范霞霞，蘇 楠，黃曉婧，李亞飛，賈 奧，樊濟(jì)配，王愛鳳,，趙寧民，馬永成,

(1. 鄭州大學(xué)人民醫(yī)院藥學(xué)部臨床藥理室，河南 鄭州 450003；2. 阜外華中心血管病醫(yī)院藥學(xué)部臨床藥理室，河南 鄭州 451464；3. 河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450011)

食管癌惡性程度高，臨床中多進(jìn)行手術(shù)、放化療等綜合治療手段，但由于其復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移特性，目前死亡率仍然較高。據(jù)《2017中國腫瘤登記年報》，全國范圍內(nèi)食管癌發(fā)病率及死亡率均居前五位。由此可見，研發(fā)新的高效、低毒的抗食管癌藥物仍然十分迫切。天然對映貝殼杉烷型二萜具有廣泛的生物活性，例如抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤等，是很有潛力的先導(dǎo)化合物[1]。以往的報道已表明該類化合物具有廣譜的體外抗腫瘤活性，但體內(nèi)活性研究多采用聯(lián)合用藥，以增加現(xiàn)有化療藥物的敏感性，缺乏直接的效果。因此，研究人員對該類天然二萜結(jié)構(gòu)做了大量的改造工作[2]，以期獲得活性更高、毒性更低、性質(zhì)更為穩(wěn)定的抗腫瘤候選藥物。本課題組以天然貝殼杉烷型二萜Jaridonin[3]為先導(dǎo)，利用“藥物拼合原理”引入了三氮唑活性結(jié)構(gòu)單元，得到了活性更好的衍生物Jar-TTA(結(jié)構(gòu)見Fig 1A)，其結(jié)構(gòu)新穎、性質(zhì)穩(wěn)定，且具有雙重抑制糖酵解/氧化磷酸化(oxidative phosphorylation，OXPHOS)的獨(dú)特功能，國內(nèi)外尚無任何相關(guān)報道，具有開發(fā)自主知識產(chǎn)權(quán)抗癌藥物的重要價值。

Fig 1 Effect of Jar-TTA on EC109 and

A: The molecular structural formula of Jar-TTA; B: Effect of Jar-TTA on cell proliferation. 5-Fuorouracil(5-FU) was used as positive control.**P<0.01vscontrol.1:0.00;2：0.75;3：1.50;4：3.00;5：6.00;6：12.00;7：24.00;8：5-FU 24.00

有氧糖酵解(Warburg效應(yīng))被認(rèn)為是腫瘤代謝的特征，該特征也為腫瘤藥物的開發(fā)提供了理想靶點(diǎn)，為腫瘤治療帶來希望[4]。然而，現(xiàn)代腫瘤研究已經(jīng)證明，腫瘤細(xì)胞的代謝呈現(xiàn)出明顯的異質(zhì)性及代謝靈活性，糖酵解并不是腫瘤細(xì)胞獲取能量的唯一方式[5]。當(dāng)糖酵解受到抑制時，腫瘤細(xì)胞可能會切換為氧化磷酸化的代謝模式為其供能，并且在高侵襲性腫瘤中以及腫瘤干細(xì)胞中，OXPHOS甚至發(fā)揮著主要作用[5-6]。因此，研發(fā)具有糖酵解/OXPHOS雙重抑制功能的藥物是更具潛力的抗腫瘤策略。本實(shí)驗則以食管癌細(xì)胞為模型，深入研究了Jar-TTA雙重抑制糖酵解/OXPHOS的作用及可能的分子機(jī)制，為新型抗腫瘤藥物的開發(fā)提供實(shí)驗依據(jù)。

1 材料

1.1 試劑四氮唑藍(lán)(MTT，美國Sigma公司)；糖酵解壓力檢測試劑盒、線粒體壓力檢測試劑盒，均購自美國Seahorse Bioscience公司；FITC-AnnexinⅤ/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(美國Biovision公司)；線粒體熒光染料JC-1和Hoechst 33258，購自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所；熒光葡萄糖類似物2-NBDG為Invitrogen品牌產(chǎn)品；GAPDH抗體(杭州賢至生物科技公司)；葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(glucose transporter type 4，GLUT4)、乳酸脫氫酶A(lactate dehydrogenase A ，LDHA)抗體，購自美國SAB公司；化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒(美國Pierce公司)；胎牛血清(FBS，杭州四季青公司)；RPMI 1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)。

1.2 化合物二萜衍生物Jar-TTA由鄭州大學(xué)新藥研發(fā)中心研制，結(jié)構(gòu)經(jīng)NMR、MS及IR光譜確證，純度不小于99%。使用DMSO溶解Jar-TTA，配制成24 mmol·L-1的儲備液，-20 ℃分裝保存。使用前，儲備液至少稀釋1 000倍，從而確保培養(yǎng)基中DMSO終含量不超過0.1%，以排除DMSO對細(xì)胞生長的影響。

1.3 儀器三氣細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher Scientific公司)；全波長多功能酶標(biāo)儀(美國Perkinelmer公司)；高速冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf公司)；正置熒光顯微鏡(日本Nikon公司)；生物能量分析儀Seahorse XFp(美國Seahorse Bioscience公司)；流式細(xì)胞儀(美國BD公司)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)人食管癌細(xì)胞株EC109和KYSE-150,購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫，由本實(shí)驗室傳代液氮保存。在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)條件下，使用含有10%胎牛血清、100 g·L-1鏈霉素和1×105kU·L-1青霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)上述細(xì)胞。

2.2 細(xì)胞生存率測定根據(jù)文獻(xiàn)所述方法[7]，接種EC109、KYSE-150細(xì)胞，培養(yǎng)貼壁后，加入終濃度為0.75、1.5、3、6、12、24 μmol·L-1的Jar-TTA，作用48 h，每孔加入20 μL MTT溶液(質(zhì)量終濃度為0.5 g·L-1)，培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4 h后終止培養(yǎng)，DMSO充分溶解紫色結(jié)晶物，使用酶標(biāo)儀于490 nm處測定吸光度，計算細(xì)胞生存率(survival rate)及IC50值。

2.3 線粒體膜電位觀察及定量分析細(xì)胞接種于6孔板，貼壁培養(yǎng)后，使用0、4、8 μmol·L-1的Jar-TTA分別作用細(xì)胞24 h，胰酶消化，EP管離心收集細(xì)胞。每管樣品加入100 μL JC-1 溶液(質(zhì)量濃度為10 mg·L-1)，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育20 min，預(yù)冷PBS洗滌2次，調(diào)整細(xì)胞濃度，吸取50～100 μL的待檢樣品滴至載玻片，加上蓋玻片后，熒光顯微鏡觀察并拍照。同時，相同培養(yǎng)條件下，Jar-TTA作用EC109細(xì)胞24 h后，離心收集細(xì)胞，每管樣品加入500 μL上述JC-1溶液，進(jìn)行同樣的染色處理后，通過流式細(xì)胞儀每個樣品收集10 000個有效細(xì)胞，使用Flow Jo軟件對線粒體膜電位變化進(jìn)行定量分析。

2.4 細(xì)胞凋亡檢測將EC109細(xì)胞接種于6孔板，貼壁培養(yǎng)后，0、2、4、8 μmol·L-1的Jar-TTA作用于細(xì)胞24 h，離心收集每孔中包括懸浮細(xì)胞在內(nèi)的所有細(xì)胞，按照凋亡檢測試劑盒說明書進(jìn)行細(xì)胞雙染，利用流式細(xì)胞儀每個樣品收集20 000個有效細(xì)胞，使用Flow Jo軟件分析凋亡情況。

2.5 能量代謝分析儀檢測Jar-TTA對細(xì)胞能量代謝的調(diào)控作用以每孔7 000個細(xì)胞的密度將EC109細(xì)胞接種到Seahorse XFp專用板，過夜培養(yǎng)，待細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期，分別以0、4、8 μmol·L-1Jar-TTA預(yù)孵育EC109細(xì)胞2 h后，更換能量分析專用培養(yǎng)液，按照糖酵解/線粒體壓力試劑盒說明書配制試劑，并實(shí)時檢測線粒體耗氧率(oxygen consumption rate，OCR)和代表糖酵解的胞外酸化率(extracellular acidification rate，ECAR)。并根據(jù)OCR和ECAR值，分別考察Jar-TTA對EC109細(xì)胞的基礎(chǔ)有氧呼吸(basal respiration)、最大有氧呼吸能力(maximal respiration)、ATP生成(ATP production)，以及糖酵解水平(glycolysis)、最大糖酵解能力(glycolytic capacity)的影響。其中，象征線粒體OXPHOS有關(guān)參數(shù)的計算公式如下：Basal respiration=(第1次注射藥物前的最后一個檢測值)-(非線粒體呼吸耗氧率)；Maximal Respiration=(FCCP注射后最大檢測值)-(非線粒體呼吸耗氧率)；ATP Pro-duction= (寡霉素注射前最后一個檢測值)-(寡霉素注射后最小檢測值)，具體示意圖參見Fig 3B。細(xì)胞糖酵解水平有關(guān)參數(shù)公式：Glycolysis=(寡霉素注射前最大檢測值)-(葡萄糖注射前最后一個檢測值)；Glycolytic Capacity=(寡霉素注射后最大的檢測值)-(葡萄糖注射前最后一個檢測值)，具體示意圖參見Fig 4B。檢測結(jié)束后，收集各孔細(xì)胞，利用細(xì)胞計數(shù)儀進(jìn)行絕對計數(shù)，以每孔10 000細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)化OCR和EACAR的測量值。

Fig 2 EC109 cell apoptosis induced by

2.6 2-NBDG法檢測葡萄糖攝取通過檢測2-NBDG熒光強(qiáng)度，評價Jar-TTA對食管癌細(xì)胞葡萄糖攝取的抑制作用。EC109細(xì)胞接種于6孔板，使用含10% FBS的常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞貼壁后，移除常規(guī)培養(yǎng)基，PBS漂洗1次后，使用含0.5% FBS及0、4、8 μmol·L-1Jar-TTA的培養(yǎng)基孵育EC109細(xì)胞6 h。小心移除上述培養(yǎng)基，加入100 μmol·L-12-NBDG(使用含0.5% FBS培養(yǎng)基稀釋所得)，繼續(xù)培養(yǎng)30 min。胰酶消化，離心收集細(xì)胞，置于冰上，使用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，以去除未被細(xì)胞攝取的2-NBDG，將收集的細(xì)胞懸浮在冷PBS中，通過流式細(xì)胞術(shù)(488 nm激發(fā)，F(xiàn)L1)定量分析各組平均熒光強(qiáng)度。

2.7 Western blot不同濃度的Jar-TTA處理EC109細(xì)胞24 h后，將細(xì)胞全部離心收集，使用RIPA裂解液裂解細(xì)胞，低溫離心，吸取上清則為總蛋白，蛋白濃度由BCA法測定。取60～100 μg總蛋白上樣，經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后，濕法電轉(zhuǎn)蛋白至硝酸纖維素膜(NC)上，利用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，然后一抗室溫孵育2 h或4 ℃孵育過夜后，辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗室溫下孵育2 h，ECL試劑進(jìn)行化學(xué)發(fā)光。膠片于暗室曝光后，掃描并保存結(jié)果。

3 結(jié)果

3.1 Jar-TTA抑制EC109及KYSE-150細(xì)胞的生存不同濃度的Jar-TTA處理食管癌細(xì)胞EC109及KYSE-150 48 h后，MTT實(shí)驗結(jié)果顯示，Jar-TTA明顯抑制了2種食管癌細(xì)胞的生長，且具有濃度依賴性(Fig 1B)，IC50值分別為(2.61±0.32) μmol·L-1和(4.65±0.55) μmol·L-1。由于EC109對Jar-TTA相對較為敏感，下述實(shí)驗皆以EC109為細(xì)胞模型做進(jìn)一步研究。

3.2 Jar-TTA誘導(dǎo)EC109凋亡不同濃度Jar-TTA作用EC109細(xì)胞24 h后，流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，Jar-TTA可明顯誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生(Fig 2A)。Jar-TTA(2、4、8 μmol·L-1)誘導(dǎo)EC109早期凋亡率分別為(27.9±6.1)%、(71.1±9.3)%和(65.0±9.5)%，與正常對照組(5.6±3.2)%相比差異有顯著性(P<0.01)；另外，晚期凋亡率分別為(6.9±2.5)%、(8.4±3.4)%和(29.8±4.5)%，與對照組晚期凋亡率(0.6±0.3)%相比，差異亦具有顯著性(Fig 2B)。使用Jar-TTA在同樣的處理條件下，可見細(xì)胞凋亡形態(tài)上的變化，染色質(zhì)濃縮、碎裂，凋亡小體形成等典型凋亡狀態(tài)(Fig 2C)，表明Jar-TTA具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用。

3.3 Jar-TTA雙重抑制EC109細(xì)胞糖酵解及線粒體氧化磷酸化ECAR和OCR分別代表了細(xì)胞的糖酵解水平和氧化磷酸化活性[8]。如Fig 3A所示，4、8 μmol·L-1Jar-TTA預(yù)處理EC109 2 h，明顯抑制線粒體的氧化磷酸化功能，并且相對于正常細(xì)胞，Jar-TTA預(yù)處理細(xì)胞基礎(chǔ)氧耗率、最大呼吸和ATP產(chǎn)生量均明顯降低(P<0.01，F(xiàn)ig 3C、3D)。另外，4、8 μmol·L-1Jar-TTA預(yù)孵育EC109細(xì)胞2 h，亦可明顯抑制細(xì)胞糖酵解過程(Fig 4A)；如Fig 4C、4D所示，相較于對細(xì)胞基礎(chǔ)糖酵解水平的抑制，Jar-TTA更為強(qiáng)烈地抑制了EC109細(xì)胞的最大糖酵解能力，差異均具有顯著性(P<0.01)。上述結(jié)果表明，Jar-TTA具有細(xì)胞糖酵解及線粒體氧化磷酸化的雙重抑制作用。

Fig 4 Effect of Jar-AAT in regulating glycolysis of EC109

A: EC109 cells were treated with Jar-AAT at indicated concentrations for 2 h and the dynamics of ECAR were measured; B: Schematic diagram of indexes in overall ECAR curve; C: Basal glycolytic rate of control and Jar-AAT pre-treated cells; D: Cellular glycolytic capacity in EC109 cells with or without Jar-AAT treatment. Glu: glucose; OM: oligomycin; 2-DG: 2-deoxy-D-glucose.*P<0.05,**P<0.01vscontrol

3.4 Jar-TTA降低EC109線粒體膜電位熒光探針JC-1在較高線粒體電位下呈現(xiàn)強(qiáng)的橙色熒光；在線粒體膜電位較低情況下，JC-1則呈現(xiàn)綠色熒光[7]。如Fig 5A所示，相對于正常細(xì)胞，4 μmol·L-1的Jar-TTA作用EC109細(xì)胞24 h后，橙色熒光相對減弱，并顯示了一定量的綠色熒光，提示線粒體膜電位有所下降；8 μmol·L-1Jar-TTA作用EC109細(xì)胞24 h后，橙色熒光幾乎完全消失，線粒體呈現(xiàn)強(qiáng)的綠色熒光，證明此時線粒體膜電位已崩潰喪失。另外，流式細(xì)胞術(shù)定量分析發(fā)現(xiàn)，4、8 μmol·L-1的Jar-TTA作用下，低線粒體膜電位的細(xì)胞比例分別為32.9%和59.1%，與對照組5.0%相比，線粒體膜電位下降的細(xì)胞數(shù)明顯增多(Fig 5B)。這些結(jié)果表明Jar-TTA可以致使線粒體膜電位下降，從而誘導(dǎo)細(xì)胞線粒體功能損傷，Jar-TTA抑制線粒體氧化磷酸化的作用可能與此有關(guān)。

3.5 Jar-TTA抑制EC109細(xì)胞的葡萄糖攝取如Fig 6A所示，與正常對照組相比，4、8 μmol·L-1Jar-TTA作用細(xì)胞6 h，熒光強(qiáng)度明顯左偏，表明Jar-TTA可抑制EC109葡萄糖攝取，且其作用與濃度有關(guān)。與空白對照組相比，4、8 μmol·L-1Jar-TTA使EC109細(xì)胞的葡萄糖攝取能力分別下降約(45.4±12.8)%和(60.5±9.32)%(P<0.01)，見Fig 6B。上述結(jié)果提示，Jar-TTA的糖酵解抑制作用和其阻止葡萄糖攝取有關(guān)。

3.6 Jar-TTA下調(diào)糖酵解相關(guān)蛋白Fig 7的Western blot檢測顯示，與對照組相比，不同濃度的Jar-TTA作用EC109 24 h后，GLUT4及LDHA蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，且呈濃度依賴性。該結(jié)果表明，Jar-TTA通過下調(diào)GLUT4和LDHA蛋白，阻滯了EC109細(xì)胞的葡萄糖攝取水平以及抑制了糖酵解進(jìn)程。

Fig 5 Mitochondriotoxic effects of Jar-AAT in EC109

A: JC-1 fluorescent staining, the drop of MMP in EC109 treated with Jar-AAT at indicated concentrations for 24 h was observed by fluorescence microscopy(×200); B: Representative flow cytometry pictures of EC109 cells treated by 0, 4 and 8 μmol·L-1Jar-TTA for 24 h and the percentages of cells with low MMP were given.

4 討論

哺乳動物細(xì)胞可通過線粒體OXPHOS和糖酵解兩種糖代謝方式供應(yīng)能量ATP。常氧情況下，正常細(xì)胞糖代謝主要由線粒體OXPHOS產(chǎn)生ATP以提供代謝活動所需要的能量，但與正常細(xì)胞不同，即使在有氧情況下，腫瘤細(xì)胞依舊異?；钴S地攝取葡萄糖，進(jìn)行有氧糖酵解(Warburg效應(yīng))[9]。長期以來，人們基于腫瘤細(xì)胞特有的Warburg效應(yīng)不僅開發(fā)了系列抗腫瘤新化合物，也摸索了多套腫瘤化療方案，但所得結(jié)果不盡相同，喜憂參半[10]。究其原因是因為腫瘤代謝呈異質(zhì)性，不同腫瘤之間存在明顯的代謝差異；即使同一腫瘤的不同細(xì)胞之間，也存在明顯代謝差異。雖然Warburg效應(yīng)在腫瘤細(xì)胞中表現(xiàn)明顯，但線粒體的OXPHOS仍對腫瘤細(xì)胞生存起著重要的調(diào)節(jié)作用，甚至在某些腫瘤中，OXPHOS是主要的供能方式，該類腫瘤細(xì)胞則對有氧糖酵解抑制劑并不敏感[11-12]。

近幾年，由多個科研團(tuán)隊將糖酵解抑制劑(如2-deoxy-D-glucose)和OXPHOS抑制劑(如線粒體靶向藥物Mito-Q或小檗堿)聯(lián)用，進(jìn)行腫瘤化療取得了滿意的效果[13-14]。就單個藥物同時抑制腫瘤細(xì)胞糖酵解和OXPHOS的研究也有報道，Marín-Hernández等[15]研究發(fā)現(xiàn)，5 μmol·L-1銅配位化合物(Casiopeina Ⅱ-gly)作用HeLa細(xì)胞24 h后，同時抑制了糖酵解(抑制率為40%)和OXPHOS(抑制率為80%)，展現(xiàn)了良好的抗腫瘤活性，并具有較好的腫瘤選擇性。Zhao等[16]研究也發(fā)現(xiàn)，維生素E衍生物ESeroS-GS可通過下調(diào)HK2及具有電子傳遞功能的complex Ⅱ/Ⅲ/Ⅳ等的表達(dá)，以及降低線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)，同時抑制了乳腺癌細(xì)胞糖酵解和OXPHOS，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，而對人正常乳腺上皮細(xì)胞不產(chǎn)生相應(yīng)毒性。本研究也證實(shí)，Jar-TTA可通過雙重抑制糖酵解和OXPHOS，誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞凋亡。并且Jar-TTA抑制EC109基礎(chǔ)呼吸、最大呼吸以及ATP的生成，可能與Jar-TTA降低MMP有關(guān)。除誘導(dǎo)MMP下降之外，Jar-TTA是否對線粒體中具有電子傳遞功能的complex Ⅱ/Ⅲ/Ⅳ也有調(diào)控作用則需要進(jìn)一步研究。

此外，很多研究已經(jīng)證實(shí)，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體(glucose transporters，GLUTs)在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，有效阻止其表達(dá)可以從源頭阻斷原料供應(yīng)，從而可作為研發(fā)糖酵解抑制劑的切入點(diǎn)[17]。另外，在糖酵解過程中，乳酸脫氫酶A(lactic dehydrogenase A，LDHA)是催化丙酮酸和乳酸相互轉(zhuǎn)化的同工酶，在癌細(xì)胞中亦高表達(dá)，這使得腫瘤細(xì)胞能夠不受氧氣限制，將大多數(shù)的葡萄糖轉(zhuǎn)變?yōu)槿樗?，加速?xì)胞生長和增殖。目前通過抑制LDH-A活性來治療腫瘤已成為最具吸引力的研究方向[18]。本研究證明，Jar-TTA可明顯下調(diào)GLUT4和LDHA蛋白的表達(dá)，其很可能是Jar-TTA抑制EC109糖攝取、基礎(chǔ)糖酵解水平及最大糖酵解能力的根本原因。

Fig 6 Glucose uptake inhibited by

A: Representative flow cytometry pictures of the 2-NBDG uptake in EC109 cells treated by Jar-TTA at indicated concentrations for 6 h; B: Alteration of mean 2-NBDG fluorescence in EC109.**P<0.01vscontrol.

總之，Jar-TTA已然是一個具有糖酵解/OXPHOS雙重抑制功能的新的抗腫瘤候選化合物。本文的系統(tǒng)研究有望為設(shè)計合成活性更高、毒性更低、作用機(jī)制更為獨(dú)特的新型二萜衍生物提供實(shí)驗依據(jù)和理論支持。

Fig 7 GLUT4 and LDHA levels in

**P<0.01vscontrol

(致謝：本實(shí)驗主要在阜外華中心血管病醫(yī)院藥學(xué)部藥學(xué)研究實(shí)驗室完成，在此感謝鄭州大學(xué)藥學(xué)院可鈺教授給予的無私幫助，感謝鄭州中譜儀器設(shè)備有限公司提供生物能量分析儀Seahorse XFp及相關(guān)技術(shù)支持。)