毛跟年, 丁順軍, 夏 娟, 祁旭平, 梁毅廷, 梁承遠(yuǎn)*

(1.陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 陜西 西安 710021; 2.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 血液病科， 廣東 湛江 524023)

0 引言

棉酚(如圖1所示)又名棉毒素或棉籽醇，是一種多酚雙萘醛類化合物，存在于錦葵科植物棉花的根、莖和種子中[1].1886年由Longmore 和Marchlewski首次發(fā)現(xiàn)，1889 年第一次從棉籽中提取棉酚，1938年闡明其化學(xué)結(jié)構(gòu)，棉酚分子質(zhì)量為518.194 1，分子式為(C30H30O8)[2,3].上世紀(jì)80年代科學(xué)家發(fā)現(xiàn)棉酚具有抗生育作用，逐漸被人們熟知[4]，后又臨床用于治療女性激素依賴性疾病，包括子宮內(nèi)膜異位癥、子宮肌瘤、功能失調(diào)性子宮出血和痛經(jīng)等.通過對(duì)棉酚的深入研究發(fā)現(xiàn)，棉酚具有多種生物活性，如抗炎、抗瘧、抗病毒及抗氧化等，尤其是具有明顯的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的能力[5,6].

圖1 棉酚的結(jié)構(gòu)

棉酚是手性化合物，存在兩種對(duì)映異構(gòu)體：棉酚(+)和棉酚(-)對(duì)映體[7]，棉酚光學(xué)穩(wěn)定性差，在光照下，單一構(gòu)型的棉酚在外消旋作用下，很快轉(zhuǎn)化為1∶1比例的非對(duì)映異構(gòu)體混合物[7].棉酚結(jié)構(gòu)中6-OH、8-CHO和1- OH能發(fā)生互變異構(gòu)，存在三種互變異構(gòu)體[8](如圖2所示)，棉酚固態(tài)條件下主要是雙醛式對(duì)映體，當(dāng)其溶于氯仿、苯、丙酮等溶劑時(shí)，氫譜結(jié)果顯示只有醛式對(duì)映體存在；棉酚在高氫鍵接受質(zhì)子的溶劑(DMSO)中主要以雙醇酮式和雙內(nèi)醚式存在[9,10]；三種互變異構(gòu)體的相互轉(zhuǎn)化是棉酚化學(xué)反應(yīng)較為復(fù)雜的主要原因，也為棉酚結(jié)構(gòu)修飾提供化學(xué)基礎(chǔ).

圖2 棉酚肉桂酸酯的結(jié)構(gòu)

棉酚8，8′位的醛基與細(xì)胞毒性有關(guān)[11]，本研究希望棉酚在高氫鍵接受質(zhì)子的溶劑轉(zhuǎn)化為雙醇酮式互變異構(gòu)體[9,10]，其結(jié)構(gòu)中醇羥基與酸進(jìn)一步酯化，通過結(jié)構(gòu)修飾增強(qiáng)棉酚的光學(xué)與化學(xué)穩(wěn)定性，減少互變異構(gòu)，進(jìn)而降低棉酚的細(xì)胞毒性.肉桂酸是常見的化學(xué)合成砌塊，本身具有抗氧化、自由基清除和抗腫瘤作用[12]與棉酚通過酯化反應(yīng)結(jié)合后不僅可以作用于細(xì)胞色素P450酶系，降低棉酚細(xì)胞毒性，還可以保留較強(qiáng)的棉酚生物活性，也為棉酚結(jié)構(gòu)衍生化提供了新思路和新途徑.

在合成棉酚肉桂酸酯過程中，利用薄層色譜法(TLC)對(duì)新化合物做定性鑒別，并通過核磁波譜解析技術(shù)對(duì)其結(jié)構(gòu)作進(jìn)一步的確證.生物實(shí)驗(yàn)中以伊馬替尼(如圖3所示)為陽性對(duì)照，使用CCK-8法初步篩選新合成的棉酚衍生物對(duì)3種人類白血病細(xì)胞株(HL-60、Jurkat和K562)的抗白血病活性，為進(jìn)一步探討其抗白血病作用機(jī)制提供生物基礎(chǔ).具體的棉酚肉桂酸酯合成過程如圖4所示.

圖3 伊馬替尼的結(jié)構(gòu)

圖4 棉酚肉桂酸酯合成

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1.1 試劑

棉酚 (南京康滿林化工實(shí)業(yè)有限公司)，肉桂酸(武漢遠(yuǎn)成共創(chuàng)科技有限公司)，二氯亞砜(分析純)，乙酸乙酯(分析純)，石油醚(分析純)，甲醇(分析純)，三乙胺(分析純)，氘代DMSO(Sigma-Aldrich)，CCK-8試劑盒(Med Chemexpress LLC)，HL-60(人原髓細(xì)胞白血病細(xì)胞)、Jurkat(急性T細(xì)胞白血病細(xì)胞)、K562(慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞)(細(xì)胞系均由廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院提供)，胎牛血清(上海麥克林生化科技有限公司)，二甲基亞砜(DMSO)(美國HBC Chem,Inc東方科技公司) SDS(Sigma-Aldrich)，RPMI1640培養(yǎng)基(Sigma-Aldrich) .

1.1.2 儀器

磁力攪拌器(上海志威電器有限公司)，加熱套(江蘇近湖教學(xué)儀器廠)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)其(RE52CS-1，上海亞榮生化儀器廠)，循環(huán)水多用真空泵(SHB-3A，南京大衛(wèi)儀器設(shè)備有限公司)，流式細(xì)胞儀(德國Sysmex Partec，Dickinson and Company)，CO2培養(yǎng)箱 (上海力申科學(xué)儀器有限公司)，96孔培養(yǎng)板 (青島金典生化器材有限公司)，超凈工作臺(tái) (上海滬凈醫(yī)療器械有限公司廠).

1.2 棉酚肉桂酸酯合成

1.2.1 肉桂酰氯合成

稱取肉桂酸35 mg，二氯甲烷(除水)溶解，加入1 mL二氯亞砜(新制)，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)，TLC檢測(cè)監(jiān)測(cè)反應(yīng)終點(diǎn)，反應(yīng)完全，減壓濃縮，除去溶劑和過量的二氯亞砜，得肉桂酰氯36.2 mg，收率為91.4%.

1.2.2 棉酚肉桂酸酯合成

稱取棉酚102.3 mg，加入三口燒瓶中，攪拌并逐滴加入10 mL乙腈、三乙胺(10∶0.1)混合溶液，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下常溫?cái)嚢璺磻?yīng)0.5～1 h，加入新制肉桂酰氯36.2 mg，補(bǔ)加10 mL乙腈，升溫至70 ℃攪拌反應(yīng)約8 h，TLC追蹤至反應(yīng)終點(diǎn).停止攪拌撤去加熱裝置，靜置析晶，抽濾，乙腈洗滌濾餅三次，干燥即得棉酚肉桂酸酯精品(黃色固體)105.8 mg，收率為92.2%.

1.3 衍生物活性測(cè)試

1.3.1 CCK-8

CCK-8可以用于細(xì)胞增殖和毒性分析.其基本原理為該試劑中含有WST-8，它在電子載體(1-Methoxy PMS)的作用下被細(xì)胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚染料，生成甲瓚物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比，因此可以用這一特性直接進(jìn)行細(xì)胞增殖和毒性分析.

1.3.2 溶液配制

1% w/v SDS溶液配制：組份濃度， 10%(W/V)SDS，配制量:100 mL.具體配制方法如下:

(1)稱量10 g高純度的SDS置于100～200 mL 燒杯中，加入約80 mL的去離子水，68 ℃加入溶解；

(2)滴加濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值至7.2；

(3)將溶液定容至100 mL后，室溫保存.

1.3.3 對(duì)照藥物和待測(cè)藥物配制方法

用生理鹽水配制伊馬替尼溶液和棉酚肉桂酸酯溶液，使藥物最終濃度均為3.125、6.25、12.5、25、50、100μmol/L六種濃度.

1.3.4 細(xì)胞株類型和培養(yǎng)方法

(1)細(xì)胞株類型：HL-60(人原髓細(xì)胞白血病細(xì)胞)、Jurkat(急性T細(xì)胞白血病細(xì)胞)、K562(慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞).

(2)培養(yǎng)方法：細(xì)胞用含有10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)箱內(nèi)濕度飽和，CO2濃度為5%.懸浮細(xì)胞每3天處理一次，保證細(xì)胞正常的懸浮生長狀態(tài).

1.3.5 細(xì)胞增殖試驗(yàn)

(1)接種細(xì)胞懸液100μL于96孔板，預(yù)先置于37 ℃，CO2(5%)飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；

(2)在每孔內(nèi)加入10μL的CCK-8試劑；

(3)把培養(yǎng)板放培養(yǎng)箱內(nèi)1～6 h(根據(jù)細(xì)胞類型與測(cè)試時(shí)間有所不同)；

(4)在450 mm波長處測(cè)定吸光值，參比波長為600 nm或以上波長.

1.3.6 測(cè)試方法

細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn).具體方法如下：

將處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞制備成約為5×104個(gè)/L的細(xì)胞懸液，每孔加入100μL 細(xì)胞懸液接種于96孔板中，24 h后分別加入100μL含不同濃度棉酚肉桂酸酯的培養(yǎng)液.分為對(duì)照組(常規(guī)培養(yǎng))、實(shí)驗(yàn)組(0.1 g·L-1、0.2 g·L-1、0.3 g·L-1和0.4 g·L-1)、GPS處理組(每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔).在72 h時(shí)進(jìn)行CCK-8比色實(shí)驗(yàn).處理結(jié)束前4 h，每孔加CCK-8溶液10μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，在450 nm處進(jìn)行吸光度A測(cè)定.根據(jù)式(1)計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組抑制率，進(jìn)一步對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析.此實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.

(1)

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)構(gòu)鑒別

棉酚肉桂酸酯核磁數(shù)據(jù)(圖5)如下：1H-NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ:10.05(2H,s,C6、6′-OH),8.86(1H,s,C11-OH),8.50(1H,S,C11′-OH),7.49(4H,d,C20、21、23、24-H),7.33(2H,d,C17、18-H),7.23(2H,s,C4、4′-H),6.98(1H,s,C22-H),6.89(1H,S,C11′-H),3.75(2H,s,C1、1′-OH),2.20(2H,d,C13、13′-H),2.09(6H,s,C3、3′-CH3),1.45(12H,s,C13、13′-CH3);13C-NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ:178.6(C7、7′),174.7(C11′),170.3(C6、6′),157.9(C1、1′),157.2(C16),147.9(C18),1 415.2(C11),137.8(C3、3′),137.2(C10、10′),135.2(C19),133.7(C5、5′),128.6(C20、21、23、24),127.9(C22),125.5(C2、2′),124.8(C8),119.6(C4、4′),117.3(C9、9′),116.2(C8′),115.5(C17),26.8(C13、13′),22.5(C14、15、14、15′),19.4(C12、12′).MS(ESI); found,649.3.

圖5 棉酚肉桂酸酯1H-NMR圖

2.2 棉酚肉桂酸酯抗白血病活性分析

本實(shí)驗(yàn)對(duì)合成所得到的棉酚肉桂酸酯作用于3種人類白血病細(xì)胞株(HL-60、Jurkat和K562)的體外抗腫瘤活性進(jìn)行研究，采用標(biāo)準(zhǔn)的Cell Counting Kit-8(CCK-8試劑盒)法，本實(shí)驗(yàn)陽性對(duì)照為已上市抗白血病藥物伊馬替尼(如圖3所示).

根據(jù)圖6實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，棉酚肉桂酸酯對(duì)Jurkat細(xì)胞系體外增殖抑制活性，當(dāng)化合物濃度低于12.5μM時(shí)，棉酚肉桂酸酯對(duì)Jurkat細(xì)胞系體外增殖呈現(xiàn)低濃度促進(jìn)作用，與對(duì)照組相比濃度為3.125μM和6.25μM細(xì)胞數(shù)明顯增加(如圖7所示)；當(dāng)化合物濃度高于25μM時(shí)，對(duì)Jurkat細(xì)胞系體外增殖呈現(xiàn)抑制作用，且隨化合物濃度增加抑制率逐漸增加，隨藥物濃度的增加細(xì)胞死亡數(shù)目明顯增加(如圖7所示)；當(dāng)化合物濃度為100μM時(shí)，對(duì)Jurkat細(xì)胞系體外抑制率最高為85.073%.棉酚肉桂酸酯對(duì)HL-60細(xì)胞系體外增殖抑制活性， 當(dāng)化合物濃度低于12.5μM時(shí)，對(duì)HL-60細(xì)胞系體外增殖抑制作用沒有明顯增加，3.125μM和6.25μM的藥物濃度下，細(xì)胞數(shù)量沒有明顯減小(如圖7所示)；當(dāng)化合物濃度高于25μM時(shí)，隨濃度增加對(duì)HL-60細(xì)胞系體外增殖抑制作用呈明顯增加，細(xì)胞數(shù)量隨藥物濃度增加逐漸減少(如圖7所示)；當(dāng)化合物濃度為100μM時(shí)，對(duì)HL-60細(xì)胞系體外抑制率最高為82.005%.棉酚肉桂酸酯對(duì)K562細(xì)胞系體外增殖抑制活性，隨濃度增加，棉酚肉桂酸酯對(duì)K562細(xì)胞系體外增殖抑制作用逐漸增強(qiáng)，當(dāng)化合物濃度為100μM時(shí)，對(duì)K562細(xì)胞系體外抑制率最高為94.191%.當(dāng)棉酚肉桂酸酯濃度達(dá)到25μM，棉酚肉桂酸酯對(duì)3種細(xì)胞的抑制作用效果相同；當(dāng)濃度增加為50μM時(shí)，棉酚肉桂酸酯對(duì)Jurkat細(xì)胞系的抑制作用強(qiáng)于對(duì)HL-60 和K562的抑制作用；當(dāng)濃度增加為100μM時(shí)，棉酚肉桂酸酯對(duì)K562細(xì)胞系的抑制作用強(qiáng)于對(duì)HL-60和Jurkat的抑制作用.

(a)棉酚肉桂酸酯對(duì)Juekat抑制率隨濃度變化曲線

(b)棉酚肉桂酸酯對(duì)HL-60抑制率隨濃度變化曲線

(c)棉酚肉桂酸酯對(duì)K562抑制率隨濃度變化曲線圖6 棉酚肉桂酸酯對(duì)3種白血病細(xì)胞系體外抑制率隨濃度變化曲線

棉酚肉桂酸酯對(duì)Jurkat、HL-60和K562細(xì)胞系體外增殖抑制活性小于對(duì)照藥物伊馬替尼(如表1所示)，當(dāng)棉酚肉桂酸酯濃度分別為41.71μM和33.64μM時(shí)對(duì)HL-60和K562細(xì)胞增殖抑制率達(dá)到50%；其對(duì)Jurkat細(xì)胞表現(xiàn)為抑制增殖作用，當(dāng)棉酚肉桂酸酯濃度為25.83μM時(shí)，對(duì)Jurkat細(xì)胞增殖抑制率達(dá)到50%.綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析表明棉酚肉桂酸酯對(duì)3種人類白血病細(xì)胞株(HL-60、Jurkat和K562)的抑制作用表現(xiàn)為濃度依賴型，相比與上市藥物伊馬替尼的作用弱.

表1 棉酚肉桂酸酯對(duì)3種白血病細(xì)胞系的體外抗增殖活性

本實(shí)驗(yàn)對(duì)照藥物伊馬替尼(imatinib)是酪氨酸激酶抑制劑，能選擇性地抑制Bcr-Abl蛋白的酪氨酸激酶活性，從而阻斷多條信號(hào)傳導(dǎo)途徑，達(dá)到治療白血病的目的[13,14].此外，該藥還能抑制c-Kit、血小板源性生長因子受體(PDGFR)、ARG等受體型酪氨酸激酶活性，從而起到抗瘤作用[14-17].而以往研究顯示，棉酚能抑制Bcl-2蛋白的過度表達(dá)，引起細(xì)胞器功能喪失和增加凋亡因子的釋放，促使細(xì)胞凋亡[18-20].肉桂酸具有抗氧化和清除自由基作用，同時(shí)可作用于促分裂原活化蛋白激酶(MAPKs)，PI3Ks，NF-κB多個(gè)靶點(diǎn)發(fā)揮抗腫瘤作用[12].由此初步推測(cè)，棉酚肉桂酸酯可能是通過干預(yù)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)來促進(jìn)細(xì)胞凋亡，同通過作用于氧化應(yīng)激防止白血病細(xì)胞增殖.鑒于在Jurkat細(xì)胞系中，棉酚肉桂酸酯與陽性藥伊馬替尼的活性最為接近，未來可通過對(duì)棉酚肉桂酸酯抗腫瘤機(jī)制進(jìn)一步探究，有望成開發(fā)為溫和治療急性T細(xì)胞白血病的新型藥物.

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)棉酚進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，得到的新化合物棉酚肉桂酸酯，通過CCK-8法，對(duì)3種人類白血病細(xì)胞株(HL-60、Jurkat和K562)進(jìn)行體外抗腫瘤活性研究.結(jié)果表明，棉酚肉桂酸酯對(duì)三種細(xì)胞都表現(xiàn)為濃度依賴型，對(duì)HL-60和K562細(xì)胞抑制作用比對(duì)照藥物伊馬替尼弱，對(duì)Jurkat細(xì)胞抑制作用較強(qiáng)，上述結(jié)果表明棉酚與肉桂酸酯化后具有較好的抗白血病效果，可作為先導(dǎo)化合物進(jìn)一步研究其作用機(jī)制，有望成為一種抑制不同白血病亞型的低毒候選藥物.另一方解決了棉酚互變異構(gòu)的問題，具有更好的光學(xué)和化學(xué)穩(wěn)定性，有利于成藥.

圖7 棉酚肉桂酸酯對(duì)3種白血病細(xì)胞系體外抑制