彭召云 鄭心 李龍祥 李士濤

(山東中醫(yī)藥大學(xué) 1第二附屬醫(yī)院呼吸科，山東 濟(jì)南 250001；2康復(fù)學(xué)院；3濟(jì)南市中心醫(yī)院功能檢查科)

肺癌又稱(chēng)原發(fā)性支氣管肺癌，發(fā)病率及死亡率逐年增高〔1〕。非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)約占肺癌發(fā)病率的86.3%〔2〕，放化療治療有諸多的不良反應(yīng)及局限性〔3，4〕，近年來(lái)中醫(yī)學(xué)在腫瘤領(lǐng)域的治療中取得了顯著成效。磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信號(hào)通路在腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、存活、增殖、凋亡、血管生成等過(guò)程中具有重要作用〔5〕。研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKT信號(hào)通路貫穿于NSCLC的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，活化的PI3K/AKT通路通過(guò)激活下游多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展〔6〕。研究發(fā)現(xiàn)中藥可有效抑制PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的AKT位點(diǎn)，促進(jìn)肺癌細(xì)胞的凋亡〔7〕。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)前期研究〔8～10〕復(fù)制Lewis肺癌小鼠模型，以化療藥順鉑作對(duì)照，采用免疫印跡法、免疫組化檢測(cè)PI3K/AKT信號(hào)通路蛋白，探討肺抑瘤膏抑瘤的作用機(jī)制。

1 材料及方法

1.1材料及用藥 瘤株來(lái)源：Lewis肺癌荷瘤雄性小鼠2只購(gòu)于國(guó)家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源共享平臺(tái)，荷瘤傳3代后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)小鼠：C57BL/6近交系雄性小鼠(許可證號(hào)SCXK(魯)20140007)，6～8周齡，體重(18±2)g。AKT抗體(CST#4691)、PI3K抗體(CST#4257)、雷帕霉素靶蛋白(mTOR，CST#2983)、通用型SP檢測(cè)試劑盒#SP-9000 WK152108(中杉金橋)；十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)配制試劑盒#P0012A(碧云天生物技術(shù))。肺抑瘤膏(1 ml膏方相當(dāng)于生藥量4.3 g)由山東中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥劑科按照膏方制備工藝流程制備，分裝保存?zhèn)溆?。注射用順鉑：規(guī)格20 mg，齊魯制藥有限公司，產(chǎn)品批號(hào)：1WA2A15040258。

1.2造模方法 將C57BL/6荷瘤小鼠采用脫頸椎法處死，酒精消毒，在超凈工作臺(tái)上用已滅菌的剪刀、鑷子完整剝離腫瘤組織，于冰上研磨并制備細(xì)胞懸濁液，離心計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0×107/ml，在小鼠腋窩下接種腫瘤細(xì)胞懸液0.2 ml/只(約含瘤細(xì)胞2.0×106個(gè))。注射后見(jiàn)小鼠腋窩處形成一圓形透明水泡即為成功〔11〕。

1.3分組及給藥 當(dāng)能用游標(biāo)卡尺在小鼠腋下測(cè)到瘤體時(shí)，按照SPSS統(tǒng)計(jì)軟件隨機(jī)分為模型組、肺抑瘤膏低劑量組、肺抑瘤膏中劑量組、肺抑瘤膏高劑量組、順鉑組、順鉑加肺抑瘤膏中劑量組共6組，12只/組。參照徐叔云等〔12〕主編的《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》第三版，中藥給藥劑量相當(dāng)于60 kg成年人按公斤/體重折算劑量的等效劑量。各組給藥如下：每天灌胃給予模型組0.2 ml生理鹽水，肺抑瘤膏低劑量組予0.2 ml/d生理鹽水稀釋1倍的肺抑瘤膏，肺抑瘤膏中劑量組、順鉑加肺抑瘤膏中劑量組予0.2 ml/d肺抑瘤膏，肺抑瘤膏高劑量組予0.4 ml/d肺抑瘤膏，連續(xù)灌胃3 w。順鉑組、順鉑加肺抑瘤膏中劑量組予順鉑溶液腹腔注射1.5 mg/(kg·d)，連續(xù)注射3 d。

1.4瘤重、腫瘤抑制率 末次灌胃結(jié)束后禁食水，次日處死存活模型小鼠，迅速剝離模型小鼠腋下瘤體，用濾紙吸干凈瘤體周?chē)难獫n后稱(chēng)瘤重。腫瘤抑制率=(模型組平均瘤重-余各組平均瘤重)/模型組平均瘤重×100%。

1.5Western印跡法檢測(cè)種植瘤組織中PI3K、AKT蛋白表達(dá) 種植瘤組織勻漿、裂解提取總蛋白，分光光度計(jì)測(cè)定蛋白濃度，取蛋白樣品電泳轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，室溫封閉 2 h，PI3K、AKT及β-actin一抗孵育過(guò)夜，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗膜，分別用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育 1 h，洗滌后室溫顯影，凝膠成像系統(tǒng)拍照、封存、計(jì)算平均相對(duì)表達(dá)量。

1.6種植瘤組織病理學(xué)觀察 剝離模型小鼠種植瘤，迅速固定于10%中性甲醛中，石蠟包埋后切片，常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察Lewis肺癌種植瘤病理組織形態(tài)學(xué)變化。

1.7免疫組化法檢測(cè)種植瘤組織中mTOR蛋白表達(dá) 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，乙二胺四乙酸(EDTA)抗原修復(fù)，3%過(guò)氧化氫(H2O2)去離子水孵育，PBS沖洗，山羊血清工作液封閉室溫孵育，滴加mTOR一抗4℃過(guò)夜，PBS沖洗，生物素化二抗工作液室溫孵育，PBS沖洗，辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液室溫孵育，PBS沖洗，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，自來(lái)水充分沖洗，蘇木素輕度復(fù)染、脫水、透明、中性樹(shù)膠封片，顯微鏡觀察，陽(yáng)性結(jié)果為：胞質(zhì)呈棕黃色顆粒狀。HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)計(jì)算每張切片陽(yáng)性細(xì)胞占總細(xì)胞的百分比含量。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS17.0軟件，符合正態(tài)分布的，采用方差分析；不符合正態(tài)分布的，采用非參數(shù)檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1動(dòng)物一般情況 肺抑瘤膏高劑量組意外死亡2只，順鉑加肺抑瘤膏中劑量組死亡1只，解剖后發(fā)現(xiàn)死因均為灌胃誤入氣管。

2.2種植成功率 各組接種Lewis肺癌細(xì)胞懸液后，1 w內(nèi)小鼠腋下均可觸及腫瘤硬結(jié)，用精度為0.01 mm的游標(biāo)卡尺測(cè)量、計(jì)算，結(jié)果顯示瘤體體積均可達(dá)到100 mm3左右。種植成功率為100%。

2.3各組瘤重、抑瘤率比較 各劑量肺抑瘤膏組Lewis肺癌模型小鼠種植瘤瘤重均較模型組降低，肺抑瘤膏低劑量組、肺抑瘤膏中劑量組、肺抑瘤膏高劑量組隨著肺抑瘤膏濃度的增加其抑瘤率越來(lái)越高(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組Lewis肺癌種植瘤瘤重、抑瘤率、PI3K、AKT及mTOR表達(dá)

與模型組比較：1)P<0.05；與肺抑瘤膏低劑量組比較：2)P<0.05；與肺抑瘤膏中劑量組比較：3)P<0.05；與肺抑瘤膏高劑量組比較：4)P<0.05；與順鉑組比較：5)P<0.05

2.4各組種植瘤組織病理比較 各組Lewis肺癌模型小鼠種植瘤細(xì)胞未見(jiàn)腺體結(jié)構(gòu)，細(xì)胞異型性大，屬于低分化癌。肺抑瘤膏中劑量組、肺抑瘤膏高劑量組、順鉑組、順鉑加肺抑瘤膏中劑量組均可見(jiàn)壞死腫瘤細(xì)胞。見(jiàn)圖1。

2.5各組mTOR蛋白表達(dá)比較 模型組mTOR表達(dá)量最高，除順鉑組外，與其他4組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。肺抑瘤膏低劑量組種植瘤mTOR表達(dá)，與肺抑瘤膏中劑量組、肺抑瘤膏高劑量組、順鉑組、順鉑加肺抑瘤膏中劑量組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；肺抑瘤膏中劑量組mTOR表達(dá)與肺抑瘤膏高劑量組、順鉑組、順鉑加肺抑瘤膏中劑量組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；肺抑瘤膏高劑量組mTOR表達(dá)與順鉑組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。順鉑加肺抑瘤膏中劑量組mTOR表達(dá)顯著低于順鉑組(P<0.05)。見(jiàn)表1、圖2。

圖2 各組Lewis模型小鼠種植瘤mTOR表達(dá)(×400)

2.6各組PI3K、AKT蛋白表達(dá)的比較 模型組PI3K、AKT表達(dá)量最高，與肺抑瘤膏中劑量組、肺抑瘤膏高劑量組、順鉑加肺抑瘤膏中劑量組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各組藥物干預(yù)均可降低種植瘤PI3K、AKT表達(dá)，但肺抑瘤膏低劑量組及順鉑組PI3K、AKT表達(dá)量與模型組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。肺抑瘤膏低劑量組PI3K、AKT表達(dá)與肺抑瘤膏中劑量組、肺抑瘤膏高劑量組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；肺抑瘤膏中劑量組PI3K、AKT表達(dá)與順鉑組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；肺抑瘤膏高劑量組PI3K、AKT表達(dá)，與順鉑組及順鉑加肺抑瘤膏中劑量組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1、圖3、圖4。

1～6:模型組、肺抑瘤膏低劑量組、肺抑瘤膏中劑量組、肺抑瘤膏高劑量組、順鉑組、順鉑加肺抑瘤膏中劑量組；圖4同圖3 各組PI3K蛋白表達(dá)

圖4 各組AKT蛋白表達(dá)

3 討 論

PI3K/AKT信號(hào)通路可激活磷酸化mTOR及下游的p70S6K和真核轉(zhuǎn)錄起始因子4Z結(jié)合蛋白(4E-BPI)的磷酸化而抑制細(xì)胞凋亡；上調(diào)細(xì)胞周期素、細(xì)胞周期依賴(lài)性蛋白激酶等的翻譯，促進(jìn)周期運(yùn)行，加速腫瘤細(xì)胞增殖和分化；促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的表達(dá)，增加腫瘤細(xì)胞血管生成等〔13，14〕。研究〔15〕發(fā)現(xiàn)補(bǔ)中益氣湯通過(guò)抑制A549/DDP 細(xì)胞中PI3K的基因，降低AKT磷酸化，使下游因子如Bad、核因子(NF)-κb表達(dá)減少及含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-9表達(dá)增多，進(jìn)而促進(jìn)A549/DDP細(xì)胞的凋亡。研究〔16〕發(fā)現(xiàn)肺巖寧方聯(lián)合吉非替尼可顯著抑制H1975肺癌小鼠移植瘤的生長(zhǎng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，顯著下調(diào)p-表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)、p-AKT、p-mTOR水平。其作用機(jī)制可能與阻斷PI3K/AKT信號(hào)通路有關(guān)。通過(guò)以上文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，中藥可抑制腫瘤細(xì)胞PI3K/AKT信號(hào)通路蛋白表達(dá)，抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，提示中藥肺抑瘤膏可能通過(guò)抑制PI3K/AKT信號(hào)通路發(fā)揮抑瘤作用，本實(shí)驗(yàn)從蛋白層面探討肺抑瘤膏抑制Lewis肺癌模型小鼠種植瘤生長(zhǎng)可能的作用機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示低、中、高劑量肺抑瘤膏均可減小Lewis肺癌模型小鼠種植瘤瘤重，且隨肺抑瘤膏劑量的增加抑瘤率逐漸遞增，說(shuō)明肺抑瘤膏能抑制Lewis肺癌種植瘤生長(zhǎng)且與用藥劑量相關(guān)。PI3K/AKT信號(hào)通路蛋白檢測(cè)結(jié)果提示不同劑量肺抑瘤膏均可降低Lewis肺癌模型小鼠種植瘤PI3K、AKT、mTOR蛋白的表達(dá)，說(shuō)明肺抑瘤膏可抑制PI3K/AKT信號(hào)通路蛋白表達(dá)。順鉑對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路蛋白表達(dá)影響不明顯，可能與順鉑作用于腫瘤細(xì)胞后影響了腫瘤細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)通路及各信號(hào)通路間交叉級(jí)聯(lián)有關(guān)，其具體作用機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。