辛俊勃，李 芳,*，李若菡，張 冉，潘富榮，明 欣

(1江蘇醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院藥學(xué)院，鹽城 224005；2維克森林大學(xué)醫(yī)學(xué)院腫瘤生物學(xué)部，美國溫斯頓塞勒姆 27157)

光動力學(xué)治療(photodynamic therapy,PDT)是通過空間選擇性光照實(shí)施腫瘤治療的特殊方法。將光療劑輸送至腫瘤細(xì)胞，再在腫瘤部位給予合適波長的光進(jìn)行照射從而引發(fā)光化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生活性氧(ROS)或單線態(tài)氧(1O2)，繼而產(chǎn)生光毒性通過細(xì)胞凋亡或壞死途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡[1]。但是，PDT因其自身的一些缺陷在腫瘤治療中并未得到充分應(yīng)用，如由于光的穿透力不強(qiáng)難以用于深部組織的實(shí)體瘤以及轉(zhuǎn)移性腫瘤，由于光療劑溶解度低、腫瘤攝取差等特性[2]導(dǎo)致治療效果不理想。

將疏水性的光療劑包載于納米載體如脂質(zhì)體[3]、聚合物納米粒[4]、蛋白納米粒[5]等，能夠增強(qiáng)光療劑的穩(wěn)定性并提高其腫瘤分布，是克服傳統(tǒng)PDT局限性的一個(gè)有效策略。不僅如此，利用溫度響應(yīng)[6]、ROS觸發(fā)[7]或者酸活化[8]等功能性的納米材料還可以提高PDT的腫瘤特異性。但是，基于納米粒的傳遞系統(tǒng)往往粒徑較大難以穿透到達(dá)實(shí)體瘤深處[9]，故而藥物傳遞效果不好。有研究報(bào)道[10]，納米粒粒徑小于20 nm時(shí)腫瘤穿透性能較好，且有助于腫瘤深處單線態(tài)氧的生成。此外，許多納米載體的安全性尚未得到臨床證實(shí)，故而臨床應(yīng)用前景不佳。納米載體的潛在毒性與其組成、理化性質(zhì)密切相關(guān)，因此，為了臨床需要亟需選擇安全性能優(yōu)良的材料。聚乙二醇(PEG)是美國FDA批準(zhǔn)的聚合物，對人體無害[11]。多臂聚乙二醇的載藥能力優(yōu)于線型聚乙二醇，且能夠通過同時(shí)連接多個(gè)基團(tuán)而實(shí)現(xiàn)多功能化，目前在組織工程[12]與藥物傳遞[13]等領(lǐng)域均有應(yīng)用。

主動靶向基團(tuán)修飾也可以增強(qiáng)PDT的腫瘤靶向性。整合素因其在許多腫瘤細(xì)胞表面過表達(dá)以及在跨膜細(xì)胞黏附與信號傳導(dǎo)中的重要作用而成為抗腫瘤藥物傳遞的主要靶點(diǎn)之一，且RGD序列能夠與近半數(shù)的整合素受體特異性結(jié)合。本研究以八臂聚乙二醇(8PEG)為載體、cRGD為靶頭、水溶性的IRDye700DX(IR700)為光療劑，構(gòu)建了腫瘤靶向的聚乙二醇納米結(jié)合物，并對其細(xì)胞攝取、細(xì)胞毒作用、光活化作用、腫瘤球穿透性等進(jìn)行全面考察，為其應(yīng)用于臨床靶向PDT提供科學(xué)數(shù)據(jù)。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

H-Glu(cyclo(Arg-Gly-Asp-D-Tyr-Lys))2(美國Peptides International有限公司)；4-馬來酰亞胺基丁酸-N-琥珀酰亞胺酯(GMBS，美國Thermo Fisher Scientific公司)；IRDye700DX-Mal(IR700-Mal，美國LI-COR生物科學(xué)公司)；8-arm-PEG-OPSS(8PEG-OPSS，美國Creative PEGWorks公司)；二硫蘇糖醇(DTT，美國Sigma-Aldrich公司)；DMEM培養(yǎng)基、青霉素+鏈霉素雙抗、胎牛血清和胰酶(美國Gibco公司)；Hoechst 33342(美國Life Technologies公司)；InvitrogenTMAlamar Blue細(xì)胞活性試劑盒、Calcein AM/PI雙染試劑盒、活性氧熒光探針CM-H2DCFDA、Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司)。

1.2 儀 器

MS104TS電子天平(瑞士Mettler Toledo公司)；HERA Cell VIOS 160i細(xì)胞培養(yǎng)箱、Sorvall ST 8R離心機(jī)(美國Thermo Scientific公司)；ZetasizerNano ZS90激光粒度測定儀(英國Malvern Instruments公司)；Cytation 5細(xì)胞成像微孔板檢測系統(tǒng)(美國BioTek公司)；FV1200激光共聚焦顯微鏡、IX83倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；FACS Canto Ⅱ流式細(xì)胞儀(美國BD公司)。

1.3 細(xì)胞株

人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U87MG細(xì)胞株與NIH/3T3小鼠胚胎成纖維細(xì)胞系購自美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心(ATCC)。

2 方 法

2.1 cRGD-8PEG-IR700的合成[14]

cRGD-8PEG-IR700納米結(jié)合物的合成工藝如圖1所示。按照cRGD/GMBS物質(zhì)的量比1∶3稱取H-Glu(cyclo(Arg-Gly-Asp-D-Tyr-Lys))2與GMBS，將兩者溶解于pH7.2的磷酸鹽緩沖液，室溫反應(yīng)30 min，將制得的產(chǎn)物用半制備高效液相色譜儀純化，即得cRGD-Mal。

稱取適量的8PEG-OPSS溶于pH7.2的磷酸鹽緩沖液，繼而加入50 mmol/L的DTT溶液，室溫反應(yīng)1 h后，用ZebaTM脫鹽柱(截留相對分子質(zhì)量40 000)純化即得8PEG-SH。按照8PEG/cRGD/IR700物質(zhì)的量比1∶8∶4投入8PEG-SH、cRGD-Mal與IR700-Mal，室溫反應(yīng)2 h，終產(chǎn)物用ZebaTM脫鹽柱(截留相對分子質(zhì)量40 000)純化即得cRGD-8PEG-IR700。以8PEG-SH與IR700-Mal反應(yīng)所得的產(chǎn)物8PEG-IR700為對照。用紫外可見分光光度法測定產(chǎn)物，結(jié)果表明，每個(gè)8PEG分子上約共價(jià)連接3個(gè)IR700與5個(gè)cRGD分子。

Figure1 Synthesis of cRGD-8PEG-IR700 nanoconjugates

2.2 cRGD-8PEG-IR700的表征

用紫外可見分光光度法測定IR700、8PEG-IR700與cRGD-8PEG-IR700的濃度，以PBS稀釋使各制劑的IR700濃度一致，繼而在230～800 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，以PBS與8PEG為對照。另取適量cRGD-8PEG-IR700納米結(jié)合物用動態(tài)光散射法測定粒徑。

2.3 cRGD-8PEG-IR700的細(xì)胞攝取

取對數(shù)生長期的人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U87MG細(xì)胞，胰酶消化3 min后用DMEM培養(yǎng)基中和，取細(xì)胞懸液以1 000 r/min低速離心3 min，棄去上清液，用DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。以每皿1×105個(gè)細(xì)胞的密度將U87MG細(xì)胞接種于激光共聚焦皿中，待細(xì)胞貼壁后，分別向各皿中加入200 nmol/L(以IR700計(jì))的IR700、8PEG-IR700、cRGD-8PEG-IR700和10 μmol/L RGD+cRGD-8PEG-IR700溶液，孵育過夜后，吸除藥液換以新鮮培養(yǎng)基，用Hoechst 33342染核，繼而用激光共聚焦顯微鏡拍照。以NIH/3T3細(xì)胞為對照。

2.4 cRGD-8PEG-IR700的細(xì)胞毒作用

以每孔8×103個(gè)細(xì)胞的密度將U87MG細(xì)胞接種于96孔板中，待細(xì)胞貼壁后，分別給予系列濃度為0.457～333.3 nmol/L的IR700、8PEG-IR700與cRGD-8PEG-IR700(以IR700計(jì))溶液100 μL，孵育過夜后，吸除藥液，補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基，然后用660 nm的LED燈照射20 min(3.5 mW/cm2)，繼續(xù)培養(yǎng)12 h后，移除孔中培養(yǎng)基，換以Alamar Blue試液100 μL，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1 h后吸出Alamar Blue試液，分別以560 nm與590 nm為激發(fā)與發(fā)射波長測定熒光強(qiáng)度。以未給藥的U87MG細(xì)胞為空白對照，計(jì)算各給藥濃度細(xì)胞的存活率。另取NIH/3T3細(xì)胞作對照，操作方法均同U87MG細(xì)胞。

Calcein AM是一種能夠熒光標(biāo)記活細(xì)胞的染色試劑，而PI僅能標(biāo)記死細(xì)胞，通過Calcein AM/PI雙染細(xì)胞能夠更直觀地觀測各制劑的細(xì)胞毒作用。將U87MG細(xì)胞接種于24孔板中，孵育過夜，分別向各孔中加入200 nmol/L的IR700、8PEG-IR700與cRGD-8PEG-IR700(以IR700計(jì))溶液，孵育12 h后，移除藥液，換以新鮮培養(yǎng)基，并光照20 min。繼續(xù)培養(yǎng)12 h后，用Calcein AM/PI雙染細(xì)胞并置于Cytation5細(xì)胞成像微孔板檢測系統(tǒng)拍照。以給藥但未光照的細(xì)胞為對照。

2.5 cRGD-8PEG-IR700的細(xì)胞光活化作用

將U87MG細(xì)胞按每孔2×104個(gè)細(xì)胞的密度接種于8孔玻璃底共聚焦皿中，孵育過夜后，分別向各孔中加入200 nmol/L的IR700、8PEG-IR700與cRGD-8PEG-IR700溶液并孵育12 h，繼而向各孔中加入10 μmol/L的CM-H2DCFDA，置于培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育30 min，用LED燈照射20 min，再置于倒置熒光顯微鏡下拍照。以平行處理但未光照的細(xì)胞為對照。

2.6 cRGD-8PEG-IR700的細(xì)胞凋亡測定

按每孔1×105個(gè)細(xì)胞的密度將U87MG細(xì)胞接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁后，分別向各孔中加入200 nmol/L的cRGD-8PEG-IR700溶液，孵育過夜后，用新鮮培養(yǎng)基置換藥液，繼而用LED燈照射20 min，分別于光照后6 h與24 h以胰酶消化細(xì)胞，按照凋亡檢測試劑盒的操作規(guī)程用Annexin V-FITC與PI對細(xì)胞進(jìn)行染色，再用流式細(xì)胞儀進(jìn)行測定。

2.7 cRGD-8PEG-IR700對3D腫瘤球的光毒性作用與穿透性能考察

為了考察各IR700制劑對腫瘤球的細(xì)胞毒作用，構(gòu)建了U87MG細(xì)胞3D腫瘤球模型。按每孔1×104個(gè)細(xì)胞的密度將U87MG細(xì)胞接種于96孔圓底細(xì)胞培養(yǎng)板中，按文獻(xiàn)方法[15]待腫瘤球長成后，分別向各孔中加入400 nmol/L的IR700、8PEG-IR700與cRGD-8PEG-IR700溶液，孵育過夜后，移除藥液并換以新鮮培養(yǎng)基，光照20 min后，置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)過夜，用Calcein AM/PI雙染細(xì)胞并置于Cytation5細(xì)胞成像微孔板檢測系統(tǒng)拍照。以未光照處理的腫瘤球?yàn)閷φ铡?/p>

同上方法培養(yǎng)U87MG腫瘤球，分別給予400 nmol/L的IR700、8PEG-IR700與cRGD-8PEG-IR700溶液，孵育過夜后，移除藥液并換以新鮮培養(yǎng)基，用Cytation5細(xì)胞成像微孔板檢測系統(tǒng)拍照，并計(jì)作第0天。將腫瘤球置于660 nm的LED燈下照射20 min，在接下來的2周內(nèi)每天觀察腫瘤球形態(tài)并拍照。測量腫瘤球的長度a與寬度b，按照V=a×b2/2計(jì)算腫瘤球的體積，并繪制腫瘤球生長曲線。

以市售阿霉素脂質(zhì)體Doxil?(粒徑為80～85 nm)為對照，考察cRGD-8PEG-IR700的腫瘤穿透性能。分別給予U87MG腫瘤球40 μg/mL的Doxil與400 nmol/L的cRGD-8PEG-IR700，孵育6 h后，用空白培養(yǎng)基漂洗3次，再用FV1200激光共聚焦顯微鏡觀察拍照。

3 結(jié)果與討論

3.1 cRGD-8PEG-IR700的表征

cRGD-8PEG-IR700納米結(jié)合物在230～800 nm波長范圍內(nèi)掃描得到的光譜圖見圖2-A，PBS與8PEG在考察波長范圍內(nèi)均無吸收，而IR700在261，348，620與689 nm處出現(xiàn)4個(gè)吸收峰。8PEG-IR700與cRGD-8PEG-IR700在689 nm處均出現(xiàn)了IR700的特征吸收峰，且IR700位于261 nm的吸收峰長移至268 nm，表明IR700已經(jīng)成功連接到8PEG上。另外，cRGD-8PEG-IR700在348 nm與620 nm兩個(gè)吸收峰的強(qiáng)度均較IR700與8PEG-IR700有明顯增強(qiáng)，表明cRGD也成功連接到8PEG上。制得納米結(jié)合物的粒徑分布如圖2-B所示，結(jié)果表明，cRGD-8PEG-IR700納米結(jié)合物的粒徑為(7.60±0.081) nm，PDI為0.190±0.017。

3.2 cRGD-8PEG-IR700的細(xì)胞攝取

分別選取整合素受體高表達(dá)的U87MG細(xì)胞與整合素受體不表達(dá)的NIH/3T3細(xì)胞為模型，考察各IR700制劑的細(xì)胞攝取行為。如圖3-A所示，細(xì)胞核被Hoechst 33342染成藍(lán)色，照片中未見IR700的紅色熒光信號，表明IR700、8PEG-IR700與cRGD-8PEG-IR700在NIH/3T3細(xì)胞的攝取均較少。在U87MG細(xì)胞中(圖3-B)，僅cRGD-8PEG-IR700處理組出現(xiàn)強(qiáng)烈的紅色熒光信號，表明IR700與8PEG-IR700在U87MG細(xì)胞的攝取亦較少。而cRGD-8PEG-IR700能夠被U87MG細(xì)胞高效攝取，且該攝取行為能夠被游離RGD抑制，該結(jié)果證實(shí)整合素介導(dǎo)的內(nèi)吞作用是cRGD-8PEG-IR700細(xì)胞攝取的主要途徑。

Figure2 Characterization of cRGD-8PEG-IR700 nanoconjugates

A：UV-Vis scanning spectra；B：Particle size distribution

Figure3 Cellular uptake of IR700,8PEG-IR700 and cRGD-8PEG-IR700

A：NIH/3T3 cells；B：U87MG cells

3.3 cRGD-8PEG-IR700的細(xì)胞毒作用

Alamar Blue法測定IR700、8PEG-IR700和cRGD-8PEG-IR700對NIH/3T3細(xì)胞與U87MG細(xì)胞的光毒性結(jié)果如圖4所示。在考察濃度范圍內(nèi)，各IR700制劑均未對NIH/3T3細(xì)胞造成毒性作用(圖4-A)，IR700與8PEG-IR700也未對U87MG細(xì)胞造成毒性作用，而cRGD-8PEG-IR700光照組的U87MG細(xì)胞卻表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒作用，且呈劑量依賴性(圖4-B)。

Calcein AM/PI染色能夠直觀地區(qū)分活細(xì)胞與死細(xì)胞，其中活細(xì)胞被Calcein AM染成綠色，死細(xì)胞則被PI染成紅色。如圖5所示，未光照組的細(xì)胞均僅呈現(xiàn)活細(xì)胞的綠色熒光信號，而光照組僅有cRGD-8PEG-IR700處理的細(xì)胞出現(xiàn)強(qiáng)烈的紅色熒光信號，該結(jié)果與Alamar Blue法測得的數(shù)據(jù)相符。

3.4 cRGD-8PEG-IR700的細(xì)胞光活化作用

CM-H2DCFDA為活性氧族的細(xì)胞滲透性指示劑，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)發(fā)生氧化反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)的酯酶將其醋酸基團(tuán)去除之后，該指示劑便會發(fā)出熒光。如圖6所示，未經(jīng)光照處理的細(xì)胞均未出現(xiàn)綠色熒光信號，而光照的細(xì)胞中僅有cRGD-8PEG-IR700組出現(xiàn)了強(qiáng)烈的綠色熒光信號，表明cRGD-8PEG-IR700處理的細(xì)胞在光照后產(chǎn)生毒性作用與細(xì)胞內(nèi)ROS的生成有關(guān)。

Figure5 Calcein AM/PI staining images of U87MG cells with/without light irradiation

Figure6 Intracellular ROS generation in U87MG cells

3.5 cRGD-8PEG-IR700的細(xì)胞凋亡測定

通過Annexin V-FITC/PI染色研究cRGD-8PEG-IR700介導(dǎo)的光照殺滅細(xì)胞的死亡途徑。如圖7所示，以未光照的細(xì)胞為對照，光照6 h與24 h后，活細(xì)胞(左下象限)的比例由98.4%分別減少至3.12%與1.28%，早期凋亡細(xì)胞(右下象限)的比例由1.37%分別上升至81.1%與41.6%，而晚期凋亡細(xì)胞(右上象限)的比例由0.15%分別上升至15.7%與57.0%。表明，凋亡是cRGD-8PEG-IR700光照引起細(xì)胞死亡的主要途徑。

3.6 cRGD-8PEG-IR700對3D腫瘤球的光毒性作用與穿透性能考察

由于腫瘤球的細(xì)胞分化模式與體內(nèi)相似[16]，因此，3D腫瘤球模型在藥物傳遞[17]、藥物[18]與毒物[19]篩選等領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛。各IR700制劑對U87MG腫瘤球的細(xì)胞毒作用如圖8所示，在避光條件下，各組的腫瘤球均未見紅色死亡信號，而光照組僅有cRGD-8PEG-IR700處理的腫瘤球出現(xiàn)強(qiáng)烈的紅色熒光信號，另外兩組腫瘤球也未見死亡信號，該發(fā)現(xiàn)與2D細(xì)胞模型的結(jié)果一致。

分別給予U87MG腫瘤球IR700、8PEG-IR700與cRGD-8PEG-IR700，經(jīng)光照或避光處理后腫瘤球的體積變化如圖9所示。由圖9-A可見，除cRGD-8PEG-IR700光照組的腫瘤球體積有明顯減小外，其余各組的腫瘤球均隨著時(shí)間的延長而逐漸長大。腫瘤球生長曲線如圖9-B所示，除cRGD-8PEG-IR700光照組的腫瘤球體積與其他各組存在極顯著性差異(P<0.01)外，其余各組間均無顯著性差異。

Figure7 Flow cytometry analysis of apoptosis in U87MG cells induced by cRGD-8PEG-IR700 mediated PDT

Figure8 Calcein AM/PI staining images of U87MG spheroids with/without light irradiation

Figure9 Growth (A) and growth curves (B) of U87MG spheroids after treated with IR700 preparations with/without light irradiation (n=5,**P<0.01)

藥物分子能否滲透到腫瘤的核心是決定腫瘤治療效果的關(guān)鍵因素，3D腫瘤球也是研究腫瘤穿透性能的良好模型。如圖10所示，與U87MG腫瘤球共孵育6 h后，Doxil僅分布在腫瘤球的表面，而cRGD-8PEG-IR700納米結(jié)合物能夠穿透至腫瘤深層，這也是其發(fā)揮優(yōu)良抗腫瘤效果的原因。

Figure10 Penetration of cRGD-8PEG-IR700 nanoconjugates in U87MG spheroids

多臂聚乙二醇已廣泛用于藥物傳遞，如四臂聚乙二醇[20-21]、六臂聚乙二醇[22]等被用于水凝膠、膠束、納米粒等聚合物遞送系統(tǒng)，但作為單分子藥物載體還鮮有報(bào)道。本研究選用8PEG作單分子載體將藥物靶向傳遞至腫瘤，結(jié)果表明該遞藥系統(tǒng)具有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)該納米結(jié)合物粒徑小，在3D腫瘤球模型上穿透性更好，抗腫瘤效果更優(yōu)。還可以通過改變聚合物的相對分子質(zhì)量來靈活調(diào)節(jié)納米結(jié)合物的粒徑，從而控制結(jié)合物的循環(huán)半衰期，并優(yōu)化藥物的體內(nèi)藥代動力學(xué)行為。(2)8PEG為多功能的載體材料，其功能基團(tuán)為線型PEG的4倍，能夠攜帶更多的靶向基團(tuán)與藥物分子。文獻(xiàn)報(bào)道[23]，在納米粒表面修飾多個(gè)靶向基團(tuán)能夠顯著增強(qiáng)其受體結(jié)合能力從而提高受體介導(dǎo)的細(xì)胞攝取，因此，該靶向納米結(jié)合物具有更強(qiáng)的細(xì)胞攝取能力與更高的載藥量。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)以生理相容性優(yōu)良的8PEG為載體、水溶性的IR700為光療劑、生物可降解的cRGD為靶頭制備了整合素受體靶向的納米結(jié)合物。cRGD-8PEG-IR700粒徑小且腫瘤穿透性能良好，能夠向腫瘤細(xì)胞特異性地傳遞光療劑，在避光條件下安全無毒，光照后能夠引起腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生足量的ROS從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因此，該聚乙二醇納米結(jié)合物為實(shí)體瘤的靶向PDT提供了一種有前景的藥物傳遞新平臺。