張 凡，田 浤，姚文兵

(中國(guó)藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 江蘇省生物藥物成藥性研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210009)

近年來(lái)，多肽藥物受到廣泛關(guān)注，在抗腫瘤、抗感染、糖尿病治療等領(lǐng)域發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用[1-2]。但是，多肽藥物穩(wěn)定性差、半衰期短、在體內(nèi)易受到蛋白酶水解等缺點(diǎn)限制了其生物學(xué)活性的發(fā)揮，因而導(dǎo)致許多具有生物活性的多肽分子不能作為藥物應(yīng)用于臨床[3-4]。

多肽藥物的體內(nèi)代謝途徑包括蛋白酶水解、受體介導(dǎo)胞吞作用和腎小球?yàn)V過(guò)作用[5-6]。其中蛋白酶水解不僅是影響多肽藥物半衰期的重要因素，也是影響多肽藥物生物學(xué)活性的關(guān)鍵因素之一。如二肽基肽酶4對(duì)胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)具有極強(qiáng)的降解作用，可導(dǎo)致其迅速降解為無(wú)生物學(xué)活性的9～39片段，同時(shí)降解生成的9～39片段是GLP-1受體拮抗劑，使得GLP-1與受體的親和力降至原來(lái)的1%，這種快速降解使天然GLP-1在人體內(nèi)的半衰期僅有約3 min，無(wú)法直接應(yīng)用于臨床[7-9]。因此，尋找多肽類藥物的關(guān)鍵水解酶，有助于闡明多肽藥物體內(nèi)分解代謝過(guò)程，對(duì)多肽藥物的合理設(shè)計(jì)與改造具有重要意義。但是，由于蛋白酶的水解作用涉及范圍廣、蛋白酶種類繁雜、關(guān)鍵制約因素不明確，多肽藥物關(guān)鍵水解酶的分析一直缺少有效的方法[10-13]。

本文選擇體內(nèi)分布廣泛、酶解譜較廣的8種血液蛋白酶作為研究對(duì)象，以高效液相色譜法為基礎(chǔ)，經(jīng)反應(yīng)條件模塊化優(yōu)化，建立多肽藥物關(guān)鍵水解酶體外分析方法。利用本文所建立的方法對(duì)已上市多肽藥物普蘭林肽的關(guān)鍵水解酶進(jìn)行分析，并利用MST技術(shù)進(jìn)行結(jié)果的驗(yàn)證。

1 材 料

1.1 試 劑

人血液8種蛋白酶(表1，美國(guó)R&D Systems公司)；蛋白酶工具底物(南京金斯瑞生物科技有限公司)；普蘭林肽、腦鈉肽(純度>95%，北京藥渡經(jīng)緯信息科技有限公司)；乙腈、三氟乙酸(美國(guó)Sigma公司)；所有試劑均為分析純且可由市售獲得。

1.2 儀 器

高效液相色譜系統(tǒng)，色譜柱XBridge C18(美國(guó)Agilent公司)；Monolith NT.115(德國(guó)NanoTemper公司)。

2 方 法

2.1 多肽藥物關(guān)鍵水解酶體外分析方法的建立

本實(shí)驗(yàn)選擇人體血液中酶解譜較廣、底物較多、覆蓋識(shí)別序列較廣泛的8種蛋白酶，其中囊括內(nèi)切酶與外切酶(見(jiàn)表1)。對(duì)8種蛋白酶反應(yīng)體系的pH及緩沖液進(jìn)行模塊化優(yōu)化。

Table1 Eight proteases in blood with a wide range of enzymatic hydrolysis property and corresponding tool substrates[14]

ECProteaseToolsubstrate3.4.11.2AminopeptidaseN(APN)Enkephalin3.4.17.2CarboxypeptidaseB(CPB)Cholecystokinin83.4.15.1PeptidyldipeptidaseA(ACE)Angiotensin13.4.14.5Dipeptidylpeptidase-4(DPP4)GLP-13.4.24.11Neprilysin(NEP)Enkephalin3.4.24.86Tumornecrosisfactorα-conver-tase(ADAM17)L-selectinprocessingsitepeptideS01.017Kallikrein-relatedpeptidase5(KLK5)S-2288syntheticpeptideS01.132Mannan-bindinglectin-associatedserineprotease3(MASP3)Syntheticpeptide

2.1.1 反應(yīng)體系pH的優(yōu)化 實(shí)驗(yàn)組按說(shuō)明書(shū)中要求的pH及反應(yīng)緩沖液將人源重組蛋白酶與對(duì)應(yīng)的工具底物進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為37 ℃，60 min，反應(yīng)體系為200 μL，底物濃度為20 μmol/L，反應(yīng)完成后，使用等比例1%三氟乙酸溶液終止反應(yīng)，離心后取上清液進(jìn)行HPLC檢測(cè)，將柱子用流動(dòng)相預(yù)平衡10 min，流動(dòng)相A為含0.065% TFA的超純水，流動(dòng)相B為含0.05% TFA的乙腈，通過(guò)梯度洗脫進(jìn)行分離，其中B相百分比在25 min內(nèi)以1 mL/min的流速?gòu)?%線性增加至65%，檢測(cè)波長(zhǎng)為214 nm。對(duì)照組更換反應(yīng)pH為7.8和9.0的對(duì)應(yīng)緩沖體系，按上述條件反應(yīng)后上樣檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。以0 min終止的樣品殘留率為100%，比較實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組中工具底物的殘留率間是否具有顯著性差異，以判斷是否可以優(yōu)化為統(tǒng)一的反應(yīng)條件。

2.1.2 反應(yīng)體系緩沖液的優(yōu)化 將反應(yīng)體系的pH變更為“2.1.1”項(xiàng)中優(yōu)化后的pH，緩沖體系分別使用0.01 mol/L PBS溶液和50 mmol/L Tris溶液(含適當(dāng)強(qiáng)度的金屬離子)，按“2.1.1”項(xiàng)反應(yīng)與檢測(cè)步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.2 方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.1 線性關(guān)系考察 以腦鈉肽(brain natriuretic peptide,BNP)為例，在所建立的方法條件下對(duì)BNP進(jìn)行不同濃度梯度線性考察，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2.2 精密度

批間精密度和準(zhǔn)確度 按上述線性分析方法，改變?nèi)芤簼舛?30，50，70 μmol/L)，每一濃度測(cè)定3個(gè)樣本，按本文所建立的方法與標(biāo)準(zhǔn)曲線同批測(cè)定。計(jì)算每一濃度測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算底物濃度，為c0，配置濃度為c1。準(zhǔn)確度=c1/c0×100%。

中間精密度 按上述線性分析方法，每一濃度測(cè)定3個(gè)樣本，按本文所建立的方法與標(biāo)準(zhǔn)曲線同批測(cè)定，連續(xù)測(cè)定3 d。按照“第1天A人用 A高效液相色譜儀，第2天B人用B高效液相色譜儀，第3天A人用B高效液相色譜儀”的方式進(jìn)行測(cè)定。計(jì)算3種濃度3個(gè)批次樣品的批間RSD。

2.2.3 耐用性 微小改變柱溫(28，30，32 ℃)和流速(0.9，1，1.1 mL/min)，按上述線性分析方法對(duì)樣品進(jìn)行分析，記錄保留時(shí)間。每一濃度測(cè)定3個(gè)樣本，分別測(cè)定每種條件下3個(gè)批次樣品保留時(shí)間的批間RSD。

2.3 普蘭林肽關(guān)鍵水解酶的檢測(cè)

2.3.1 普蘭林肽酶解殘留率的測(cè)定 利用本實(shí)驗(yàn)所建立的方法進(jìn)行普蘭林肽血液酶解殘留率的測(cè)定，通過(guò)比較酶解殘留率的大小進(jìn)行關(guān)鍵水解酶的分析。

2.3.2 普蘭林肽與血液蛋白酶相互作用的檢測(cè) 利用異硫氰酸熒光素對(duì)普蘭林肽進(jìn)行熒光標(biāo)記，并與梯度濃度未標(biāo)記的蛋白酶于37 ℃在黑暗條件下孵育10 min，吸入至Monolith NT.115標(biāo)準(zhǔn)玻璃毛細(xì)管中進(jìn)行分析。在37 ℃下使用20% MST功率進(jìn)行測(cè)量，激光開(kāi)/關(guān)時(shí)間分別為5和20 s，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，使用NanoTemper軟件計(jì)算結(jié)果。

3 結(jié)果與討論

3.1 多肽藥物關(guān)鍵水解酶體外分析方法的建立

由于8種血液蛋白酶均為人源重組蛋白酶，對(duì)反應(yīng)條件的精確度要求較高，而每種蛋白酶的反應(yīng)條件如pH、反應(yīng)緩沖體系各不相同，這不利于整套研究系統(tǒng)的建立，因此本實(shí)驗(yàn)對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。

3.1.1 反應(yīng)體系的pH優(yōu)化 在多肽的酶促反應(yīng)過(guò)程中，體系的pH不僅對(duì)酶促反應(yīng)過(guò)程進(jìn)行調(diào)控，同時(shí)也是影響多肽藥物穩(wěn)定性與活性的重要因素。通過(guò)比較不同pH條件下對(duì)應(yīng)工具底物反應(yīng)完成后的殘留率，完成反應(yīng)pH的優(yōu)化。反應(yīng)體系pH更換后，對(duì)ACE的酶促反應(yīng)影響最大，優(yōu)化前后工具底物殘留率分別為(15.39±1.74)%和(18.34±2.83)%，但兩組間差異不超過(guò)3%，且組間P=0.63，不具有顯著性差異。差異最小的為DDP4，優(yōu)化前后工具底物殘留率分別為(39.29±3.69)%和(37.28±2.84)%，組間P=0.98。其余底物在不同pH條件下與對(duì)應(yīng)蛋白酶反應(yīng)后殘留率如表2所示，組間均不具有顯著性差異。綜上，得到ADAM17最佳pH為9.0，其余7種蛋白酶的最佳pH均可為7.8的統(tǒng)一分析方法。

ProteaseRecommendationpHResidue/%OptimizationpHResidue/%PCPB7.525.42±2.927.825.20±1.800.95DPP48.039.29±3.697.837.28±2.840.98ACE6.515.39±1.747.818.34±2.830.63APN7.023.65±1.687.823.89±2.500.94NEP9.034.85±2.377.836.88±3.150.73KLK58.017.80±1.597.818.07±2.480.93MASP38.557.72±2.777.855.89±3.390.69ADAM179.084.17±1.509.084.25±1.930.97

3.1.2 反應(yīng)體系緩沖液的優(yōu)化 通過(guò)比較不同緩沖液中對(duì)應(yīng)工具底物反應(yīng)完成后的殘留率，完成反應(yīng)緩沖液的優(yōu)化。不同緩沖液中工具底物與對(duì)應(yīng)蛋白酶反應(yīng)殘留率的HPLC檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3，結(jié)果表明除ADAM17在0.01 mol/L PBS緩沖液[殘留率為(26.31±2.33)%，n=3，P=1.47×10-4]中活性迅速降低以外，其余蛋白酶的反應(yīng)緩沖液在更換為0.01 mol/L PBS后工具底物殘留率均無(wú)顯著降低。影響較大的CPB在優(yōu)化前后底物殘留率分別為(25.42±2.92)%和(28.20±1.99)%，兩組間差異不超過(guò)3%，且P達(dá)到0.46，不具有顯著性差異。差異最小的為ADAM17，優(yōu)化前后工具底物殘留率分別為(84.17±1.50)%和(83.91±0.96)%，組間P達(dá)到0.89。由此反應(yīng)緩沖液可優(yōu)化為兩種：0.01 mol/L PBS緩沖液和50 mmol/L Tris緩沖液。

ProteaseRecommendationBufferResidue/%OptimizationBufferResidue/%PCPB25mmol/LTris25.42±2.920.01mol/LPBS28.20±1.990.46DPP425mmol/LTris39.29±3.690.01mol/LPBS41.30±2.390.66ACE50mmol/LTris15.39±1.740.01mol/LPBS13.36±1.600.41APN50mmol/LMES23.65±1.680.01mol/LPBS23.05±2.270.84NEP50mmol/LTris34.85±2.370.01mol/LPBS36.30±2.100.66KLK50.1mol/LNaH2PO417.80±1.590.01mol/LPBS19.68±1.900.47MASP350mmol/LTris57.72±2.770.01mol/LPBS56.45±2.670.75ADAM1750mmol/LTris84.17±1.5050mmol/LTris83.91±0.960.89

3.2 方法學(xué)驗(yàn)證

3.2.1 線性關(guān)系考察 以腦鈉肽(BNP)濃度為橫坐標(biāo)(x,μmol/L)，高效液相信號(hào)峰強(qiáng)度為縱坐標(biāo)(y,mAU)線性回歸，得BNP線性標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=56.31x-328(r=0.998 5)，結(jié)果表明，BNP濃度在10～80 μmol/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.2.2 精密度和準(zhǔn)確度 精密度和準(zhǔn)確度通過(guò)分析已知濃度的參比溶液進(jìn)行3次重復(fù)來(lái)確定，當(dāng)樣品濃度分別為30，50，70 μmol/L時(shí)，批間精密度分別為2.24%，0.77%和1.57%，中間精密度分別為6.68%，1.57%和3.62%，二者均在10%以下，結(jié)果表明該系統(tǒng)對(duì)BNP的定量分析精密度良好，說(shuō)明該系統(tǒng)對(duì)BNP的定量分析準(zhǔn)確。3種濃度BNP溶液測(cè)定的準(zhǔn)確度在98%～100%，證明方法準(zhǔn)確度良好，可進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。

3.2.3 耐用性 分別改變方法的溫度與流速得到耐用性檢測(cè)結(jié)果，30，50，70 μmol/L的3種濃度樣品分別在28 ℃，30 ℃，32 ℃條件下進(jìn)行結(jié)果檢測(cè)，保留時(shí)間的RSD分別為0.23%，0.25%和0.24%，均在1%以下；3種濃度的樣品分別在0.9，1.0，1.1 mL/min條件下檢測(cè)，保留時(shí)間的RSD分別為2.33%，2.36%，2.38%,均在3%以下，表明方法的耐用性良好。

多肽藥物的體外關(guān)鍵水解酶檢測(cè)方法通過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證精確高效，可以用于關(guān)鍵水解酶的測(cè)定。

3.3 普蘭林肽關(guān)鍵水解酶的檢測(cè)

3.3.1 普蘭林肽酶解殘留率的測(cè)定 利用前文建立的多肽藥物關(guān)鍵水解酶體外分析方法對(duì)已上市多肽藥物普蘭林肽進(jìn)行關(guān)鍵水解酶的檢測(cè)(見(jiàn)表4)，其中使普蘭林肽殘留率最低的兩種蛋白酶分別是KLK5與DPP4，其殘留率分別為(41.87±1.72)%及(92.00±0.66)%，低于另外6種蛋白酶，證明利用本研究建立的分析方法能夠得到普蘭林肽的關(guān)鍵水解酶為KLK5及DPP4。

ProteaseResidueofpramlintide/%ACE100.00±0.00APN95.37±0.99KLK541.87±1.72MASP3100.00±0.00NEP94.53±2.08DPP492.00±0.66CPB95.98±1.14ADAM1796.83±0.39

3.3.2 普蘭林肽與血液蛋白酶相互作用的檢測(cè) 本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)普蘭林肽被KLK5及DPP4的水解目前尚未有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，因此，通過(guò)MST進(jìn)一步測(cè)定體系中多肽和蛋白酶之間的結(jié)合現(xiàn)象以驗(yàn)證上述結(jié)果。結(jié)果顯示，普蘭林肽與KLK5和DPP4結(jié)合的Kd小于其他蛋白酶，證明具有較高的親和力(表5)。MST和HPLC測(cè)定結(jié)果一致，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)HPLC篩選獲得的關(guān)鍵水解酶KLK5和DPP4的確對(duì)普蘭林肽有較高親和力。

ProteaseEquilibriumdissociationconstant(Kd,μmol/L)KLK50.04±0.00NEP1.26±0.43ACE7.96±0.68CPB2.29±0.11DPP40.01±0.00APN5.98±0.28MASP31.08±0.36ADAM171.02±0.14

4 結(jié) 論

多肽藥物的酶解穩(wěn)定性考察一直以來(lái)受到學(xué)者廣泛關(guān)注，本實(shí)驗(yàn)基于8種酶解譜廣、分布廣泛的血液蛋白酶，利用高效液相的方法建立了統(tǒng)一的多肽藥物體外關(guān)鍵水解酶分析方法，反應(yīng)條件分別優(yōu)化為pH 7.8或9.0及緩沖溶液為0.01 mol/L PBS或50 mmol/L Tris緩沖液，在不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的前提下，統(tǒng)一復(fù)雜的血液酶酶解反應(yīng)條件。利用此方法得到的普蘭林肽關(guān)鍵水解酶同MST檢測(cè)結(jié)果一致，均為KLK5和DPP4。普蘭林肽是胰淀粉樣類似物，能夠調(diào)節(jié)血糖水平，通過(guò)靜脈注射的體內(nèi)消除半衰期為24～45 min，未來(lái)可基于關(guān)鍵水解酶尋找酶切位點(diǎn)指導(dǎo)普蘭林肽的穩(wěn)定性優(yōu)化，從而延長(zhǎng)其半衰期。因此，本研究所建立的方法能夠?yàn)榕R床前多肽類藥物的高通量穩(wěn)定性篩選提供方法參考與指導(dǎo)。