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(1. 貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/農(nóng)業(yè)生物工程研究院，貴州省農(nóng)業(yè)生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽 550025；2.貴州省山地生態(tài)與農(nóng)業(yè)生物工程2011協(xié)同創(chuàng)新中心，貴陽 550025；3.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴陽 550025； 4.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，貴陽 550006)

圖1 pGM 626-Act1-EuDIR3(A)和pSH 737-35S-EuDIR1(B)載體的T-DNA區(qū)域示意圖

杜仲(EucommiaulmoidesOliver)，杜仲科杜仲屬，為第三紀(jì)孑遺物種，其干燥的葉和樹皮皆可入藥，是我國(guó)特有的傳統(tǒng)中藥材[1-2]。杜仲含有木脂素類、環(huán)烯醚萜類、苯丙素類等有效化學(xué)成分，具有雙向調(diào)節(jié)血壓、降血糖、滋養(yǎng)肝臟、抗菌、強(qiáng)化肌肉和骨骼、抗衰老和抗腫瘤等藥理作用[3-6]。此外，杜仲還是重要的膠源植物，可用于制作優(yōu)良的海底電纜、飛機(jī)輪胎等材料[7-9]。

由于杜仲生長(zhǎng)緩慢[10]，現(xiàn)代生物學(xué)開始利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)來對(duì)天然代謝產(chǎn)物進(jìn)行調(diào)控及生產(chǎn)[11-13]。杜仲愈傷組織誘導(dǎo)過程中，基本培養(yǎng)基有MS、B5、WPM和H等，其中MS培養(yǎng)基使用最多[14-18]。不同培養(yǎng)基對(duì)杜仲愈傷組織的誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)有不同的影響，MS培養(yǎng)基對(duì)杜仲幼莖愈傷組織的誘導(dǎo)效果較好，而B5培養(yǎng)基不僅能增加杜仲葉愈傷組織的誘導(dǎo)率，對(duì)莖和葉愈傷組織的繼代培養(yǎng)也有利[15]。在農(nóng)桿菌介導(dǎo)植物的遺傳轉(zhuǎn)化過程中，提高遺傳轉(zhuǎn)化效率能為后續(xù)遺傳體系的建立、功能基因的表達(dá)調(diào)控等研究提供理論和技術(shù)支持[19]。對(duì)杜仲遺傳轉(zhuǎn)化的研究主要集中在培養(yǎng)基的添加成分和培養(yǎng)時(shí)間等影響因素方面。趙丹等[20]利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法研究卡那霉素濃度、共培養(yǎng)時(shí)間等因素對(duì)杜仲遺傳轉(zhuǎn)化的影響。李巖等[21]首次證明ipt基因能夠增加杜仲不定芽的誘導(dǎo)率。周舒婷等[18]通過優(yōu)化杜仲種子萌發(fā)過程中的種子切割方式、光照強(qiáng)度和轉(zhuǎn)化過程中的激素濃度，提高了杜仲下胚軸遺傳轉(zhuǎn)化效率。杜仲作為木本植物，在遺傳轉(zhuǎn)化過程中，不定芽的分化及生根較為困難，而有關(guān)培養(yǎng)基質(zhì)對(duì)杜仲遺傳轉(zhuǎn)化影響的研究鮮見報(bào)道。杜仲下胚軸作為外植體能夠快速有效的進(jìn)行杜仲愈傷組織分化和植株再生，但在經(jīng)農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化后，其在MS培養(yǎng)基中的分化和生根效率顯著下降[22]。因此，為提高杜仲遺傳轉(zhuǎn)化過程中不定芽的獲得率及生根率，本試驗(yàn)主要就3種不同培養(yǎng)基質(zhì)條件對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化杜仲下胚軸的影響進(jìn)行研究。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用杜仲種子由貴州大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程研究院提供。

根癌農(nóng)桿菌LBA 4404、大腸桿菌(E.coli)株系DH 5α及植物表達(dá)載體pSH 737-35S-EuDIR1和pGM 626-Act1-EuDIR3(圖1)均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

B5、MS和WPM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)PhytoTechnology Laboratories公司；直接PCR擴(kuò)增試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程；PCR所用引物由北京六合華大基因公司合成。

1.2 方 法

1.2.1農(nóng)桿菌介導(dǎo)杜仲遺傳轉(zhuǎn)化

參照周舒婷等[18]的方法培養(yǎng)無菌苗并制備外植體，培養(yǎng)基配制參照趙丹等[20]、chen等[23]的方法，重懸液、共培培養(yǎng)基、篩選培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基各采用3種基質(zhì)配比(MS：4.43 g·L-1；B5：3.21 g·L-1；WPM：2.41 g·L-1)，其中重懸液添加30 g·L-1蔗糖+3μmol·L-16-BA+3μmol·L-12-IP+20 mg·L-1As(pH=5.2)；共培培養(yǎng)基添加30 g·L-1蔗糖+3μmol·L-16-BA+3μmol·L-12-IP+20 mg·L-1As+2.4 g·L-1植物凝膠(pH=5.2)；篩選培養(yǎng)基添加30 g·L-1蔗糖+3μmol·L-16-BA+3μmol·L-12-IP+100 mg·L-1Tim+0.25 mg·L-1草銨膦(或25 mg·L-1卡那霉素)+2.4 g·L-1植物凝膠(pH=5.8)；生根培養(yǎng)基添加30 g·L-1蔗糖+1μmol·L-1NAA+100 mg·L-1Tim+0.25 mg·L-1草銨膦(或25 mg·L-1卡那霉素)+2.4 g·L-1植物凝膠(pH=5.8)。

表1 3種培養(yǎng)基中不定芽誘導(dǎo)情況

培養(yǎng)基轉(zhuǎn)化質(zhì)粒平均外植體數(shù)/個(gè)愈傷組織生長(zhǎng)情況平均出芽數(shù)/個(gè)平均出芽率/%B5A189多數(shù)長(zhǎng)勢(shì)良好,生長(zhǎng)旺盛,色澤鮮艷呈綠色,質(zhì)地緊密脆嫩4020.99±0.25B240多數(shù)生長(zhǎng)良好,呈黃綠色,質(zhì)地緊密,少數(shù)枯死218.60±0.37MSA173多數(shù)呈黃綠色,部分或泛白或泛黃或泛褐1710.00±0.61B274生長(zhǎng)較慢,色澤暗淡,部分泛褐,有的甚至枯死155.35±0.20WPMA161多數(shù)生長(zhǎng)緩慢,部分色澤暗或泛黃或泛白或泛褐,生長(zhǎng)不良且質(zhì)地疏松,大部分不長(zhǎng)愈傷,有的甚至枯死74.33±0.31B214呈黃綠色透明狀,少數(shù)枯死,或泛白或泛黃或泛褐83.76±0.75

注：A代表pGM 626-Act1-EuDIR3；B代表pSH 737-35S-EuDIR1。

注：不同字母表示差異顯著(p<0.05)。圖2 3種培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)化不同質(zhì)粒的外植體出芽率情況

將外植體分別置于含質(zhì)粒pGM 626-Act1-EuDIR3或pSH 737-35S-EuDIR1的3種農(nóng)桿菌浸染液中浸染3 min，用無菌紙吸干浸染液，分別緊密排布于對(duì)應(yīng)共培培養(yǎng)基上，28 ℃暗培3 d后分別轉(zhuǎn)入至各篩選培養(yǎng)基中。每2周更換1次培養(yǎng)基，10 d左右外植體周圍長(zhǎng)出愈傷組織，隨后分化出不定芽，每2周更換1次培養(yǎng)基，統(tǒng)計(jì)外植體和不定芽數(shù)量，并計(jì)算出芽率。每種條件設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

出芽率(%)=(不定芽數(shù)/接種的外植體數(shù))×100%。

1.2.2陽性芽的鑒定

GUS染色參照J(rèn)efferson[24]方法進(jìn)行。將篩選出的杜仲不定芽葉片浸在GUS染液中，37 ℃反應(yīng)8～10 h，取出葉片放入75%乙醇中脫色12 h，然后通過實(shí)體顯微鏡觀察外植體染色情況。同時(shí)對(duì)獲得的所有不定芽進(jìn)行直接PCR檢測(cè)，擴(kuò)增載體上的部分GUS基因，篩選出陽性芽。用于轉(zhuǎn)基因陽性芽檢測(cè)的PCR引物分別為F：5’-GGTGATTGATGAAACTGCTG-3’和R：5’-GAACATTACATTGACGCAGG-3’。PCR擴(kuò)增體系20μL，擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃ 3 min；94 ℃ 1 min，57 ℃ 1 min，60 ℃ 2 min，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳，由凝膠成像系統(tǒng)拍照統(tǒng)計(jì)篩選出的轉(zhuǎn)基因陽性芽數(shù)量，并計(jì)算陽性芽數(shù)與不定芽數(shù)比值。

1.2.3陽性芽的生根培養(yǎng)

待上述陽性芽長(zhǎng)度到達(dá)2 cm以上，將其從外植體上切下放入3種對(duì)應(yīng)的生根培養(yǎng)基中，統(tǒng)計(jì)生根數(shù)并計(jì)算生根率。

注：WT：野生型；TP：轉(zhuǎn)基因型；M：DL 2000 Marker；-：陰性對(duì)照；+：陽性對(duì)照；1～3：轉(zhuǎn)基因陽性芽。圖3 部分轉(zhuǎn)基因陽性芽的GUS染色檢測(cè)(A)及直接PCR檢測(cè)(B)

生根率(%)=(生根的陽性芽數(shù)/陽性芽數(shù))×100%。

1.2.4數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用Microsoft office Excel 2003軟件及DPS 7.05軟件進(jìn)行處理和分析，用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 杜仲不定芽再生

以杜仲下胚軸為外植體，B5、MS和WPM為培養(yǎng)基，選用2種不同載體(分別包含35S啟動(dòng)子和卡那霉素篩選標(biāo)記以及Act1啟動(dòng)子和草銨膦篩選標(biāo)記)進(jìn)行杜仲遺傳轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)入2種質(zhì)粒的愈傷組織在B5培養(yǎng)基上長(zhǎng)勢(shì)較好，色澤鮮綠或呈黃綠色，出芽數(shù)較多；而在WPM培養(yǎng)基上生長(zhǎng)緩慢，色澤暗淡或呈黃綠色透明狀，甚至枯死，出芽數(shù)較少；在MS培養(yǎng)基上的外植體生長(zhǎng)情況則介于上述2種培養(yǎng)基之間。此外，3種培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的出芽率差異顯著，在添加了細(xì)胞分裂素6-BA(3μmol·L-1)條件下，B5培養(yǎng)基中出芽率最高，為(14.79±6.20)%，而在MS和WPM培養(yǎng)基中出芽率分別為(7.68±2.37)%和(4.05±0.64)%。3種培養(yǎng)基中不定芽的誘導(dǎo)情況見表1和圖2。

2.2 轉(zhuǎn)基因陽性芽鑒定

通過GUS基因組織染色法和PCR檢測(cè)對(duì)不定芽進(jìn)行鑒定(見圖3)，表明已經(jīng)獲得轉(zhuǎn)基因陽性芽，在抗生素草銨膦(0.25 mg·L-1)或卡那霉素(25 mg·L-1)篩選壓力下，陽性芽數(shù)均占不定芽總數(shù)80%以上(見表2)，表明本研究所用的遺傳轉(zhuǎn)化體系較高效，此外，B5培養(yǎng)基上的比值在90%以上，說明B5培養(yǎng)基適合不定芽的誘導(dǎo)和再生培養(yǎng)。

表2 3種培養(yǎng)基中陽性芽獲得情況

培養(yǎng)基轉(zhuǎn)化質(zhì)粒平均出芽數(shù)/個(gè)平均陽性芽數(shù)/個(gè)平均(陽性芽數(shù)/出芽數(shù))/%B5A403794.16±0.81B211990.26±0.77MSA171586.67±1.17B151284.13±2.94WPMA7685.52±1.71B8787.04±2.62

注：A代表pGM 626-Act1-EuDIR3；B代表pSH 737-35S-EuDIR1。

2.3 3種培養(yǎng)基對(duì)陽性芽生根影響

本研究發(fā)現(xiàn)，3種培養(yǎng)基對(duì)杜仲遺傳轉(zhuǎn)化的生根率具有不同的影響。在添加相同生長(zhǎng)素NAA(1μmol·L-1)和抗生素條件下，通過對(duì)陽性芽進(jìn)行生根誘導(dǎo)培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)3種培養(yǎng)基中的生根率存在差異，B5培養(yǎng)基適于不定芽誘導(dǎo)，但卻不利于生根，WPM培養(yǎng)基上的生根率達(dá)到53.85%，遠(yuǎn)高于另外2種培養(yǎng)基。3種培養(yǎng)基對(duì)杜仲陽性芽生根的誘導(dǎo)情況見表3。

表3 3種培養(yǎng)基中陽性芽生根情況

培養(yǎng)基總陽性芽數(shù)/個(gè)總生根數(shù)/個(gè)總生根率/%B516863.57MS8200WPM392153.85

3 討 論

杜仲是我國(guó)特有的名貴樹種，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。作為木本植物，杜仲遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立比較困難，導(dǎo)致杜仲功能基因的研究相對(duì)滯后。影響杜仲遺傳轉(zhuǎn)化的因素主要有篩選壓、激素濃度、菌液濃度、浸染時(shí)間和共培養(yǎng)時(shí)間等，提高轉(zhuǎn)基因幼苗的再生率可以獲得更高的轉(zhuǎn)化效率[20]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)種子切割方式、光照強(qiáng)度、共培養(yǎng)時(shí)間和轉(zhuǎn)化過程中的激素濃度等條件進(jìn)行優(yōu)化，可以提高杜仲遺傳轉(zhuǎn)化效率，現(xiàn)已初步建立了一套杜仲遺傳轉(zhuǎn)化體系[18,20]，然而在遺傳轉(zhuǎn)化過程中，愈傷組織再生的不定芽數(shù)量仍較少，且難以生根，嚴(yán)重降低了遺傳轉(zhuǎn)化效率。夏啟中等研究指出，不同培養(yǎng)基質(zhì)在杜仲離體培養(yǎng)過程中對(duì)愈傷組織的分化和再生有不同的影響[14]，由此推測(cè)培養(yǎng)基質(zhì)對(duì)杜仲遺傳轉(zhuǎn)化同樣具有較大影響。植物組織培養(yǎng)過程中的基本培養(yǎng)基有B5、MS、WPM、H和White等[15]，其中，B5培養(yǎng)基中的銨鹽濃度較低[25]，利于提高遺傳轉(zhuǎn)化過程中愈傷組織的誘導(dǎo)率和分化率；WPM為低鹽培養(yǎng)基，其培養(yǎng)基中的硝態(tài)氮和氨態(tài)氮比值相對(duì)較高[26]，利于陽性芽根原基的形成及發(fā)育；而MS培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)元素種類齊全且比例合適，屬于富集元素平衡培養(yǎng)基，對(duì)根和芽的誘導(dǎo)效果適中[16,27]，目前是杜仲組織培養(yǎng)過程中最常用的培養(yǎng)基。本研究發(fā)現(xiàn)，3種基質(zhì)中，B5培養(yǎng)基的確可以促進(jìn)杜仲不定芽再生，獲得較高的出芽率，而相較于另外2種培養(yǎng)基，WPM培養(yǎng)基則具有明顯的生根優(yōu)勢(shì)。本研究通過篩選基本培養(yǎng)基來對(duì)杜仲遺傳轉(zhuǎn)化幼苗再生體系進(jìn)行改良，確定了以B5培養(yǎng)基(含3μmol·L-16-BA和3μmol·L-12-IP)促進(jìn)不定芽再生以及WPM培養(yǎng)基(含1μmol·L-1NAA)誘導(dǎo)生根的聯(lián)合使用條件對(duì)杜仲遺傳轉(zhuǎn)化的外植體進(jìn)行培養(yǎng)，從而有效地提高了杜仲遺傳轉(zhuǎn)化幼苗數(shù)量，進(jìn)一步為后續(xù)杜仲功能基因的研究提供轉(zhuǎn)基因材料。

本研究在對(duì)杜仲進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)，采用2種含不同啟動(dòng)子和篩選標(biāo)記的表達(dá)載體，以期檢測(cè)培養(yǎng)基質(zhì)的適用性。研究發(fā)現(xiàn)，2種載體雖然在不定芽的誘導(dǎo)上存在數(shù)量差異，但其在不同培養(yǎng)基質(zhì)中有一致的生長(zhǎng)趨勢(shì)，由此認(rèn)為本研究所獲得的優(yōu)化體系對(duì)不同載體均可適用。實(shí)驗(yàn)中不定芽誘導(dǎo)數(shù)量上存在的差異可能是由于卡那霉素相較于草銨膦對(duì)不定芽的誘導(dǎo)有更明顯的抑制作用。因此，在構(gòu)建杜仲遺傳轉(zhuǎn)化載體時(shí)，宜選擇含草銨膦篩選標(biāo)記的載體。綜上所述，本研究對(duì)杜仲轉(zhuǎn)基因再生體系進(jìn)行了優(yōu)化，進(jìn)一步保證了轉(zhuǎn)基因杜仲幼苗的獲得率及存活率，為后續(xù)杜仲功能基因的研究提供了技術(shù)支持。