張景怡，鮑翠玉，李 晶

(湖北科技學(xué)院 1. 藥學(xué)院、2. 糖尿病心腦血管病變湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 咸寧 437100)

糖尿病是一種在醫(yī)療保健系統(tǒng)中造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)影響，且發(fā)病率越來越高的代謝性疾病[1]，其心血管并發(fā)癥的發(fā)病率和死亡率在逐年增加[2]。而糖尿病性心肌病是一種特殊的心臟并發(fā)癥，近年來，諸多文獻(xiàn)報(bào)道表明，糖尿病心肌病的發(fā)病過程與脂毒性密切相關(guān)[3]，經(jīng)常伴有相關(guān)的脂肪酸代謝失調(diào)。在糖尿病嚙齒動(dòng)物模型和肥胖患者中，盡管出現(xiàn)了高胰島素血癥和高血糖癥，但心肌的損害幾乎完全依賴于脂肪酸的利用，飽和脂肪酸的過量供應(yīng)抑制葡萄糖氧化速率，并加劇心肌耗氧，增加了活性氧的產(chǎn)生和脂質(zhì)體堆積，導(dǎo)致心肌氧化損傷[4-5]。

白藜蘆醇是一種存在于虎杖、何首烏等天然植物中的非黃酮類多酚化合物，具有抗炎、抗血小板聚集、抗癌和抗衰老、保護(hù)血管和抗糖尿病及其并發(fā)癥的作用[6]。研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可以降低血糖、改善血脂、抗氧化、抑制炎癥因子表達(dá)等[7]，據(jù)報(bào)道，白藜蘆醇的這些作用可能與調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、線粒體凋亡通路相關(guān)[8-9]。但AMPK/mTORC1/p70S6K信號(hào)通路與白藜蘆醇抗脂毒性心肌細(xì)胞損傷的相關(guān)性，目前尚無文獻(xiàn)報(bào)道。基于此，本研究以AMPK/mTORC1/p70S6K信號(hào)通路為切入點(diǎn)，采用棕櫚酸(palmitic acid，PA)誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞脂毒性損傷模型，探討白藜蘆醇對(duì)高脂所致心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞株 H9c2大鼠心肌細(xì)胞，購(gòu)自上海通派生物有限公司。

1.1.2試劑 AMPKα、p-AMPKα(Thr172)、mTORC1、p-mTORC1(Ser2448)、p70S6K、p-p70S6K(Thr398)、Bcl-2、cleaved caspase-3、β-actin(8H10D10)抗體，購(gòu)自美國(guó)CST公司；Bax抗體，購(gòu)自Proteintech公司；PA、白藜蘆醇，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基，購(gòu)自美國(guó)HyClone公司；胎牛血清，購(gòu)自浙江天杭生物科技股份有限公司；BCA蛋白定量試劑盒，購(gòu)自VazymE公司；丙二醛(malondialdehyde，MDA)檢測(cè)試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自南京建成生物工程研究所；活性氧(reactive oxygen species，ROS)檢測(cè)試劑盒、MTT檢測(cè)試劑盒，均購(gòu)自碧云天公司。

1.1.3儀器 細(xì)胞CO2培養(yǎng)箱(Thermo公司)；超凈工作臺(tái)(蘇州凈化公司)；恒溫空氣浴搖床(上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；CKX41倒置相差顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)寶特公司)；流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD Biosciences公司)；電泳槽、電轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Rad公司)；化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(英國(guó)SYNGENE公司)。

1.2 方法

1.2.1PA及白藜蘆醇的配制 用0.1 mol·L-1的NaOH溶液，在70 ℃水浴中溶解一定量的PA，振蕩混勻10 min，過濾，配成100 mmol·L-1的PA儲(chǔ)存液。在55 ℃水浴中，用去離子水配制50 g·L-1的牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)溶液，過濾。將上述PA溶液和BSA溶液按1 ∶19的體積比混合，配成PA/BSA復(fù)合液，在水浴中振蕩10 s，繼續(xù)水浴10 min，取出后冷卻至室溫，過濾。然后，將上述復(fù)合液分別用DMEM培養(yǎng)基稀釋。白藜蘆醇則溶解于DMSO，使母液濃度達(dá)到100 mmol·L-1，使用前將其融于DMEM(含血清、雙抗)達(dá)到工作液濃度，渦旋混勻后使用。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng) 從液氮中取出H9c2心肌細(xì)胞，接種于含25 mmol·L-1的葡萄糖、10%胎牛血清、雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～48 h后更換培養(yǎng)液，直至細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到70%～80%時(shí)，用含有0.25% EDTA的胰酶輕輕吹打消化、傳代至所需培養(yǎng)皿中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.3實(shí)驗(yàn)分組 ① PA濃度梯度: control組(空白對(duì)照組加入同等體積的PBS)、PA(0.1、0.2、0.4、0.8 mmol·L-1)刺激24 h組，進(jìn)行MTT檢測(cè)。② PA時(shí)間梯度: control組(空白對(duì)照組加入同等體積的PBS)、PA(0.4 mmol·L-1)刺激0、12、24、48 h組，進(jìn)行MTT檢測(cè)。③ 白藜蘆醇作用實(shí)驗(yàn)：control組(空白對(duì)照組加入同等體積的PBS)；PA(0.4 mmol·L-1)組；白藜蘆醇(0、25、50、100 μmol·L-1)組，用含白藜蘆醇培養(yǎng)基預(yù)處理1 h后吸出培養(yǎng)基，再加入含PA+白藜蘆醇的培養(yǎng)基；白藜蘆醇100 μmol·L-1組，用含白藜蘆醇培養(yǎng)基預(yù)處理1 h后吸出培養(yǎng)基，再加入含PBS+白藜蘆醇的培養(yǎng)基，進(jìn)行MTT檢測(cè)。④白藜蘆醇作用機(jī)制實(shí)驗(yàn): control組、PA 0.4 mmol·L-1組、PA 0.4 mmol·L-1+白藜蘆醇100 μmol·L-1組(含白藜蘆醇培養(yǎng)基預(yù)處理1 h后吸出培養(yǎng)基，再加入含PA+白藜蘆醇的培養(yǎng)基)，進(jìn)行其他檢測(cè)。

1.2.4MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖 以每孔含1×106個(gè)細(xì)胞為標(biāo)準(zhǔn)，接種于96孔板中(設(shè)立6個(gè)復(fù)孔)，培養(yǎng)24 h后給藥，進(jìn)行孵育，每孔加入20 μL MTT(5 g·L-1，美國(guó)Sigma公司)，將96孔板放置CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h后，棄去上清液，并每孔加入DMSO 150 μL，用酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm處的各孔OD值。細(xì)胞活力=OD處理孔/OD陰性對(duì)照孔×100%。

1.2.5免疫熒光及流式檢測(cè)ROS H9c2細(xì)胞接種6孔板，當(dāng)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至70%～80%融合度，分組給藥后，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h，PBS反復(fù)沖洗后，一部分細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)加入10 mmol·L-1DHE，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min，PBS反復(fù)沖洗后，采用熒光顯微鏡進(jìn)行拍照，并用ImageJ 1.41軟件分析紅色熒光強(qiáng)度。另一部分細(xì)胞培養(yǎng)板，用胰酶消化制備成單細(xì)胞懸液，直接收集細(xì)胞。用0.5～1 mL冰冷PBS重懸細(xì)胞，用流式細(xì)胞檢測(cè)儀檢測(cè)ROS陽(yáng)性細(xì)胞所占的比率。免疫熒光檢測(cè)和流式細(xì)胞檢測(cè)均采用480～535 nm波長(zhǎng)激發(fā)，測(cè)定590～610 nm以上的發(fā)射，細(xì)胞應(yīng)可分成兩個(gè)亞群：ROS陰性細(xì)胞僅有很低的熒光強(qiáng)度，ROS陽(yáng)性細(xì)胞有較強(qiáng)的紅色熒光。

1.2.6氧化應(yīng)激相關(guān)生化指標(biāo)的檢測(cè) H9c2細(xì)胞接種6孔板，當(dāng)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至70%～80%融合度，分組給藥后，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h，PBS反復(fù)沖洗后，收集H9c2細(xì)胞，經(jīng)超聲破碎處理后，分別按照試劑盒說明測(cè)定MDA含量和SOD活性。

1.2.7免疫印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá) H9c2細(xì)胞放入5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，PBS洗去細(xì)胞雜質(zhì)，每個(gè)皿加入裂解液充分裂解細(xì)胞，細(xì)胞刮刀收集于離心管，離心后收集上清，用BCA試劑盒測(cè)定蛋白含量。蛋白定量后，取20 μL的蛋白樣品上樣于5%～15%的SDS-PAGE凝膠，電泳分離，冰浴下濕法轉(zhuǎn)移至PVDF膜2 h，用5%的脫脂奶粉室溫?fù)u床封閉1 h，加入對(duì)應(yīng)一抗4 ℃搖床孵育過夜。次日換為HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，用ECL化學(xué)發(fā)光顯影，然后凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)AMPKα、p-AMPKα、mTORC1、p-mTORC1、p70S6K、p-p70S6K、β-actin的表達(dá)水平，以及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3的表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 白藜蘆醇對(duì)高脂誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞增殖能力低下的影響體外培養(yǎng)H9c2心肌細(xì)胞，用含PA(0.1、0.2、0.4、0.8 mmol·L-1)的DMEM培養(yǎng)基刺激24 h。如Fig 1A所示，隨著PA濃度的增加，H9c2細(xì)胞存活率呈下降趨勢(shì)，PA濃度在0.4 mmol·L-1時(shí)，降低明顯(P<0.05)。Fig 1B結(jié)果顯示，含PA 0.4 mmol·L-1的DMEM培養(yǎng)基刺激細(xì)胞0、12、24、48 h后，H9c2心肌細(xì)胞隨著刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞數(shù)量明顯減少，在刺激細(xì)胞24 h時(shí)，細(xì)胞存活率開始明顯降低(P<0.05)。因此，我們將PA濃度定為0.4 mmol·L-1，刺激時(shí)間定為24 h開展下一步實(shí)驗(yàn)。如Fig 1C所示，當(dāng)0.4 mmol·L-1PA刺激24 h時(shí)，H9c2心肌細(xì)胞的增殖能力明顯降低，隨著白藜蘆醇濃度的升高，PA+白藜蘆醇組的細(xì)胞增殖率呈現(xiàn)濃度依賴性升高趨勢(shì)。提示白藜蘆醇對(duì)高脂誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞增殖率的損傷有明顯的改善作用，因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇白藜蘆醇濃度為100 μmol·L-1。

Fig 1 Viability of H9c2 cells treated with PA alone or combination of PA and resveratrol n=5)

A: Concentration-dependent cell damage induced by PA at 24 h stimulation time.*P<0.05,**P<0.01vs0 mmol·L-1group. B: Time-dependent cell damage induced by PA at 0.4 mmol·L-1concentration.*P<0.05,**P<0.01vs0 h group. C: Viability of cells treated with varied drugs (culture time: 24 h).*P<0.05vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsPA group.

2.2 白藜蘆醇對(duì)高脂誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平的影響如Fig 2、Fig 3A所示，0.4 mmol·L-1PA刺激24 h后，細(xì)胞內(nèi)ROS的紅色熒光強(qiáng)度及用流式細(xì)胞儀檢測(cè)的細(xì)胞內(nèi)ROS的水平均出現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)(P<0.05)，而預(yù)處理白藜蘆醇組可以明顯降低心肌細(xì)胞內(nèi)高脂誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生(P<0.05)。如Fig 3B、3C所示，0.4 mmol·L-1PA刺激24 h 后，細(xì)胞內(nèi)MDA的水平明顯升高(P<0.05)，而細(xì)胞內(nèi)SOD的水平明顯降低(P<0.05)；白藜蘆醇預(yù)處理組可以明顯降低心肌細(xì)胞內(nèi)高脂誘導(dǎo)的MDA產(chǎn)生(P<0.05)，并升高SOD水平。

Fig 2 Effect of resveratrol on PA-induced cardiomyocyte oxidative damage (scale bar: 50 μm)

Fig 3 Level of major biochemical parameters of H9c2 cells treated with PA alone or combination of PA and resveratrol for 24 h n=3)

A: The level of ROS was determined by flow cytometry; B: MDA levels in cells; C: SOD activity in cells.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsPA group.

2.3 白藜蘆醇對(duì)高脂誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞AMPK/mTORC1/p70S6K信號(hào)通路蛋白及凋亡蛋白表達(dá)的影響如Fig 4A所示，用含0.4 mmol·L-1PA的DMEM培養(yǎng)基刺激H9c2心肌細(xì)胞24 h時(shí)，p-AMPKα表達(dá)明顯下降(P<0.05)，而p-mTORC1、p-p70S6K蛋白表達(dá)明顯升高；預(yù)處理白藜蘆醇組可以明顯逆轉(zhuǎn)心肌細(xì)胞內(nèi)高脂誘導(dǎo)的p-AMPKα蛋白的降低以及p-mTORC1、p-p70S6K蛋白表達(dá)的升高(P<0.05)。如Fig 4B所示，用含0.4 mmol·L-1PA的DMEM培養(yǎng)基刺激H9c2心肌細(xì)胞24 h時(shí)，Bcl-2水平明顯下降(P<0.05)，而Bax、cleaved caspase-3表達(dá)均明顯升高(P<0.05)。而預(yù)處理白藜蘆醇組可以明顯逆轉(zhuǎn)心肌細(xì)胞內(nèi)高脂誘導(dǎo)的Bcl-2蛋白表達(dá)的降低以及Bax、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)的升高(P<0.05)。

3 討論

糖尿病性心肌病的危險(xiǎn)因素包括高糖化血紅蛋白、肥胖、老年、伴發(fā)冠心病、視網(wǎng)膜病變、蛋白尿和白蛋白尿、腎病、長(zhǎng)期使用胰島素治療以及糖尿病病程等。研究顯示，糖尿病患者的心衰發(fā)病率明顯高于對(duì)照組，心衰是僅次于外周血管病的第二大糖尿病心血管并發(fā)癥。糖尿病心肌病的病因復(fù)雜，隨著對(duì)糖尿病的深入研究，發(fā)現(xiàn)脂毒性是糖尿心肌病發(fā)病的重要原因之一[4]。當(dāng)機(jī)體營(yíng)養(yǎng)過剩時(shí)，脂肪細(xì)胞增大，且功能出現(xiàn)異常，對(duì)胰島素抗脂解作用減弱，導(dǎo)致游離脂肪酸增多;其次，增大的脂肪細(xì)胞降低了儲(chǔ)脂能力，一旦脂肪的量大于儲(chǔ)備能力時(shí)，多余的甘油三酯就會(huì)分流到肝臟、肌肉以及胰島細(xì)胞，從而引發(fā)外周胰島素抵抗和胰島素分泌功能障礙，這就是所謂的脂肪分存及脂毒性。脂毒性不僅影響肝臟、肌肉和胰島細(xì)胞，對(duì)機(jī)體其他的重要組織也有影響，其中對(duì)心臟功能的危害性最大。近年來發(fā)現(xiàn)，在血糖升高的胰島素抵抗階段，患者的心臟功能已經(jīng)受到損害。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，高游離脂肪酸血癥和高甘油三酯血癥可以導(dǎo)致心肌脂質(zhì)沉積、心室壁增厚、心室重構(gòu)、心臟收縮功能降低。本研究結(jié)果顯示，不同濃度的PA刺激心肌細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞存活率呈濃度梯度下降趨勢(shì)，符合文獻(xiàn)報(bào)道；而白藜蘆醇預(yù)處理可以明顯減輕高脂對(duì)心肌細(xì)胞存活率的影響。

脂毒性心肌病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，與多條信號(hào)通路相關(guān)，尤其是AMPK相關(guān)通路已成為近年來的研究熱點(diǎn)[5]。機(jī)體存在氧化-抗氧化的平衡機(jī)制，SOD作為體內(nèi)重要的抗氧化物酶亦釋放增多，用以清除體內(nèi)過度釋放的自由基，減少細(xì)胞膜的損傷。因此，MDA常被用于間接反映機(jī)體的氧化損傷，而SOD反映抗氧化能力?；诖耍覀儥z測(cè)了心肌細(xì)胞內(nèi)ROS的生成和MDA、SOD的水平，發(fā)現(xiàn)高脂刺激心肌細(xì)胞24 h后，心肌細(xì)胞內(nèi)ROS的含量及MDA含量均明顯升高，SOD活性明顯降低，而白藜蘆醇預(yù)處理可以明顯逆轉(zhuǎn)高脂誘導(dǎo)的上述指標(biāo)的變化。提示白藜蘆醇可以明顯抑制高脂誘發(fā)的細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激。

Fig 4 Effect of resveratrol on expression of AMPK/mTORC1/ p70S6K pathway-related proteins(A) and apoptosis-related proteins(B) in cardiomyocytes induced by PA n=3)

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsPA group

AMPK是重要的能量傳感器，有研究發(fā)現(xiàn)，在肥胖和2型糖尿病患者的骨骼肌組織中，AMPK活性和PGC-1α表達(dá)量明顯降低，而激活A(yù)MPK后，PGC-1α的表達(dá)量隨之增高，胰島素的敏感性也隨之增高[10]。因此，尋找AMPK的激活劑對(duì)慢性病的防治具有重要的意義。mTORC1是AMPK信號(hào)通路下游分子之一[11-12]，AMPK磷酸化被激活后，可通過抑制mTORC1的磷酸化來抑制心臟肥大，而心臟肥大是肥胖和高脂飲食導(dǎo)致心機(jī)重構(gòu)的重要特征之一[13]。反之，激活的mTORC1可通過S6K1激活SREBP1，從而加重心肌損傷[14-15]。p70S6K是S6K1的同源異構(gòu)體，也是mTORC1信號(hào)的下游特異性蛋白。由此認(rèn)為，AMPK磷酸化的抑制、mTORC1及p70S6K磷酸化的增強(qiáng)，可成為脂毒性心肌細(xì)胞損傷的機(jī)制之一。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)高脂刺激心肌細(xì)胞24 h后，心肌細(xì)胞內(nèi)p-AMPKα的表達(dá)明顯降低，p-mTORC1及p-p70S6K蛋白的表達(dá)明顯升高，而白藜蘆醇預(yù)處理可以明顯逆轉(zhuǎn)高脂所致的p-AMPKα蛋白的表達(dá)降低及p-mTORC1、p-p70S6K蛋白的表達(dá)升高。這些結(jié)果表明白藜蘆醇可以調(diào)控細(xì)胞內(nèi)AMPK/mTORC1/p70S6K信號(hào)通路，保護(hù)心肌細(xì)胞出現(xiàn)脂毒性損傷。

脂毒性造成的心肌損害增加心肌細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞活性降低，數(shù)量減少，最終導(dǎo)致心肌功能障礙。本研究數(shù)據(jù)顯示，PA刺激H9c2心肌細(xì)胞，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)降低明顯，而促凋亡蛋白Bax和cleaved caspase-3的表達(dá)明顯升高。提示PA可以導(dǎo)致心肌細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡現(xiàn)象，而白藜蘆醇預(yù)處理可以明顯逆轉(zhuǎn)高脂所致抗凋亡蛋白表達(dá)的降低和促凋亡蛋白表達(dá)的升高。

綜上所述，心肌細(xì)胞給予高脂刺激能夠抑制細(xì)胞的增殖，并且會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平的增加，調(diào)控心肌細(xì)胞內(nèi)AMPK通路，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。白藜蘆醇可以有效恢復(fù)細(xì)胞增殖率，降低氧化損傷，最終減少細(xì)胞凋亡，起到保護(hù)心肌細(xì)胞的作用，其分子機(jī)制與AMPK/mTORC1/p70S6K信號(hào)通路的調(diào)控密切相關(guān)。