在線軟件TargetP 1.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)確定蛋白酶在細(xì)胞的定位。

1.1.3 蛋白二三級(jí)結(jié)構(gòu)與結(jié)構(gòu)域 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)通過(guò)SOPMA(https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.plpage=npsa_sopma.html)在線工具分析；通過(guò) SWISS-MODEL(https：//www.swissmodel.expasy.org/)對(duì)其成熟區(qū)域的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行同源建模；使用Blast(http：//www.ebi.ac.uk/interpro/)搜索蛋白酶的相似家族[16-17]。

1.2 試驗(yàn)試劑

TIANGEN 植物總RNA提取試劑盒(PD432)、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(PD209-02)及質(zhì)粒小提試劑盒(PD103-02)、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、2 000，15 000 bp DNA Ladder及T4DNA 連接酶(RT406)購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；質(zhì)粒pET28a由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲研究實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)；GoScriptTMReverse Transcription System購(gòu)自普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司；ToPo pBoLn-TA Easy克隆試劑盒購(gòu)自北京博凌科為生物科技有限公司；限制性內(nèi)切酶購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司；其他試劑均為分析純，購(gòu)自天津市英博生化世紀(jì)有限公司；引物及測(cè)序在華大基因科技股份有限公司合成及檢測(cè)。

1.3 蛋白酶基因克隆

1.3.1 向日葵銹病菌RNA提取及cDNA合成 向日葵銹菌為專性寄生菌，利用感病向日葵品種擴(kuò)繁銹菌得到新鮮夏孢子，對(duì)夏孢子進(jìn)行RNA提取。依據(jù)TIANGEN RNA prep Pure 植物總 RNA 提取試劑盒(PD432)說(shuō)明進(jìn)行。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取總RNA的質(zhì)量。參照GoScriptTMReverse Transcription System(ADA5001)操作步驟反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 蛋白酶基因片段擴(kuò)增 以蛋白酶基因序列為模板，選取分泌蛋白酶成熟序列作為模板，利用Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)帶有NdeⅠ及BglⅡ酶切位點(diǎn)的引物，上游引物Met-F：5′-TTTCATATGATGTCCTA

TCGCGTCTTTCCCTGGTCG-3′，下游引物Met-R：5′-GGAAGATCTTCAGTTCTCGCAAACACCTCTTGG-3′。下劃線標(biāo)出的堿基為酶切位點(diǎn)，前面3個(gè)堿基為保護(hù)堿基。以cDNA作為模板，利用引物進(jìn)行序列擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25 μL，PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.3.3 PCR產(chǎn)物純化 依據(jù)TIANGEN普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(DP209-02)回收說(shuō)明進(jìn)行。

1.3.4 ToPo pBoLn-TA克隆載體構(gòu)建及測(cè)序 將PCR膠回收產(chǎn)物連接到ToPo pBoLn-TA克隆載體上，連接體系為 10 μL，于室溫20～30 ℃，參照ToPo pBoLn-TA Easy克隆試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行(1715)。反應(yīng)體系配制完成后，用移液槍輕輕捶打至混勻，避免氣泡，室溫連接10 min。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，于37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)14 h，在LB(Amp+)培養(yǎng)基上篩選陽(yáng)性克隆菌落。挑取單克隆菌落在LB(Amp+)液體培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行搖菌14 h，利用特異性引物Met-F和Met-R進(jìn)行菌液PCR鑒定(PCR反應(yīng)程序同1.3.2)，PCR反應(yīng)結(jié)束后，取7 μL反應(yīng)液電泳檢測(cè)，通過(guò)凝膠電泳成像系統(tǒng)觀察結(jié)果后，選取陽(yáng)性克隆菌液交給華大基因科技股份有限公司測(cè)序，使用通用引物M13F及M13R進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果通過(guò)DNAMAN進(jìn)行序列比對(duì)。對(duì)測(cè)序正確的重組質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和BglⅡ進(jìn)行酶切驗(yàn)證，酶切體系參照Thermo Scientific FastDigestNdeⅠ及BglⅡ限制性內(nèi)切酶說(shuō)明書進(jìn)行(FD0584及FD0084)。

1.3.5 pET28a原核表達(dá)載體的構(gòu)建及測(cè)序 用插入酶切位點(diǎn)的引物以陽(yáng)性克隆的菌液為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增、鑒定、膠回收純化，步驟同1.3.2及1.3.3。按照TIANGEN質(zhì)粒小提試劑盒(DP103-02)的步驟對(duì)帶有pET28a的菌液進(jìn)行空質(zhì)粒的提取。將回收的目的基因片段和表達(dá)載體pET28a經(jīng)NdeⅠ及BglⅡ在37 ℃下1 h進(jìn)行雙酶切，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后回收凝膠片段，將回收的目的片段和回收的質(zhì)粒載體片段在T4DNA 連接酶作用下相連接，連接體系為10 μL，參照TIANGEN T4DNA 連接酶(RT406)說(shuō)明書進(jìn)行。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，于37 ℃ LB(Kan+)固體培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)，利用特異性引物Met-F及Met-R對(duì)菌液進(jìn)行PCR鑒定，運(yùn)用TIANGEN質(zhì)粒小提試劑盒將帶有pET28a重組質(zhì)粒進(jìn)行質(zhì)粒提取，通過(guò)酶切驗(yàn)證，選取菌懸液送到華大基因科技股份有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定，結(jié)果通過(guò)DNAMAN進(jìn)行序列比對(duì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶基因序列篩選及特征性分析

從向日葵銹菌轉(zhuǎn)錄組中發(fā)現(xiàn)表達(dá)量較高的一個(gè)基因，對(duì)其序列進(jìn)一步分析。利用ORF Finder 對(duì)蛋白酶整條序列進(jìn)行分析，得到1條2 781 bp序列(圖1)，確定其為蛋白酶的ORF區(qū)域，進(jìn)一步利用Interpro對(duì)整條蛋白酶序列ORF區(qū)域進(jìn)行分析，結(jié)果表明，ORF區(qū)域序列前22個(gè)氨基酸為信號(hào)肽，中間23-482氨基酸為多余的氨基酸，483-928為整條ORF序列的成熟區(qū)域，共編碼445個(gè)氨基酸。

斜體為信號(hào)肽；加粗部分為成熟區(qū)域。Italics are signal peptides; bold parts are mature areas.

通過(guò)Compute pI/Mw tool預(yù)測(cè)蛋白酶成熟區(qū)域分子式為C2193H3279N631O667S13，分子質(zhì)量為49.5 ku，理論等電點(diǎn)為5.7，脂肪系數(shù)為57.9，帶負(fù)電的殘基(Asp+Glu)總數(shù)為57，帶正電的殘基(Arg+Lys)總數(shù)為46。利用PROSITE tools對(duì)蛋白酶的成熟區(qū)進(jìn)行分析，結(jié)果表明此蛋白為鋅依賴性金屬肽酶，并且鋅離子選擇性的非共價(jià)的同序列相結(jié)合，稱為metzincins，同M1、M2、M3、M4、M5、M6、M7、M8、M9、M10A、M10B、M11、M12A、M12B、M13、M27、M30、M32、M34、M35、M36家族相似。

2.2 蛋白酶疏水性、跨膜區(qū)、信號(hào)肽、GPI錨定位點(diǎn)及亞細(xì)胞定位分析

運(yùn)用ProtScale tool對(duì)蛋白酶疏水性進(jìn)行分析表明，蛋白酶多肽鏈上精氨酸和賴氨酸為親水性最強(qiáng)的2個(gè)氨基酸，其分?jǐn)?shù)為-4.5，-3.9；多肽鏈上異亮氨酸和纈氨酸為疏水性最強(qiáng)的2個(gè)氨基酸，其分?jǐn)?shù)為4.5，4.2。從整體來(lái)看，蛋白酶的親水氨基酸多于疏水氨基酸，屬于親水蛋白(圖2)。蛋白質(zhì)跨膜區(qū)分析表明，蛋白酶1-445全部氨基酸位于細(xì)胞膜表面，確定其為非跨膜蛋白質(zhì)(圖3)。利用big-PI predictor確定蛋白酶的GPI錨定位點(diǎn)，確定其無(wú)GPI錨定位點(diǎn)。從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索與金屬蛋白酶基因編碼蛋白的氨基酸相似度較高的5條蛋白序列，這5條蛋白均屬于肽酶M36家族。利用TargetP 1.1分析軟件分析，表明蛋白酶并非葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽、線粒體靶向肽和分泌通路信號(hào)肽的一種，并進(jìn)一步利用SignalP4.1Server確定蛋白信號(hào)肽，確定其含有N端信號(hào)肽，因此，此蛋白可能通過(guò)信號(hào)肽分泌到胞外。

圖2 蛋白酶親水性Fig.2 Hydrophilicity of protease

2.3 金屬?gòu)椥苑置诘鞍锥?jí)結(jié)構(gòu)與結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

應(yīng)用SOPMA軟件分析金屬?gòu)椥苑置诘鞍酌傅亩?jí)結(jié)構(gòu)，其由22.3%的α-螺旋(Alpha helix)、16.0%的延伸鏈(Extended strand)、3.4%的β-轉(zhuǎn)角(Beta turn)和58.4%的無(wú)規(guī)卷曲(Random coil)組成，其中α-螺旋和無(wú)規(guī)卷曲是蛋白酶中的主要結(jié)構(gòu)原件，而β-轉(zhuǎn)角和延伸鏈散步于整個(gè)蛋白中。通過(guò)SWISS-MODEL基于同源建模的方法檢索PDB(Protein data bank)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)同胞外金屬蛋白酶(Extracellular metalloproteinase mep)基因序列相似度為53.77%(圖4)，以該蛋白晶體結(jié)構(gòu)作為模板，構(gòu)建了金屬蛋白酶的三維結(jié)構(gòu)模型(圖5)。利用Blast搜索蛋白酶匹配家族，結(jié)果顯示蛋白酶的1-419個(gè)氨基酸同真菌素M36的蛋白家族相似，235-432個(gè)氨基酸同CDT家族M1及M4相似。

圖3 蛋白酶的跨膜區(qū)Fig.3 Transmembrane region of protease

圖4 蛋白酶同其他胞外金屬蛋白酶相似度Fig.4 The similarity of protease with an extracellular metalloproteinase

圖5 基于同源建模預(yù)測(cè)的蛋白酶的三維結(jié)構(gòu)模型Fig.5 Three-dimensional structure model of protease predicted based on homology modeling

2.4 蛋白酶基因擴(kuò)增及克隆載體構(gòu)建

通過(guò)對(duì)向日葵銹菌總RNA的提取，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成第1鏈cDNA，利用RT-PCR擴(kuò)增技術(shù)對(duì)目標(biāo)片段進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，得到約為1 335 bp的條帶(圖6)。通過(guò)ToPo pBoLn-TA Easy試劑盒將目的基因?qū)肟寺≥d體ToPo pBoLn-TA，涂板，挑選10個(gè)菌落進(jìn)行搖菌，對(duì)菌懸液進(jìn)行PCR鑒定，獲得與預(yù)期結(jié)果相同的條帶(圖7)，并挑選3個(gè)單克隆菌，在LB(Amp+)液體培養(yǎng)基中進(jìn)行搖菌，選取3個(gè)菌懸液，送到華大基因科技股份有限公司進(jìn)行測(cè)序檢測(cè)，通過(guò)DNAMAN比對(duì)，序列相似率達(dá)到99.1%。以測(cè)序正確的菌液為模板，利用已插入的酶切位點(diǎn)進(jìn)行酶切，通過(guò)NdeⅠ和BglⅡ?qū)寺≥d體進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物通過(guò)1%的凝膠電泳成像鑒定，片段約為1 865 bp及1 335 bp(圖8)。

M.DL2000;1-2.PCR產(chǎn)物。圖7同。M.DL2000 DNA Marker; 1-2. Production of PCR.The same as Fig.7.

圖7 克隆重組質(zhì)粒的菌懸液PCR瓊脂糖凝膠電泳Fig.7 The agarose gel electrophoresis of suspension of cloning recombinant plasmid by PCR

M. DL2000; 1-3.酶切產(chǎn)物。M. DL2000 DNA Marker; 1-3. Production of double digestion.

2.5 蛋白酶基因表達(dá)載體構(gòu)建

通過(guò)瓊脂糖DNA純化試劑盒純化1 335 bp的目的DNA片段，利用T4DNA連接酶將目的DNA片段與pET28a載體連接，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌(DH5α)感受態(tài)細(xì)胞對(duì)原核表達(dá)載體擴(kuò)增，對(duì)帶有pET28a重組質(zhì)粒的大腸桿菌菌液進(jìn)行PCR鑒定，產(chǎn)物通過(guò)1%的瓊脂糖凝膠電泳觀察，結(jié)果與1 335 bp的目的基因條帶大小相同(圖9)。運(yùn)用TIANGEN質(zhì)粒小提試劑盒對(duì)帶有pET28a重組質(zhì)粒進(jìn)行質(zhì)粒提取，用NdeⅠ和BglⅡ進(jìn)行雙酶切，與預(yù)期結(jié)果一致(圖10)。選取3個(gè)菌懸液送到華大基因科技股份有限公司進(jìn)行測(cè)序檢測(cè)，經(jīng)DNAMAN比對(duì)，確定為蛋白酶成熟區(qū)域序列，原核表達(dá)載體構(gòu)建成功。

M. DL15000; 1-2.PCR產(chǎn)物。M. DL15000 DNA Marker; 1-2. Production of PCR.

M. DL15000; 1-2.酶切產(chǎn)物。M. DL15000 DNA Marker; 1-2. Production of double digestion.

3 結(jié)論與討論

生物信息學(xué)是對(duì)擁有準(zhǔn)確基因序列的蛋白質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)，獲得其編碼區(qū)域信息，完成基礎(chǔ)信息及結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的一門學(xué)科，其為后續(xù)蛋白功能的研究奠定基礎(chǔ)。

由于向日葵銹菌是專性寄生菌之一，徹底根除十分困難，所以從分子水平了解向日葵銹菌的致病機(jī)制，尋找合適的靶標(biāo)進(jìn)行病害控制也是一種有效的病害管理途徑。分泌蛋白需要具備以下4個(gè)特征：①N-端信號(hào)肽；②無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域；③無(wú)GPI錨定位點(diǎn)；④沒(méi)有將蛋白輸送至線粒體或其他胞內(nèi)細(xì)胞器的預(yù)測(cè)定位信號(hào)。本研究利用在線軟件SignalP4.1Server、TMpred、big-PI predictor及TargetP 1.1確定此蛋白酶為胞外分泌蛋白，這類蛋白酶主要作為水解酶、酯酶及磷酸酶集中參與細(xì)胞代謝。據(jù)報(bào)道，許多病菌通過(guò)分泌蛋白進(jìn)入寄主細(xì)胞，達(dá)到致病作用，如卵菌在侵染植株時(shí)，會(huì)分泌胞外效應(yīng)子干擾植株自身免疫系統(tǒng)，其中就包含細(xì)胞壁降解酶(Cell wall-degrading enzymes，CWDE)[18]。

利用生物信息學(xué)在線軟件，得到蛋白酶ORF區(qū)域，確定該蛋白酶成熟蛋白分子質(zhì)量為49.5 ku，據(jù)報(bào)道煙曲霉(Aspergillusfumigatus)[8，19]、梗青霉(Nomuraeaatypicola)[20]、灰蓋鬼傘菌(Coprinopsiscinerea)[21]、白蠟多年臥孔菌(Perenniporiafraxinea)[22]都發(fā)現(xiàn)可分泌的金屬蛋白酶，煙曲霉菌的金屬蛋白酶分子質(zhì)量為43 ku，梗青霉菌所分泌的金屬肽酶為48 ku，灰蓋鬼傘菌及白蠟多年臥孔菌分泌的金屬蛋白酶分別為37～46 ku及42 ku。

通過(guò)分析軟件分析蛋白酶序列發(fā)現(xiàn)其此類蛋白為活性中心依賴于鋅的金屬肽酶。許多含鋅離子的金屬蛋白酶在微生物中廣泛存在，如熒光假單胞菌(Pseudamonasfluoroscens)的AprX細(xì)胞外金屬蛋白酶[23-25]；芽孢桿菌(Bacillus)中性金屬蛋白酶[26-27]，粘質(zhì)沙雷氏菌(Serralysin)的SmP金屬蛋白酶[28-29]；皮氏羅爾斯通氏菌(Ralstoniapickettii)的RpA金屬蛋白酶[30]，這些病原菌分泌的金屬蛋白酶，其活性中心都含有鋅離子。利用SWISS-MODEL推斷它為胞外彈性金屬蛋白酶，通過(guò)比對(duì)，顯示它屬于真菌素M36蛋白酶家族，與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)其他物種的金屬蛋白酶進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示其氨基酸同M36家族中5條蛋白序列具有高度相似性，再通過(guò)SWISS-MODEL基于同源建模的方法，發(fā)現(xiàn)同M36胞外金屬蛋白酶基因序列相似度達(dá)到53.77%。據(jù)報(bào)道[18]，M36家族為金屬肽酶，其為一種分泌蛋白，M36家族蛋白酶為依賴于金屬離子的一類蛋白酶，已發(fā)現(xiàn)的M36家族金屬肽酶編碼氨基酸分子質(zhì)量在40～48 ku，且M36金屬肽酶水解氨基酸中多肽鍵以達(dá)到致病效果。隨著研究不斷深入[8，31]，已發(fā)現(xiàn)多數(shù)M36肽酶家族在不同環(huán)境或不同發(fā)育調(diào)節(jié)下可以分解相應(yīng)底物，在真菌中，細(xì)胞外分泌蛋白一般具有2種功能，一是可以水解相應(yīng)底物的蛋白質(zhì)，二是軟化寄主組織進(jìn)行自身的擴(kuò)增、繁殖、定殖。因此，真菌素M36蛋白家族可能屬于細(xì)胞外分泌蛋白，并且這類酶可能作為真菌的主要致病因子所存在。推斷向日葵銹菌所分泌的彈性金屬蛋白酶也很可能屬于M36家族。

本研究對(duì)向日葵銹菌金屬蛋白酶基因克隆及原核表達(dá)的載體構(gòu)建，有利于銹菌或其他真菌致病基因的發(fā)現(xiàn)和研究，可以從基因水平上研究真菌侵染機(jī)制，也為進(jìn)一步研究其蛋白質(zhì)調(diào)控提供依據(jù)[32]，進(jìn)而有望在分子水平找到向日葵銹病防治靶標(biāo)。本研究對(duì)向日葵銹菌金屬蛋白酶基因的克隆和生物信息學(xué)的分析，為后續(xù)金屬蛋白酶研究奠定了基礎(chǔ)，也為其他真菌及致病蛋白的研究提供依據(jù)。